金匱腎氣丸對多囊卵巢綜合征模型大鼠的改善作用及機(jī)制研究 Δ

馬麗亞 ，杜婧雯 ，張童 ，俎兆軒 ，郭申 ，趙紳 ，張明昊 （1.河南中醫(yī)藥大學(xué)教務(wù)處，鄭州 450008；.河南中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)院，鄭州 450046）

多囊卵巢綜合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）是以月經(jīng)失調(diào)、慢性無排卵、雄激素升高及卵巢多囊樣改變?yōu)橹饕憩F(xiàn)的一種婦科疾病，常伴發(fā)生殖功能障礙、胰島素抵抗等代謝異常癥狀，亦可增加心血管疾病、子宮內(nèi)膜癌的患病風(fēng)險(xiǎn)[1]。目前，西醫(yī)治療多以激素替代、調(diào)經(jīng)及促排卵為主，患者妊娠率低，且可出現(xiàn)子宮異常出血、胃腸道不適、肝功能損害及肥胖等多種副作用[2―3]。中醫(yī)將 PCOS 歸為“不孕癥”“閉經(jīng)”“月經(jīng)過少”“月經(jīng)后期”“癥瘕”范疇，認(rèn)為其病機(jī)是腎虛，繼發(fā)肝瘀、脾虛、痰飲、水濕互結(jié)[4―5]，故應(yīng)從補(bǔ)益脾腎入手進(jìn)行治療[6]。金匱腎氣丸始載于《金匱要略》，乃“千古補(bǔ)腎之組方”，其對婦科疾病的治療論述最早見于《婦人雜病脈證并治第二十二》，具有溫補(bǔ)腎陽、化氣行水的功效，且已有治療PCOS的臨床報(bào)道[7]，但此方面實(shí)驗(yàn)研究較少，作用機(jī)制亦不明確。目前，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，金匱腎氣丸可改善糖尿病模型大鼠胰島素抵抗[8]，其中肝激酶B1（liver kinase B1，LKB1）/腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）信號通路與胰島素抵抗密切相關(guān)[9]，但是金匱腎氣丸是否可通過LKB1/AMPK信號通路改善POCS尚不明確?；诖?，本研究選擇炔雌醇環(huán)丙孕酮片(商品名為達(dá)英-35，以下簡稱“達(dá)英-35”）聯(lián)合二甲雙胍為陽性對照藥物[9―10]，探討金匱腎氣丸對胰島素抵抗、性激素水平、卵巢病理形態(tài)變化及LKB1/AMPK信號通路的影響，以期為金匱腎氣丸治療PCOS提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有BS110S型電子天平（北京塞多利斯天平公司）、MR-96TB型酶標(biāo)儀[騁克儀器（上海）有限公司]、RM2235石蠟切片機(jī)（德國Leica公司）、D3024R型臺式高速冷凍型微量離心機(jī)[大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器（北京）股份有限公司]、CX23型光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司）、Stepone plus型熒光定量PCR儀（美國ABI公司）。

1.2 主要藥品與試劑

金匱腎氣丸購自北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司制藥廠（批號19032632，規(guī)格0.2 g/粒）；達(dá)英-35購自德國拜耳醫(yī)藥保健有限公司（批號KT062FL2，規(guī)格0.2 mg/片）；鹽酸二甲雙胍片購自上海壽如松藥業(yè)泌陽制藥有限公司（批號20031702，規(guī)格0.25 g/片）；來曲唑購自上海麥克林生化科技有限公司（批號C12785740）；羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司（批號20160704）；蘇木素染色液、伊紅染色液均購自福州飛凈生物科技有限公司（批號分別為190805、20211009）；葡萄糖、胰島素、雌二醇（estrogen，E2）、睪酮（testosterone，T）、促性腺激素釋放激素（gonadotropinreleasing hormone，GnRH）、促卵泡素（follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH）、促黃體生成素（luteinizing hormone，LH）的酶聯(lián)免疫吸附檢測（ELISA）試劑盒均購自南京建成生物工程研究所（批號分別為F006-1-1、H203-1-2、H102-1、H090-1-2、H297、H101-1-2、H206-1-2）；兔 SP 試劑盒、DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司（批號分別為SP-9001、ZLI-9018）；兔抗大鼠LKB1抗體、兔抗大鼠AMPK抗體、TriQuick總RNA提取試劑、cDNA合成試劑盒均購自武漢賽維爾生物科技有限公司（批號分別為GB111236、GB111919、R1100、G3330）。

1.3 動物

本研究所用動物為健康SD雌性大鼠，8周齡，體質(zhì)量180～200 g，購自鄭州市惠濟(jì)區(qū)華興實(shí)驗(yàn)動物養(yǎng)殖場，動物生產(chǎn)許可證號為SCXK（豫）2019-0002。所有大鼠分籠飼養(yǎng)于河南中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)機(jī)能實(shí)驗(yàn)室，室溫為20～22 ℃，相對濕度為55%～60%，正常光照，大鼠自由飲水采食。本實(shí)驗(yàn)獲河南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號為DWLL202201010。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥

