血清SIRT1表達對丙戊酸鈉治療癲癇患者療效的影響 Δ

楊艷萍 ，何蝶 ，周振 ， ，曾慶繁 ，彭紅英 ，趙立新 ，馬丹 （.貴州醫(yī)科大學附屬白云醫(yī)院藥劑科，貴陽 00；.貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院藥劑科，貴陽 000；.貴州醫(yī)科大學附屬白云醫(yī)院麻醉科，貴陽 00；.貴州醫(yī)科大學附屬白云醫(yī)院腎內(nèi)科，貴陽 00；.貴州醫(yī)科大學附屬白云醫(yī)院中醫(yī)科，貴陽 00；.貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院血液內(nèi)科，貴陽 000）

癲癇是一種常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，全球約5 000萬人患有癲癇，其發(fā)病率在神經(jīng)科疾病中僅次于頭痛，臨床上治療較為困難，且很難根治[1―4]。丙戊酸鈉（sodium valproate，VPA）已被廣泛用于癲癇的長期治療[5]，主要作用機制是阻斷持續(xù)和快速的鈉電流，限制神經(jīng)元高頻重復放電[3，6]。VPA用于癲癇失神發(fā)作、臨床抑郁癥、強直-陣攣性癲癇、青少年肌陣攣性癲癇和復雜部分性癲癇的臨床療效較好[7―8]。在臨床實踐中發(fā)現(xiàn)，部分癲癇患者VPA血藥濃度雖然在有效范圍內(nèi)，但無臨床療效，其原因尚未明確。

有研究發(fā)現(xiàn)，持續(xù)的癲癇發(fā)作會導致線粒體功能障礙，這可能是癲癇發(fā)作引起腦損傷的關鍵因素[9]。Sirtuin-1（SIRT1）是一種依賴于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸激活的去乙酰化酶，可參與衰老、能量代謝、炎癥和腫瘤等多種生理病理過程[10]。SIRT1在癲癇狀態(tài)下能發(fā)揮內(nèi)源性神經(jīng)保護作用，抵消癲癇持續(xù)狀態(tài)后癲癇發(fā)作誘導的神經(jīng)元細胞損傷，并在癲癇持續(xù)狀態(tài)下增強大鼠海馬體中的表達和活性[11―12]。有研究表明，SIRT1對細胞內(nèi)的代謝應激信號敏感，在癲癇發(fā)生早期迅速上調(diào)，且癲癇患者和動物腦組織中的SIRT1表達和活性增加與難治性癲癇發(fā)生密切相關[13―14]。因此，SIRT1的高表達可能導致藥物控制癲癇發(fā)作效果不佳。VPA治療癲癇的有效血藥濃度為50～100 μg/mL，VPA＜50 μg/mL視為無效濃度，VPA＞100 μg/mL視為中毒濃度[15]，而SIRT1高表達癲癇患者的VPA血藥濃度的有效范圍有待研究。有研究表明，人腦組織中的SIRT1和血清中的SIRT1表達相關聯(lián)[16]。因此，本研究探討了血清SIRT1表達對VPA治療癲癇患者療效的影響，以期為臨床合理用藥提供參考。

1 材料與資料

1.1 主要儀器與試劑

DA-1型干式熒光免疫分析儀、FY-06型試劑卡孵育器、VPA檢測試劑盒（批號FFS092T）均購自北京丹大生物技術有限公司；Research?plus型手動移液器、吸頭及離心管均購自德國Eppendorf公司；Pico17型高速離心機購自美國Thermo Fisher Scientific公司；WiseMix VM-10型渦旋振蕩器購自韓國Daihan公司；BIOG RNA提取試劑盒（批號202011Q610001）購自常州百代生物科技股份有限公司；全自動生化分析儀購自瑞士Roche公司。主要試劑包括無水乙醇、異丙醇、氯仿、無酶無菌水等。

1.2 臨床資料

選擇2021年3－10月貴州醫(yī)科大學附屬白云醫(yī)院（以下簡稱“我院”）就診、出院后單獨口服VPA治療的54例癲癇患者（包括有過癲癇史或有明確癲癇誘因的癲癇患者）為研究對象，患者年齡19～88歲，男42例、女12例。另同期選擇我院體檢中心50例體檢健康者作為基線參考樣本，年齡18～89歲，男31例、女19例。本研究的納入標準為：（1）年齡≥18歲；（2）入院診斷為癲癇，診斷標準參考《臨床診療指南·癲癇病分冊（2015修訂版）》[5]；（3）出院后單獨口服VPA。本研究的排除標準為：（1）伴有其他惡性疾病者，如惡性腫瘤、白血?。唬?）肝功能不全者；（3）同時服用其他抗癲癇藥物或采用其他手段治療癲癇者。本研究方案已獲得我院醫(yī)學倫理委員會審核批準，批件號：2022倫審第（8）號。所有患者均知情同意，并簽署了知情同意書。

