基于新國標(biāo)的兩種微生物法測定乳粉中葉酸的比對研究

嚴(yán)家俊，姚麗鋒，綦 艷，張 娟，黃翠莉，吳思敏

1 廣東產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，廣東佛山 528300 2 拱北海關(guān)技術(shù)中心，廣東珠海 519015

0 引言

葉酸是一種由對氨基苯甲酸、蝶呤和谷氨酸組成的B族維生素[1]。為維持人體正常生理功能所必需。然而，人體自身無法合成葉酸，需通過外部攝取補(bǔ)充。缺乏葉酸會(huì)導(dǎo)致人類疾病，如神經(jīng)管畸形、先天性心臟病、兒童哮喘等[2，3]。但是過量攝入葉酸也會(huì)引起一些并發(fā)癥，如干擾抗驚厥藥物發(fā)揮作用和機(jī)體對鋅的吸收、掩蓋VB12缺乏的初期表現(xiàn)、神經(jīng)發(fā)育毒性等[4，5]。

乳粉作為嬰幼兒早期營養(yǎng)攝入的主要來源，對其質(zhì)量控制及其重要。我國即將施行的標(biāo)準(zhǔn)《GB 10765—2021食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)嬰兒配方食品》《GB 10766—2021食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)較大嬰兒配方食品》《GB 10767—2021 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)幼兒配方食品》均對葉酸的添加量進(jìn)行了更嚴(yán)格的規(guī)定，嬰兒食品中葉酸限量由2.5～12 μg/kJ更新為2.9～12 μg/kJ，幼兒食品中葉酸限量由不小于1 μg/kJ更新為2.4～12 μg/kJ。因此，對嬰幼兒乳粉中葉酸含量的檢測具有重大的意義。

目前葉酸的測定方法主要有化學(xué)發(fā)光法[6]、紫外吸收光譜法[7]、熒光分析法[8]、高效液相色譜法[9]、酶聯(lián)免疫法（ELISA）[10]、伏安法[11]和微生物法[12，13]等。其中微生物法是經(jīng)典的葉酸測定方法，能反映樣品中總?cè)~酸含量[14]。作為食品中葉酸含量檢測的國標(biāo)指定方法，《GB 5009.211—2022 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中葉酸的測定》已于2022年6月發(fā)布更新，并將于2022年12月實(shí)施，新標(biāo)準(zhǔn)依舊將微生物法作為食品中葉酸測定的唯一方法。與2014版的標(biāo)準(zhǔn)相比，新標(biāo)準(zhǔn)增加了微孔板測定方法。本研究通過對即將實(shí)施的標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.211—2022中試管法和微孔板法檢測乳粉中葉酸進(jìn)行比較，根據(jù)數(shù)據(jù)的差異與試驗(yàn)情況比對兩種方法的優(yōu)缺點(diǎn)，為乳粉中葉酸含量測定以及新標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)施提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

葉酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥97%）；氫氧化鈉乙醇溶液（0.01 moL/L）；鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus Caseispp. RhamnosusATCC 7469）；菌種儲(chǔ)備用瓊脂培養(yǎng)基；葉酸測定用培養(yǎng)基。

1.2 儀器與設(shè)備

XGI.D型真空滅菌器，山東新華醫(yī)療器械股份有限公司；ZQZY-CS8V振蕩培養(yǎng)箱，上海知楚儀器有限公司；5804R高速冷凍離心機(jī)，德國艾本德股份公司；ML204萬分之一電子天平，梅特勒-托利多國際有限公司；UV-1900分光光度計(jì)，島津企業(yè)管理（中國）有限公司；Vortex-Genie 2渦旋混合器，美國Scientific Industries。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)工作液的制備

準(zhǔn)確稱取一定量的葉酸標(biāo)準(zhǔn)品，用氫氧化鈉乙醇溶液逐步稀釋至0.200 ng/mL，制成標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3.2 接種液的制備