取雌性SD大鼠50只，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)選取10只為正常組，其余大鼠按1 mg/kg灌胃來曲唑混懸液，每天1次，連續(xù)21 d，以復(fù)制PCOS模型。造模第16天開始進(jìn)行陰道涂片檢測，當(dāng)顯微鏡下可見陰道上皮細(xì)胞持續(xù)角化，則表明造模成功[10]。將造模成功的大鼠隨機(jī)分為模型組、達(dá)英-35+二甲雙胍組（達(dá)英-35 0.2 mg/kg+二甲雙胍230 mg/kg，兩藥劑量均為臨床等效劑量）和金匱腎氣丸低、中、高劑量組（0.5、1.0、2.0 g/kg，中劑量為臨床等效劑量），每組10只。正常組和模型組大鼠灌胃等體積0.1% CMC-Na溶液，各給藥組灌胃相應(yīng)藥物，每天1次，連續(xù)30 d。

2.2 取材及處理

各組大鼠末次灌胃24 h后，稱質(zhì)量，腹腔注射1 g/kg氨基甲酸乙酯麻醉，腹主動脈取血，以3 000 r/min離心10 min，取上清液于－80 ℃下保存?zhèn)溆谩Ｈ⊙瓿珊?，處死大鼠，剖取卵巢，去除周圍組織，生理鹽水洗滌，觀察卵巢外觀形態(tài)，濾紙吸盡臟器表面液體后用電子天平稱質(zhì)量，然后將卵巢組織一分為二，其中一份用4%多聚甲醛固定，另一份用液氮速凍后于－80 ℃下儲存。

2.3 大鼠血清中血糖等指標(biāo)水平檢測及胰島素抵抗指數(shù)計(jì)算

取“2.2”項(xiàng)下血清樣品，按照試劑盒說明書方法操作，采用酶標(biāo)儀檢測血糖、胰島素、E2、T、GnRH、FSH、LH水平；并計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)，胰島素抵抗指數(shù)＝空腹血糖×空腹胰島素/22.5。

2.4 大鼠卵巢系數(shù)的計(jì)算

記錄各組大鼠卵巢質(zhì)量與體質(zhì)量，并計(jì)算卵巢系數(shù)，卵巢系數(shù)＝卵巢質(zhì)量/體質(zhì)量。

2.5 大鼠卵巢組織病理形態(tài)學(xué)觀察

取“2.2”項(xiàng)下用4%多聚甲醛固定的卵巢組織，經(jīng)梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、切片（4 μm）后制作病理切片。取部分切片再經(jīng)二甲苯脫蠟、蘇木素-伊紅染色、梯度乙醇脫水后，以中性樹膠封片，于光學(xué)顯微鏡下觀察各組大鼠卵巢組織的病理形態(tài)學(xué)變化并拍照。

2.6 大鼠卵巢組織中LKB1、AMPK蛋白表達(dá)水平的檢測

采用免疫組織化學(xué)法進(jìn)行檢測。取“2.5”項(xiàng)下制備的組織切片經(jīng)脫蠟、水化后，H2O2封閉，清洗，檸檬酸鹽緩沖液熱修復(fù)，滴加山羊血清封閉液，室溫孵育；傾去液體，分別滴加LKB1（稀釋度為1∶2 000）、AMPK（稀釋度為1∶1 000）抗體，4 ℃孵育過夜；滴加二抗，37 ℃孵育20 min，以DAB顯色，經(jīng)自來水沖洗后，再以蘇木素復(fù)染1～2 min；以鹽酸乙醇進(jìn)行分化，經(jīng)自來水沖洗、脫水、透明、封片后，于光學(xué)顯微鏡下觀察。采用Image-Pro Plus 6.0軟件檢測每個(gè)視野中陽性染色區(qū)域的積分光密度（integrated optical density，IOD）值，IOD值越大，表示蛋白表達(dá)水平越高。

2.7 大鼠卵巢組織中LKB1、AMPK mRNA表達(dá)水平的檢測

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法進(jìn)行檢測。取“2.2”項(xiàng)下各組大鼠卵巢組織適量進(jìn)行勻漿，以Trizol試劑提取總RNA，再經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分析各產(chǎn)物擴(kuò)增曲線，以GAPDH為內(nèi)參，采用2－△△Ct法計(jì)算目的基因mRNA的表達(dá)水平。PCR引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物長度見表1。

表1 PCR引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物長度

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料均以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，方差齊者組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，方差不齊者采用Dunnett’s t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05。