2 方法

2.1 血清RNA的提取

試驗前準備BIOG RNA提取試劑盒中的洗滌液A和洗滌液B。取血清樣本和RNA載體置于無RNA酶的EP管中混勻，加入裂解液和消化液混合均勻，然后于56 ℃水浴10 min至完全裂解，再加入無水乙醇，混勻。將吸附柱置于收集管中，取上述溶液轉(zhuǎn)入吸附柱內(nèi)，靜置2 min，以12 000 r/min 4 ℃離心1 min（下同），棄收集管內(nèi)廢液。剩余溶液轉(zhuǎn)移至吸附柱內(nèi)，靜置2 min，離心，棄收集管內(nèi)廢液。吸附柱放回收集管內(nèi)，加洗滌液A至吸附柱內(nèi)，離心，棄收集管內(nèi)廢液。吸附柱放回收集管內(nèi)，加洗滌液B至吸附柱內(nèi)，離心，棄收集管內(nèi)廢液。將吸附柱放回收集管內(nèi)，離心，棄殘留的洗滌液。取出吸附柱，放入新的無RNA酶的離心管內(nèi)，再加入洗脫液，靜置3 min，離心，收集RNA溶液，于－80 ℃冰箱保存，待檢測。

2.2 血清SIRT1 mRNA相對表達水平的檢測

采用實時熒光定量PCR檢測。提取血清RNA后，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板，擴增產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳，反應后分析基因擴增的循環(huán)閾值（Ct值）。SIRT1引物序列（5′→3′）：上游引物TGATTGGCACAGATCCTCGAA，下游引物AAGTCTACAGCAAGGCGAGC；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）引物序列（5′→3′）：上游引物TGTGTCCGTCGTGGATCTGA，下游引物CCTGCTTCACCACCTTCTTGA。實時熒光定量PCR反應條件：95 ℃ 3 min預變性，然后按95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40次循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，以2－ΔΔCt計算SIRT1 mRNA的相對表達水平。

2.3 分組與給藥

以SIRT1 mRNA相對表達水平低于基線的癲癇患者作為SIRT1低表達治療組，高于基線的癲癇患者作為SIRT1高表達治療組。

根據(jù)患者實際使用藥品情況，本研究中患者使用的VPA包括本院開具的和患者院外自帶藥品，經(jīng)統(tǒng)計分別來自湖南省湘中制藥有限公司（本院藥品）、山東方明藥業(yè)股份有限公司（院外自帶）、山東仁和制藥有限公司（院外自帶）。通過查閱有關文獻，上述3種VPA均符合一致性評價，臨床療效無明顯差異[17]。根據(jù)藥品說明書內(nèi)容，3種VPA的用藥方案一致。因此本研究的給藥方案為：SIRT1低、高表達組患者出院后，參照藥品說明書，口服低劑量VPA（12 mg/kg或每日約600 mg）治療，用藥后分別作為SIRT1低表達治療組和SIRT1高表達治療組；并于用藥1周后監(jiān)測兩組患者的血藥濃度，調(diào)整VPA血藥濃度在有效范圍內(nèi)。治療3個月后，所有患者回院復查VPA血藥濃度，評價治療3個月的臨床療效（臨床療效評價標準見“2.5”項下）。若患者臨床療效為無效，則增加VPA劑量至15 mg/kg或每日約800 mg，此部分患者作為SIRT1低表達加量組和SIRT1高表達加量組。繼續(xù)治療3個月后，加量組患者回院復查VPA血藥濃度，評價其增加劑量治療3個月的臨床療效。

2.4 血藥濃度檢測

患者出院后對口服低劑量VPA治療3個月、治療3個月后癲癇控制無效增加藥物劑量再治療3個月的癲癇患者進行血藥濃度檢測?；颊叱鲈汉?，口服VPA，每3個月復查1次，血液樣本采集后，于室溫條件下24 h內(nèi)完成檢測；若樣本在24 h內(nèi)不能及時檢測，其在4 ℃冷藏保存不可超過7 d，－20 ℃以下冷凍保存不可超過1個月；樣本檢測前需要恢復至室溫，冷凍保存的樣本需要完全融化、復溫、混合均勻后使用（切忌反復凍融）。采用干式熒光免疫分析儀監(jiān)測患者的血藥濃度。血液樣本離心后，取10 μL血清，加入VPA檢測試劑盒充分混勻得稀釋液，取80 μL稀釋液加入試劑卡中孵育15 min，檢測血藥濃度。VPA檢測結果的參考區(qū)間參考文獻[15]。

