具有光協(xié)同抗菌作用納米銀復(fù)合材料的制備

劉天宇，徐 麗，錢澤丹，沈穎欣，龐千粵，盧晴風(fēng)，劉 意1,*

（1.廣東藥科大學(xué) 藥學(xué)院，廣東 廣州 510006；2.廣東藥科大學(xué) 醫(yī)藥化工學(xué)院，廣東 中山 528458）

細(xì)菌在環(huán)境中普遍存在，目前最有效的治療細(xì)菌感染的方法是使用抗生素；然而抗生素的使用不可避免地導(dǎo)致耐藥菌株出現(xiàn)，如耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）和耐萬古霉素金黃色葡萄球菌［1］。在過去的幾十年里，抗生素耐藥基因的出現(xiàn)［2］，導(dǎo)致危及生命的感染增加，已經(jīng)成為嚴(yán)重的公共衛(wèi)生負(fù)擔(dān)，因此，迫切需要找到一種抗生素替代品［3］。

目前，已經(jīng)報道了多種能替代抗生素的材料［如金屬離子、銀納米顆粒（AgNPs）［4］、金屬氧化物納米顆粒［5］、石墨烯、納米碳和季銨化合物［6］］，這些新材料可以降低或抑制細(xì)菌的活力。作為廣譜抗菌劑［7］的AgNPs已獲得美國食品藥品管理局批準(zhǔn)并廣泛應(yīng)用于抗菌敷料領(lǐng)域［8］。雖然AgNPs可以達(dá)到令人滿意的抗菌效果，但一些含銀敷料或軟膏由于銀離子的突量釋放具有極高的生物毒性［9］，因此，控制銀離子的釋放量成了含AgNPs抗菌劑需要克服的主要問題［10］。另外，因AgNPs常規(guī)情況下呈現(xiàn)易于聚集的趨勢，導(dǎo)致抗菌性能降低［11］。為解決這些問題，有必要為AgNPs找到合適的表面鈍化或支持材料，在保持其抗菌活性的同時具有更好的生物相容性［12］。

光協(xié)同抗菌材料也是當(dāng)前研究的一大熱點(diǎn)，使用對可見光響應(yīng)的光敏劑，可以從周圍的分子氧中產(chǎn)生活性氧（ROS），起到抗菌的作用［13］。經(jīng)典的光敏劑包括四吡咯、酞菁、吩噻嗪、亞甲基藍(lán)等，但它們存在低水溶性、較差分散性、復(fù)雜的合成路線和低生物相容性等缺點(diǎn)，限制了在臨床上的應(yīng)用。

碳量子點(diǎn)（CQDs）在可見光區(qū)域內(nèi)有響應(yīng)，具有用作光敏劑的潛力，同時，基于CQDs的納米復(fù)合材料在抗菌方面也具有優(yōu)勢。CQDs是一種新型的無金屬熒光納米粒子，具有合成簡單、毒性低、生物相容性好、易于表面修飾［14］等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于成像、傳感、催化等領(lǐng)域［15-18］。CQDs也被作為抗菌劑研究。一方面由于CQDs表面所帶電荷不同，對不同種類細(xì)菌表現(xiàn)出不同的抗菌效果，帶正電的CQDs誘導(dǎo)內(nèi)源性ROS的能力明顯高于帶負(fù)電的CQDs。摻雜其他元素的CQDs對細(xì)菌具有生長抑制作用，可能是由于高正電荷破壞了細(xì)菌膜［19］；另一方面，CQDs的殺菌活性還取決于它們的表面化學(xué)基團(tuán)和尺寸。本工作利用CQDs的特性，采用原位法制備AgNPs@硫氮摻雜碳量子點(diǎn)（S,N-CQDs）復(fù)合材料，試圖實(shí)現(xiàn)AgNPs與S,N-CQDs良好的光協(xié)同抗菌作用，并解決傳統(tǒng)銀離子抗菌劑的生物毒性，提高生物相容性，擴(kuò)大納米銀基復(fù)合材料的應(yīng)用范圍。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要試劑