將鼠李糖乳桿菌連續(xù)轉(zhuǎn)種3 代后，接種至菌種儲(chǔ)備用瓊脂培養(yǎng)基中，36 ℃培養(yǎng)24 h。取2 mL葉酸標(biāo)準(zhǔn)工作液與4 mL葉酸測定用培養(yǎng)基混勻，分裝至2 支試管中，高壓滅菌制成種子培養(yǎng)液。將活化后的菌株轉(zhuǎn)接與種子培養(yǎng)液中，36 ℃培養(yǎng)24 h后，吸取0.5 mL至無菌葉酸測定用培養(yǎng)基中，36 ℃培養(yǎng)6 h，制成接種液。

1.3.3 樣液的制備

準(zhǔn)確稱取1.000 g樣品，精確至0.001 g，加入80.000 mL氫氧化鈉乙醇溶液，超聲振蕩2～4 h后，轉(zhuǎn)入100.000 mL容量瓶中，用水定容，搖勻。再用水進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂尅?/p>

1.3.4 試管法

（1）試樣系列管

取試管，分別加入1.000 mL、2.000 mL、3.000 mL試樣稀釋液，補(bǔ)水至5.000 mL。每梯度做2 個(gè)平行。

（2）標(biāo)準(zhǔn)系列管

取試管分別加入葉酸標(biāo)準(zhǔn)工作液，補(bǔ)水至5.000 mL，使標(biāo)準(zhǔn)系列管中葉酸含量分別為0.000 ng、0.050 ng、0.100 ng、0.200 ng、0.300 ng、0.400 ng、0.500 ng、0.600 ng、0.800 ng、1.000 ng。每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)做3 個(gè)平行。

（3）滅菌、接種與培養(yǎng)

將測定系列管、葉酸測定培養(yǎng)基于121 ℃滅菌5 min，冷卻至室溫后，加入一定量的接種液至葉酸培養(yǎng)基中，使其接種液濃度為4‰，5.000 mL每管分裝于每支測定管中，另取一支標(biāo)準(zhǔn)0管加入葉酸測定培養(yǎng)基作為0對照管?；靹蚝?，置于36 ℃培養(yǎng)20～40 h，直至獲最大濁度。

（4）測定

使用混勻振蕩器將培養(yǎng)好的試管混勻，于540 nm處，以0對照管調(diào)節(jié)吸光度值為0，依次測定各試管培養(yǎng)液。

1.3.5 微孔板法

（1）試樣系列管

使用0.22 μm無菌水相濾膜過濾除菌試樣稀釋液，取1.500 mL離心管，分別加入100 μL、200 μL、300 μL試樣稀釋液，補(bǔ)水至500 μL。每梯度做2 個(gè)平行。

（2）標(biāo)準(zhǔn)系列管

按1.3.4（2）中制備方式，體積按比例縮減至1.0 mL。無菌條件下，使用0.22 μm無菌水相濾膜過濾除菌至1.500 mL離心管中。每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)做3 個(gè)平行。

（3）滅菌、接種與培養(yǎng)

葉酸測定培養(yǎng)基于121 ℃滅菌5 min，冷卻至室溫后，加入一定量的接種液至葉酸培養(yǎng)基中，使其接種液濃度為4‰，吸取150 μL加入微孔板中。另吸取150 μL標(biāo)準(zhǔn)系列管或試樣系列管加入微孔板中，覆膜，混勻，置于36 ℃培養(yǎng)32～40 h。

（4）測定

混勻微孔板中培養(yǎng)物，于540 nm處測定吸光度值。

1.3.6 計(jì)算

以標(biāo)準(zhǔn)系列管中葉酸的含量為橫坐標(biāo)，各個(gè)標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)吸光度值的平均值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線換算試樣系列管中葉酸的相應(yīng)含量，以此計(jì)算樣品中葉酸的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 準(zhǔn)確度試驗(yàn)

以SRM 1869乳基標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)做為樣品，分別使用兩種方法獨(dú)立重復(fù)測定6 次，計(jì)算結(jié)果的與真值的符合程度和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（Relative tandard Deviation，RSD），以此衡量兩種方法的準(zhǔn)確度。結(jié)果如表1所示。

