基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜法在嬰幼兒食品蠟樣芽胞桿菌檢測中的應(yīng)用

楊純佳，蔣 軒，張 娟，黃翠莉

廣東省食品生物危害因素監(jiān)測工程技術(shù)研究中心，廣東產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗研究院，廣東佛山 528300

0 引言

蠟樣芽胞桿菌（Bacillus cereus）是芽胞桿菌屬中的一種，為革蘭氏陽性菌，廣泛存在于周圍環(huán)境中[1，2]，可引起食物中毒，通常表現(xiàn)為腹瀉、嘔吐[3～5]。蠟樣芽胞桿菌在嬰幼兒配方奶粉、輔食及生產(chǎn)加工多環(huán)節(jié)中均有不同程度的檢出[6，7]，引起的嬰兒腹瀉在我國也時常發(fā)生[8]。各地政府雖然對嬰幼兒食品進(jìn)行了重點監(jiān)管，但我國國家標(biāo)準(zhǔn)對嬰兒食品中蠟樣芽胞桿菌并沒有限量要求，嬰幼兒屬于免疫力低下群體，稍有不慎，即存在感染風(fēng)險，因此，對其的檢測和限量非常有必要。

目前蠟樣芽胞桿菌的檢測方法還是以傳統(tǒng)的生化培養(yǎng)法為主，操作復(fù)雜，檢測時間長。雖然分子生物學(xué)等檢測技術(shù)也在不斷完善[9，10]，但其成本較高，對人員專業(yè)能力也要求高，無法實現(xiàn)大規(guī)模普及。而基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜法作為一種新型的技術(shù)，具有快速、準(zhǔn)確、高通量、低成本等特點，在諸多領(lǐng)域已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用[11，12]?；|(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜法是基于微生物蛋白質(zhì)的一種鑒定方法，將純化的菌種均勻涂抹于靶板上，滴加基質(zhì)液，干燥后，通過一脈沖激光的照射，基質(zhì)吸收高能量而爆炸，通過樣品鏈發(fā)生離子化的過程，采集質(zhì)譜圖與數(shù)據(jù)庫中標(biāo)準(zhǔn)圖譜進(jìn)行比對分析得出鑒定結(jié)果[13]。本文以基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜法為主要檢測技術(shù)，對比國標(biāo)法、VITEK 2 Compact和實時熒光PCR法的結(jié)果，對三類嬰幼兒食品（包括嬰幼兒配方食品、較大嬰兒和幼兒配方食品、嬰幼兒谷類輔助食品）中蠟樣芽胞桿菌的污染情況進(jìn)行調(diào)查研究，為乳品企業(yè)提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

通過各大超市、母嬰用品店以及網(wǎng)購采集了560 份嬰幼兒食品，包括82 份嬰幼兒配方食品、168 份較大嬰兒和幼兒配方食品以及310 份嬰幼兒谷類輔助食品。

1.2 材料與設(shè)備

甘露醇卵黃多黏菌素（MYP）瓊脂、胰酪胨大豆多黏菌素肉湯、營養(yǎng)瓊脂、動力培養(yǎng)基、酪蛋白瓊脂、硫酸錳營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、蠟樣芽胞桿菌生化鑒定試劑盒等，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

Premix Taq DNA聚合酶，日本TaKaRa公司；食品基因組提取試劑盒、細(xì)菌基因組提取試劑盒，Omega Bio-Tek公司；引物和探針，上海生工生物公司。

AutofMS1000質(zhì)譜鑒定儀，鄭州安圖生物有限公司；GHP-9160 隔水式恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；VITEK 2 Compact全自動微生物鑒定分析儀，法國生物梅里埃公司；AC2-6S1生物安全柜，美國ESCO 公司；QuantStudio 7 Flex 熒光PCR儀，美國Thermo 公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 前處理方法

按照GB 4789.14—2014[14]中第一法的檢測流程進(jìn)行檢驗。無菌條件下取25 g樣品，加入盛有225 mL磷酸鹽緩沖液的均質(zhì)袋中，拍打混勻，作為1∶10的樣品勻液，制備10倍系列稀釋樣品勻液，選擇2～3 個適宜的稀釋度，每個稀釋度分別吸取0.3 mL，0.3 mL，0.4 mL勻液涂布于MYP瓊脂平板上，（30±1）℃培養(yǎng)24～48 h，對典型菌落進(jìn)行確認(rèn)和計數(shù)。

1.3.2 鑒定方法

（1）國標(biāo)法

挑取典型菌落，按照GB 4789.14—2014[14]中4.3對典型菌落進(jìn)行染色鏡檢、過氧化氫酶試驗、動力試驗、硝酸鹽還原試驗、酪蛋白分解試驗、溶菌酶耐性試驗、卵黃反應(yīng)、V-P 試驗、葡萄糖利用（厭氧）試驗、甘露醇產(chǎn)酸、根狀生長試驗、溶血試驗和蛋白質(zhì)毒素結(jié)晶試驗。