檸檬酸（CA），β-巰基乙胺，硝酸銀：均為分析純，上海麥克林生化科技有限公司。營養(yǎng)瓊脂，溶菌肉湯培養(yǎng)基（LB），沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基，馬鈴薯葡萄糖瓊脂：廣東環(huán)凱微生物科技公司。金黃色葡萄球菌，大腸桿菌，MRSA，白色念珠菌：廣東文睿生物有限公司。

1.2 試樣制備

1.2.1 S,N-CQDs的制備

將0.600 g CA和0.195 g β-巰基乙胺溶于10 mL純水中，然后轉(zhuǎn)移到50 mL聚四氟乙烯中，將其置于不銹鋼反應(yīng)器加熱至150 ℃，反應(yīng)3 h。反應(yīng)結(jié)束后冷卻至室溫，形成棕黃色溶液，在透析袋（截留相對分子質(zhì)量1 000）中透析24 h，每4 h換一次水，將透析液冷凍干燥得到固體，即S,N-CQDs。

1.2.2 AgNPs@S,N-CQDs的制備

稱取定量S,N-CQDs溶于去離子水中，質(zhì)量濃度為1 mg/mL，共100 mL；稱取質(zhì)量濃度為20 mg/mL的硝酸銀溶液，在磁力攪拌條件下，向S,NCQDs溶液中加入5 mL硝酸銀溶液。連續(xù)攪拌48 h后，得到淡黃色溶液。透析48 h除去未反應(yīng)的銀離子，在此期間每6 h換一次水。所得溶液經(jīng)過濾、冷凍、干燥，得到淡黃色AgNPs@S,N-CQDs顆粒。

1.3 測試與表征

納米顆粒的結(jié)構(gòu)采用日本島津制作所的UV-2600型紫外-可見分光光度計檢測，200～800 nm紫外吸收光譜。傅里葉變換紅外光譜（FTIR）采用日本島津制作所的IR Affinity-1型傅里葉變換紅外光譜儀測試，波數(shù)為500～4 000 cm-1。納米顆粒形貌和粒徑采用日本株式會社日立制作所的H-7650型高分辨透射電子顯微鏡觀察。

1.4 抗菌性能測試

1.4.1 最小抑菌濃度（MIC）檢測

實(shí)驗(yàn)前，固體培養(yǎng)基上的細(xì)菌，包括金黃色葡萄球菌、MRSA和大腸桿菌，在液體LB中培養(yǎng)24 h，白色念珠菌在沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h。在無菌96孔板中，每孔加入100 μL LB，在第一孔加入100 μL一定濃度的S,N-CQDs或AgNPs@S,N-CQDs復(fù)合材料，混合均勻后吸取100 μL至第二孔中，重復(fù)此步驟至最后一孔，棄去第十二號孔吸取的100 μL，各孔加入100 μL濃度為2×105CFU/mL的菌懸液。MIC通過濁度法測量，對應(yīng)無渾濁孔的CQDs或AgNPs@S,N-CQDs復(fù)合材料的濃度即為MIC值。所有實(shí)驗(yàn)平行測三次。

1.4.2 光協(xié)同抑菌率檢測

將S,N-CQDs和AgNPs@S,N-CQDs復(fù)合材料與不同種類細(xì)菌在不同濃度下共培養(yǎng)后，采用420 nm光源改變光照功率和光照時間，進(jìn)行抑菌率測試實(shí)驗(yàn)。以MRSA為例進(jìn)行實(shí)驗(yàn)：進(jìn)行抑菌率平板實(shí)驗(yàn)前，將固體培養(yǎng)基上的MRSA在LB中培養(yǎng)24 h；然后將AgNPs@S,N-CQDs復(fù)合材料或S,NCQDs與細(xì)菌混合，使最終系統(tǒng)中的細(xì)菌濃度保持在1×105CFU/mL，AgNPs@S,N-CQDs復(fù)合材料或S,N-CQDs的質(zhì)量濃度為0.050 mg/mL，平板涂布，利用420 nm光源采用6 W或15 W光照0，1，2，3，4 min，在37 ℃恒溫孵育箱中培養(yǎng)24 h，統(tǒng)計各平板的菌落數(shù)，按式（1）計算抑菌率。然后固定15 W光照功率和3 min光照時間，改變AgNPs@S,N-CQDs或S,N-CQDs濃度，使最終系統(tǒng)中的細(xì)菌濃度保持在1×105CFU/mL，試樣質(zhì)量濃度為0.010，0.025，0.050，0.100，0.200，0.400，0.800 mg/mL，在37 ℃恒溫孵育箱中培養(yǎng)24 h，試樣組為AgNPs@S,NCQDs復(fù)合材料或S,N-CQDs，對照組為與試樣組等量的LB，統(tǒng)計各平板菌落數(shù)，并計算抑菌率。