3 結(jié)果

3.1 大鼠血清中血糖、胰島素水平及胰島素抵抗指數(shù)的檢測結(jié)果

與正常組比較，模型組大鼠血糖、胰島素水平及胰島素抵抗指數(shù)均顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，達(dá)英-35+二甲雙胍組和金匱腎氣丸各劑量組大鼠上述指標(biāo)水平均顯著降低（P＜0.05）。結(jié)果見表2。

表2 各組大鼠血清中血糖、胰島素水平及胰島素抵抗指數(shù)檢測結(jié)果（±s，n＝10）

a：與正常組比較，P＜0.05；b：與模型組比較，P＜0.05

組別正常組模型組達(dá)英-35+二甲雙胍組金匱腎氣丸低劑量組金匱腎氣丸中劑量組金匱腎氣丸高劑量組血糖/（mmol/L）5.68±0.12 10.46±0.10a 6.21±0.09b 8.80±0.14b 7.53±0.05b 6.70±0.13b胰島素/（mU/L）9.06±0.08 32.52±1.23a 9.81±0.13b 20.32±0.65b 16.62±0.96b 12.97±0.88b胰島素抵抗指數(shù)2.29±0.07 15.11±0.56a 2.70±0.06b 7.95±0.37b 5.56±0.34b 3.86±0.24b

3.2 大鼠血清中E2、T、GnRH、FSH、LH水平的檢測結(jié)果

與正常組比較，模型組大鼠血清中T、GnRH和LH水平均顯著升高（P＜0.05），E2和FSH水平均顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，達(dá)英-35+二甲雙胍組和金匱腎氣丸各劑量組大鼠血清中GnRH、LH水平均顯著降低（P＜0.05），F(xiàn)SH水平均顯著升高（P＜0.05）；達(dá)英-35+二甲雙胍組和金匱腎氣丸中劑量組大鼠血清中E2水平均顯著升高（P＜0.05），T水平均顯著降低（P＜0.05）。結(jié)果見表3。

表3 各組大鼠血清中E2、T、GnRH、FSH、LH水平的檢測結(jié)果（±s，n＝10）

表3 各組大鼠血清中E2、T、GnRH、FSH、LH水平的檢測結(jié)果（±s，n＝10）

a：與正常組比較，P＜0.05；b：與模型組比較，P＜0.05

組別正常組模型組達(dá)英-35+二甲雙胍組金匱腎氣丸低劑量組金匱腎氣丸中劑量組金匱腎氣丸高劑量組LH/ （mIU/mL）54.81±2.73 65.67±10.52a 49.39±4.77b 56.46±7.35b 53.01±7.08b 51.35±6.86b E2/（pmol/L）45.24±13.58 24.44±9.35a 52.37±11.66b 33.26±15.78 44.61±14.04b 31.76±11.01 T/（nmol/L）1.15±0.18 1.70±0.21a 1.16±0.31b 1.44±0.40 1.03±0.61b 1.50±0.47 GnRH/（mIU/mL）35.09±3.77 49.66±6.12a 31.19±7.20b 30.62±4.61b 33.94±7.66b 38.19±8.24b FSH/ （mIU/mL）63.63±12.10 22.38±3.52a 66.55±11.76b 59.96±3.01b 65.93±7.50b 64.67±9.44b

3.3 大鼠卵巢系數(shù)的檢測結(jié)果

與正常組[（5.69±0.40）×10－4]比較，模型組大鼠卵巢系數(shù)[（6.36±0.67）×10－4]顯著增加（P＜0.05）；與模型組比較，達(dá)英-35+二甲雙胍組和金匱腎氣丸各劑量組大鼠卵巢系數(shù)[分別為（4.51±0.52）×10－4、（5.55±0.45）×10－4、（4.69±0.72）×10－4、（5.03±0.45）×10－4]均顯著降低（P＜0.05）。

3.4 大鼠卵巢組織病理形態(tài)學(xué)的觀察結(jié)果

正常組大鼠卵巢組織結(jié)構(gòu)完整，各級卵泡數(shù)量較多、發(fā)育良好，存在正常的黃體和白體；模型組大鼠卵巢皮質(zhì)膠原化，閉鎖卵泡及無卵丘的囊性卵泡數(shù)量增多，卵泡顆粒細(xì)胞層厚度減小，可見卵泡囊性病變；達(dá)英-35+二甲雙胍組大鼠卵巢組織結(jié)構(gòu)基本完整，各級卵泡形態(tài)完好，未見卵泡囊性改變，卵泡顆粒細(xì)胞層厚度增加，存在少量黃體和白體；金匱腎氣丸低劑量組大鼠卵巢組織中可見較多的閉鎖卵泡和無卵丘囊性卵泡，卵泡顆粒細(xì)胞層厚度減小；金匱腎氣丸中、高劑量組大鼠卵巢組織內(nèi)各級卵泡數(shù)量增多，卵泡顆粒細(xì)胞層厚度增加，放射冠清晰，存在少量黃體和白體，未見卵泡囊性病變。結(jié)果見圖1。