2.5 臨床療效評價

患者出院后對口服低劑量VPA治療3個月、治療3個月后癲癇控制無效增加藥物劑量再治療3個月的癲癇患者進行臨床療效評價。3個月內(nèi)癲癇完全控制或發(fā)作次數(shù)減少＞75%視為顯效，發(fā)作次數(shù)減少50%～75%視為有效，發(fā)作次數(shù)減少25%～＜50%視為療效差，發(fā)作次數(shù)減少＜25%或發(fā)作加重視為無效[18]。有效控制率（%）＝（顯效例數(shù)+有效例數(shù)）/總例數(shù)×100%，無效控制率（%）＝（療效差例數(shù)+無效例數(shù)）/總例數(shù)×100%?？傆行Э刂坡剩?）＝[（顯效例數(shù)+有效例數(shù)）治療組+（顯效例數(shù)+有效例數(shù)）加量組]/總例數(shù)×100%。

2.6 肝功能指標檢測

采用全自動生化分析儀檢測治療前、口服低劑量VPA治療3個月、治療3個月后癲癇控制無效增加藥物劑量再治療3個月的癲癇患者的肝功能。丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）的參考范圍為 10.00～35.00 U/L，天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）的參考范圍為8.00～40.00 U/L，總膽紅素（total bilirubin，TBIL）的參考范圍為1.70～21.00 μmol/L。

2.7 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 18.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料以±s表示，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗。檢驗水準α＝0.05。

3 結果

3.1 癲癇患者治療前SIRT1 mRNA相對表達水平檢測結果

治療前，54例患者中有31例患者的SIRT1 mRNA相對表達水平低于基線值，有23例患者高于基線值。與健康者SIRT1表達組相比，SIRT1低表達治療組治療前SIRT1 mRNA相對表達水平顯著降低，SIRT1高表達治療組顯著增加，結果見圖1。

圖1 癲癇患者治療前SIRT1 mRNA相對表達水平比較（±s）

3.2 SIRT1高、低表達癲癇患者治療后各時間點血藥濃度監(jiān)測結果

低劑量VPA治療3個月、治療3個月后癲癇控制無效增加藥物劑量再治療3個月后，全部患者的血藥濃度均在50～100 μg/mL之間，表明血藥濃度始終在有效濃度范圍內(nèi)。其中，低劑量VPA治療3個月后的血藥濃度檢測結果顯示，SIRT1低表達治療組與SIRT1高表達治療組患者的血藥濃度比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。治療3個月后癲癇控制無效增加藥物劑量再治療3個月的血藥濃度檢測結果顯示，SIRT1高表達加量組患者的血藥濃度平均值為（84.15±4.24） μg/mL，顯著高于 SIRT1高表達治療組（64.40±3.40） μg/mL（P＜0.05）。結果見圖2。

圖2 SIRT1高、低表達癲癇患者治療后各時間點血藥濃度監(jiān)測結果比較（±s）

3.3 SIRT1高、低表達癲癇患者治療后各時間點臨床療效評價結果

在VPA有效血藥濃度范圍內(nèi)，癲癇患者給予低劑量VPA治療3個月后，31例SIRT1低表達治療組患者中有26得到有效控制，5例控制無效；23例SIRT1高表達治療組患者有10例得到有效控制，13例控制無效，SIRT1高表達治療組患者癲癇有效控制率明顯低于SIRT1低表達治療組（P＜0.05）。治療3個月后癲癇控制無效的患者增加藥物劑量再治療3個月，其中5例SIRT1低表達加量組患者有3例被有效控制，13例SIRT1高表達加量組患者有9例被有效控制，SIRT1高表達加量組患者癲癇有效控制率顯著高于SIRT1高表達治療組（P＜0.05）。治療6個月后，31例SIRT1低表達組患者最終有29例患者得到有效控制，23例SIRT1高表達組患者19例得到有效控制。結果見表1。