1.5 溶血實(shí)驗(yàn)

將定量2%（w）血細(xì)胞以5 000 r/min的速率離心5 min，棄去上清液，收集血細(xì)胞，加入定量滅菌磷酸緩沖鹽溶液（PBS），重懸后同樣條件離心，重復(fù)三次，將血細(xì)胞分散在含有AgNPs@S,N-CQDs或S,N-CQDs的PBS緩沖溶液中，最終體系中血細(xì)胞質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%，AgNPs@S,N-CQDs或S,N-CQDs濃度為0.010，0.025，0.050，0.100，0.200，0.400，0.800 mg/mL，陰性對照組為同體積PBS緩沖溶液，陽性對照組為同體積的高濃度AgNPs@S,N-CQDs水溶液，在37 ℃恒溫水浴鍋孵育2 h。最后，將血細(xì)胞在5 000 r/min離心5 min，測定上層清液在波長540 nm處的吸光度，按式（2）計算溶血率。

式中：OD540（試樣）為試樣在540 nm處的吸光度；OD540（陰性對照）為陰性對照組在540 nm處的吸光度；OD540（陽性對照）為陽性對照組在540 nm處的吸光度。

2 結(jié)果與討論

2.1 AgNPs@S,N-CQDs復(fù)合材料的表征

從圖1可以看出：S,N-CQDs在230～250 nm及350 nm處有紫外特征吸收肩峰，歸因于C=O的n-π*躍遷，AgNPs@S,N-CQDs在400 nm處存在紫外吸收峰，當(dāng)AgNPs存在時會在400 nm左右產(chǎn)生紫外特征吸收峰，說明AgNPs@S,N-CQDs已成功合成。從圖1還可以看出：3 000～3 500 cm-1的寬吸收帶是由于O—H和N—H的拉伸振動，表明S,NCQDs表面有許多氨基和羥基，說明S,N-CQDs和AgNPs@S,N-CQDs具有良好的親水性；而2 600 cm-1處的吸收峰歸因于巰基，1 726 cm-1處的吸收峰歸因于C=O的拉伸振動，說明AgNPs與S,NCQDs中含氧官能團(tuán)（即—COOH）存在相互作用，是通過形成化學(xué)鍵或靜電吸引來實(shí)現(xiàn)的，1 380 cm-1處的吸收峰歸因于S=O的拉伸振動，AgNPs@S,N-CQDs在此處的峰變尖銳，說明S=O的斷裂，結(jié)合1 654 cm-1處出現(xiàn)的峰，說明AgNPs負(fù)載在S,N-CQDs上。

圖1 S,N-CQDs和AgNPs@S,N-CQDs的紫外吸收光譜和FTIRFig.1 UV absorption spectra and FTIR spectra of S,N-CQDs and AgNPs@S,N-CQDs

2.2 高分辨透射電子顯微鏡（HRTEM）觀察

從圖2可以看出：AgNPs被包裹在S,N-CQDs之間，分散性良好，顆粒呈類球形，粒徑均一，平均粒徑為5 nm；0.238 nm晶格間距是Ag的（111）特征晶格間距，表明成功合成了AgNPs@S,NCQDs復(fù)合材料。

圖2 AgNPs@S,N-CQDs復(fù)合材料的HRTEM照片F(xiàn)ig.2 HRTEM image of AgNPs@S,N-CQDs

2.3 抗菌性能

從表1可以看出：S,N-CQDs同樣具有廣譜抗菌性能，對革蘭氏陽性菌（金黃色葡萄球菌）、陰性菌（大腸桿菌）、耐藥菌（MRSA）、真菌（白色念珠菌）的代表性菌種都能起到抗菌作用；與S,NCQDs相比，由于引入AgNPs@S,N-CQDs的MIC值較低，說明AgNPs@S,N-CQDs的抗菌性能明顯強(qiáng)于S,N-CQDs，表明AgNPs@S,N-CQDs在抗菌性能方面優(yōu)勢明顯。