表1 試管法與微孔板法測定SRM 1869 中葉酸含量的比較

由SRM 1869說明書可知，該樣品中葉酸含量為（223.9±8.6）μg/100g，2 種方法所測結(jié)果都與標(biāo)示值相符，滿足要求，方法的準(zhǔn)確性良好。兩種方法的RSD分別為2.7%和2.9%，無明顯差異。

2.2 重復(fù)性試驗(yàn)

隨機(jī)選取5 種不同的乳粉作為試驗(yàn)樣品，使用兩種方法分別對每個(gè)樣品進(jìn)行6 次重復(fù)性試驗(yàn)，觀察測量結(jié)果之間的一致性，結(jié)果如表2、表3所示。

表2 試管法的重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

從表2結(jié)果可知，利用試管法檢測的5 種不同品牌的乳粉中葉酸含量，每個(gè)樣品的6 個(gè)測定結(jié)果較接近，RSD值為1.3%～3.1%，說明方法重復(fù)性較好；從表3結(jié)果可知，利用微孔板法檢測的5 種不同品牌的乳粉中葉酸含量，每個(gè)樣品的6 個(gè)測定結(jié)果較接近，RSD值為1.6%～2.9%，說明方法重復(fù)性同樣較好。

表 3 微孔板法的重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論與討論

從試驗(yàn)結(jié)果比較可知，兩種方法檢測結(jié)果都與乳基標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)1869證書中葉酸標(biāo)示值相符，方法的準(zhǔn)確性良好，且無明顯差異。重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果可知，利用GB 5009.211—2022試管法檢測葉酸含量，試驗(yàn)結(jié)果之間一致性較好，RSD值為1.3%～3.1%。利用GB 5009.211—2022微孔板法檢測葉酸含量，試驗(yàn)結(jié)果之間一致性同樣較好，RSD值為1.6%～2.9%。兩種方法均能有效檢測乳粉中葉酸含量。

比較兩種方法的差異。在制備方面，試管法的樣液和標(biāo)液使用高壓滅菌鍋滅菌。微孔板法使用無菌水相濾膜對樣液和標(biāo)液進(jìn)行過濾除菌?？紤]到在進(jìn)行大批量樣品的測定時(shí)，試管法需要用到大量試管，滅菌時(shí)占用的空間較大，一般滅菌鍋無法滿足同時(shí)滅菌的需求，需要用到大容量或多個(gè)滅菌鍋進(jìn)行滅菌。而微孔板法只需使用濾膜進(jìn)行過濾滅菌，相對而言，效率更高。且使用濾膜過濾滅菌可以一定程度去除背景混濁，使試驗(yàn)結(jié)果更穩(wěn)定。培養(yǎng)方面，相對于試管法，微孔板將培養(yǎng)物置于微孔板中，體積縮小，占用空間更小，可于一個(gè)培養(yǎng)箱中進(jìn)行大量樣品的培養(yǎng)。測定方面，試管法將各管用振蕩器混勻后，使用比色杯逐個(gè)管進(jìn)行測定，需要耗費(fèi)大量的時(shí)間。而微孔板直接將整板混勻后，置于酶標(biāo)儀中測定，測定時(shí)間更加快速。故建議在進(jìn)行大批量樣品的測定時(shí)，優(yōu)先選用微孔板法進(jìn)行試驗(yàn)。在試驗(yàn)成本方面，試管法每管需加入5 mL葉酸測定培養(yǎng)基，且對試管的需求量大且要求較高。微孔板法每孔只需150 μL培養(yǎng)基，微孔板為一次性耗材且每板可加96 個(gè)培養(yǎng)物，成本更低。

本研究通過對新標(biāo)準(zhǔn)兩種微生物法檢測乳粉中葉酸含量結(jié)果的準(zhǔn)確度與重復(fù)性進(jìn)行比較，兩種方法的準(zhǔn)確度和重復(fù)性都較好。相對于試管法，微孔板法效率更高，成本更低，適用于大批量樣品的檢測需求。