表1 SIRT1高、低表達癲癇患者治療后各時間點臨床療效監(jiān)測結果

3.4 SIRT1高、低表達癲癇患者治療前后各時間點肝功能指標檢測結果

對癲癇患者治療前后各時間點的肝功能指標進行檢測，結果見表2。如表2所示，隨著血藥濃度的增加，癲癇患者肝功能指標水平均在參考范圍內(nèi)。

表2 SIRT1高、低表達癲癇患者治療前、后各時間點肝功能指標檢測結果（±s）

表2 SIRT1高、低表達癲癇患者治療前、后各時間點肝功能指標檢測結果（±s）

組別SIRT1低表達組（治療前）SIRT1低表達治療組SIRT1低表達加量組SIRT1高表達組（治療前）SIRT1高表達治療組SIRT1高表達加量組n 31 31 5 23 23 10 ALT/（U/L）16.39±0.12 21.23±0.54 24.58±0.25 16.98±0.27 19.58±0.29 19.49±0.31 AST/（U/L）21.53±0.34 25.67±0.32 26.72±0.28 18.36±0.33 21.11±0.32 23.30±0.41 TBIL/（μmol/L）8.76±0.15 9.84±0.67 11.02±0.18 10.70±0.22 9.67±0.18 10.77±0.21

4 討論

研究顯示，VPA血藥濃度在50～100 μg/mL范圍內(nèi)時，癲癇控制效果好，VPA＜50 μg/mL表明癲癇控制效果較差，VPA＞100 μg/mL將增加VPA的藥物不良反應[15]。本研究以臨床入院診斷為癲癇、出院后口服單藥VPA的患者為研究對象，探討了血清SIRT1表達對VPA治療癲癇患者療效的影響。結果顯示，低劑量VPA治療后，患者的血藥濃度在最小有效濃度（50 μg/mL）之上，增加VPA劑量后，SIRT1高表達患者的血藥濃度在80～100 μg/mL之間，也在VPA最小中毒濃度（100 μg/mL）之下。本研究同時監(jiān)測了低劑量VPA治療3個月、治療3個月后癲癇控制無效增加藥物劑量再治療3個月的患者癲癇控制率，結果顯示，在VPA血藥濃度50～70 mg/L有效濃度范圍內(nèi)，與SIRT1低表達治療組患者比較，SIRT1高表達治療組患者的控制癲癇發(fā)作效果不佳；增加VPA劑量后，患者血藥濃度在80～100 mg/L有效濃度范圍內(nèi)，與SIRT1高表達治療組患者比較，SIRT1高表達加量組患者的控制癲癇發(fā)作效果更佳。

VPA是治療癲癇的常用藥物[19]，但由于該藥的治療窗較窄，個體化給藥差異較大，以肝毒性尤為嚴重[20]，故在患者使用VPA期間，應密切監(jiān)測其血藥濃度，并定期進行肝功能指標檢測，以降低藥物不良反應的發(fā)生風險[21―22]。本研究對癲癇患者血藥濃度和肝功能指標進行監(jiān)測，結果表明，隨著血藥濃度增加，肝功能指標水平上升，雖差異無統(tǒng)計學意義，但考慮到癲癇是一種慢性、復發(fā)性和進行性神經(jīng)系統(tǒng)疾病，需長期治療，因此更應關注患者肝功能變化，對需終身服藥患者建議增加保肝藥物。

研究顯示，SIRT1與癲癇發(fā)生存在密切聯(lián)系，其中SIRT1的表達和活性上調(diào)可能在難治性癲癇發(fā)病機制中起重要作用[14]。大鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)下海馬體中SIRT1的表達和活性增強[11]，因此推測癲癇患者在口服VPA治療中，SIRT1的表達可能會影響VPA治療癲癇的效果。盡管已知SIRT1通路可通過調(diào)節(jié)過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子1α參與線粒體生物發(fā)生[23―24]，但目前尚無關于SIRT1影響癲癇的報道。本研究結果表明，在常規(guī)VPA血藥濃度范圍內(nèi)治療癲癇時，與SIRT1低表達治療組癲癇患者比較，SIRT1高表達治療組患者控制癲癇發(fā)作效果不佳，推測SIRT1高表達很有可能與癲癇難治有關。

綜上所述，在VPA有效血藥濃度范圍內(nèi)治療癲癇，血清SIRT1高表達患者的癲癇可能更難控制；增加VPA劑量后，可提高癲癇發(fā)作的有效控制率。本文為揭示SIRT1對癲癇發(fā)作和癲癇治療的影響提供了一定的研究基礎。由于癲癇是一個極其復雜的生理病理過程，且本文臨床樣本量較少，后期SIRT1低表達加量組臨床樣本量更少，組間比較存在一定的局限性，為更好地控制癲癇發(fā)作，本課題組下一步將增加臨床樣本量，探索SIRT1在癲癇中的作用機制。