表1 AgNPs@S,N-CQDs及S,N-CQDs針對不同種細(xì)菌的MIC值Tab.1 MIC values of AgNPs@S,N-CQDs and S,N-CQDs against different kinds of bacteria mg/mL

2.4 光協(xié)同抑菌

從圖3可以看出：光照條件下，對照組抑菌率隨著光照時間或光照功率的增加而增大，單獨(dú)光照情況下同樣可以產(chǎn)生一定程度的抑菌作用。與對照組相比，由于S,N-CQDs本身具有抗菌性能，故在光照時其抑菌率較高；AgNPs@S,N-CQDs在光照時表現(xiàn)出較對照組和S,N-CQDs更好的抗菌性能，隨著光照時間和光照功率的增加，抗菌效果也越來越明顯。

圖3 不同光照功率和時間下S,N-CQDs與AgNPs@S,N-CQDs對MRSA的抑菌率Fig.3 Inhibition rate of AgNPs@S,N-CQDs against MRSA under different light time and different light intensity

從圖4可以看出：在15 W光照功率和3 min光照時間條件下，通過計算抑菌率已接近80%，表現(xiàn)出優(yōu)異的光協(xié)同抗菌作用。在固定光照時間和光照功率條件下，改變AgNPs@S,N-CQDs或S,NCQDs濃度，抑菌率也隨之改變。從圖5可以看出：在0.050 mg/mL AgNPs@S,N-CQDs存在條件下，光照功率和光照時間固定時，抑菌率已接近80%，菌落數(shù)明顯減少，能有效抑制MRSA的生長，說明在該光源激發(fā)情況下，AgNPs@S,N-CQDs有較強(qiáng)的光協(xié)同抗菌作用。

圖4 不同濃度AgNPs@S,N-CQDs條件下采用15 W光照3 min平板實(shí)驗(yàn)圖片F(xiàn)ig.4 Plate pictures about different concentrations of AgNPs@S,N-CQDs with 15 W light for 3 min

圖5 不同濃度AgNPs@S,N-CQDs條件下采用15 W光照3 min的抑菌率Fig.5 Inhibition rate of different concentrations of AgNPs@S,N-CQDs with 15 W light for 3 min

2.5 溶血實(shí)驗(yàn)

將血細(xì)胞與不同濃度的AgNPs@S,N-CQDs或S,N-CQDs培養(yǎng)2 h后，從圖6和圖7可以看出：陽性對照組呈現(xiàn)明顯的溶血現(xiàn)象。當(dāng)AgNPs@S,NCQDs質(zhì)量濃度低于0.200 mg/mL時，溶血率低于5%，即便當(dāng)AgNPs@S,N-CQDs質(zhì)量濃度為0.400 mg/mL時，也無誘導(dǎo)溶血現(xiàn)象，因此AgNPs@S,NCQDs的生物相容性良好。

圖6 不同濃度AgNPs@S,N-CQDs的溶血圖像Fig.6 Hemolysis images of AgNPs@S,N-CQDs on red blood cell with different concentrations

圖7 不同濃度AgNPs@S,N-CQDs的溶血率Fig.7 Hemolysis ratio of AgNPs@S,N-CQDs on red blood cell with different concentrations

3 結(jié)論

a）采用原位法制備了AgNPs@S,N-CQDs復(fù)合材料，復(fù)合材料中AgNPs呈類球形，分散均勻，平均粒徑5 nm。

b）AgNPs@S,N-CQDs復(fù)合材料具有良好的抗菌性能及廣譜抗菌特性，在光照刺激下具有光協(xié)同抗菌作用。當(dāng)復(fù)合材料質(zhì)量濃度為0.050 mg/mL，波長為420 nm，光照功率為15 W，光照時間為3 min時，對MRSA的抑菌率可達(dá)80%，能有效抑制MRSA的生長。

c）當(dāng)AgNPs@S,N-CQDs復(fù)合材料質(zhì)量濃度為0.400 mg/mL時，也幾乎不會誘導(dǎo)溶血，說明其具有良好的生物相容性。