（2）基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜法

挑取典型菌落進(jìn)行分離純化后使用直涂法上機(jī)檢測，取適量純化后單菌落均勻涂布于靶板上，加入1 μL基質(zhì)溶液，晾干。將靶板放入質(zhì)譜儀進(jìn)行鑒定?；|(zhì)液配制：20∶19∶1（50%乙腈+47.5%水+2.5%三氟乙酸）比例配制，充分溶解（超聲）溶質(zhì)（α-腈基-4-羥基肉桂酸，HCCA），制成過飽和溶液。

（3）VITEK 2 Compact 檢測方法

挑取典型菌落于TSA培養(yǎng)基上分離純化，將分離的單菌落用無菌棉簽擦拭于0.45%無菌生理鹽水中充分混勻制成菌懸液，將此菌懸液調(diào)至1.8～2.2麥?zhǔn)媳葷岫?，用BCL鑒定卡上機(jī)，鑒定結(jié)果需補(bǔ)充根狀生長試驗和蛋白質(zhì)毒素結(jié)晶試驗。

（4）實時熒光PCR法檢測蠟樣芽胞桿菌

參照SN/T 3932—2014[15]進(jìn)行檢測。取3.4.1中的增菌液用商品化細(xì)菌基因提取試劑盒進(jìn)行DNA提取。熒光PCR檢測按標(biāo)準(zhǔn)要求操作，根據(jù)樣品Ct值報告檢測結(jié)果。

2 結(jié)果與討論

2.1 嬰幼兒食品中蠟樣芽胞桿菌的污染狀況

嬰幼兒配方食品和較大嬰兒和幼兒配方食品的檢出率分別為14.63%和15.48%，嬰幼兒谷類輔助食品檢出率為7.74%，嬰幼兒食品中蠟樣芽胞桿菌的總檢出率為11.07%。其中檢測結(jié)果大于100 CFU/g的總共有8 份（表1）。嬰幼兒配方食品以及較大嬰兒和幼兒配方食品的污染率相比嬰幼兒谷類輔助食品較高，這種情況可能與生產(chǎn)加工環(huán)節(jié)有關(guān)。谷類輔助食品在生產(chǎn)加工過程中有高溫加熱環(huán)節(jié)，使滅菌更為徹底，故污染率較低[16]。對于污染較為嚴(yán)重的產(chǎn)品類別應(yīng)加大對生產(chǎn)加工環(huán)節(jié)進(jìn)行監(jiān)管。

表1 嬰幼兒食品中蠟樣芽胞桿菌的檢出情況

2.2 四種檢測方法在嬰幼兒食品中蠟樣芽胞桿菌的檢測情況

本次檢測采用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜法、國標(biāo)法、VITEK 2 Compact 檢測方法和實時熒光PCR法對可疑蠟樣芽胞桿菌進(jìn)行鑒定。對560份樣品的檢測，結(jié)果顯示四種檢測方法的定性結(jié)果一致，結(jié)果見表2，對比發(fā)現(xiàn)，基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜法準(zhǔn)確度高、耗時短、高通量、成本低、靈敏度高，可用于應(yīng)對突發(fā)事件的快速篩查。

表2 四種鑒定方法的比較

3 結(jié)論

3.1 本研究比較了4 種蠟樣芽胞桿菌的檢測方法，結(jié)果發(fā)現(xiàn)基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜法具有高通量、靈敏度高、準(zhǔn)確度高、操作簡單等優(yōu)勢，鑒定結(jié)果只需要幾分鐘，較大地縮短了菌種的鑒定時間，適用于嬰幼兒食品中蠟樣芽胞桿菌初篩和快速檢測。

3.2 市售嬰幼兒食品中存在蠟樣芽胞桿菌的污染，具有一定的食品安全風(fēng)險，應(yīng)引起警惕。預(yù)防和控制蠟樣芽胞桿菌感染的關(guān)鍵是從原料、生產(chǎn)環(huán)節(jié)、生產(chǎn)環(huán)境等多個方面嚴(yán)格把關(guān)加大對企業(yè)生產(chǎn)的監(jiān)管力度，同時，由于蠟樣芽胞桿菌的芽胞具有強(qiáng)大的抵抗力，繁殖較快，建議有關(guān)部門考慮在國家安全標(biāo)準(zhǔn)中增加嬰幼兒配方食品中蠟樣芽胞桿菌的限量要求，保障嬰幼兒食品的食用安全性。