圖1 各組大鼠卵巢組織的病理形態(tài)學(xué)顯微圖（HE染色，×100）

3.5 大鼠卵巢組織中LKB1、AMPK蛋白表達(dá)水平的檢測結(jié)果

正常組大鼠卵巢組織中有大量LKB1、AMPK蛋白表達(dá)。與正常組比較，模型組大鼠卵巢組織中有少量LKB1、AMPK蛋白表達(dá)，其陽性表達(dá)IOD值均顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，達(dá)英-35+二甲雙胍組和金匱腎氣丸各劑量組大鼠卵巢組織中有大量LKB1、AMPK蛋白表達(dá)，其陽性表達(dá)IOD值均顯著升高（P＜0.05）。結(jié)果見圖2、圖3和表4。

表4 各組大鼠卵巢組織中LKB1、AMPK蛋白的IOD值檢測結(jié)果（±s，n＝10，×10－3）

表4 各組大鼠卵巢組織中LKB1、AMPK蛋白的IOD值檢測結(jié)果（±s，n＝10，×10－3）

a：與正常組比較，P＜0.05；b：與模型組比較，P＜0.05

組別正常組模型組達(dá)英-35+二甲雙胍組金匱腎氣丸低劑量組金匱腎氣丸中劑量組金匱腎氣丸高劑量組AMPK 250.72±17.27 132.32±25.84a 285.40±51.35b 219.42±28.76b 240.45±29.93b 193.75±31.03b LKB1 364.65±10.66 67.90±4.23a 211.39±49.04b 146.72±34.26b 215.31±26.14b 160.03±25.67b

圖3 各組大鼠卵巢組織中AMPK蛋白表達(dá)的免疫組織化學(xué)顯微圖（×400）

3.6 大鼠卵巢組織中LKB1、AMPK mRNA表達(dá)水平的檢測結(jié)果

與正常組比較，模型組大鼠卵巢組織中LKB1、AMPK mRNA表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，達(dá)英-35+二甲雙胍組和金匱腎氣丸各劑量組大鼠卵巢組織中LKB1、AMPK mRNA表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.05）。結(jié)果見表5。

表5 各組大鼠卵巢組織中LKB1、AMPK mRNA表達(dá)水平的檢測結(jié)果（±s，n＝10）

表5 各組大鼠卵巢組織中LKB1、AMPK mRNA表達(dá)水平的檢測結(jié)果（±s，n＝10）

a：與正常組比較，P＜0.05；b：與模型組比較，P＜0.05

組別正常組模型組達(dá)英-35+二甲雙胍組金匱腎氣丸低劑量組金匱腎氣丸中劑量組金匱腎氣丸高劑量組AMPK mRNA 1.00±0.00 0.59±0.09a 1.55±0.14b 1.06±0.05b 1.16±0.15b 1.16±0.04b LKB1 mRNA 1.00±0.00 0.67±0.06a 1.78±0.27b 1.44±0.33b 1.65±0.29b 1.31±0.28b

4 討論

來曲唑可抑制卵巢中雄激素向雌激素的轉(zhuǎn)化過程，從而造成機(jī)體性周期紊亂、卵巢排卵障礙及多囊性改變[11]。相關(guān)研究表明，由來曲唑誘導(dǎo)構(gòu)建的PCOS模型與人體PCOS卵巢的病理學(xué)變化較為一致[12]?；诖?，本研究采用來曲唑誘導(dǎo)構(gòu)建大鼠PCOS模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PCOS模型大鼠血清中E2、FSH水平顯著降低，T、GnRH、LH水平顯著升高，卵巢皮質(zhì)膠原化，可見卵泡囊性改變，表明造模成功。

中醫(yī)認(rèn)為PCOS與腎虛、脾虛、肝郁和血瘀有關(guān)[13]，故補(bǔ)腎、健脾、調(diào)肝為中醫(yī)治療PCOS的主要思路。金匱腎氣丸以六味地黃丸為基礎(chǔ)，重用生地黃以滋陰補(bǔ)腎，附以附子、桂枝溫補(bǔ)陽氣，引火歸原，以使腎陰、腎陽平衡，腎氣充實(shí)，進(jìn)而恢復(fù)月經(jīng)；方中以山藥、山茱萸為臣藥，補(bǔ)益脾腎之氣；佐以澤瀉、茯苓健脾利水，牡丹皮清熱消瘀，牛膝、車前子逐瘀通經(jīng)；諸藥合用，共達(dá)“脾腎同治，陰陽雙補(bǔ)”之效[7]。達(dá)英-35為雌激素與孕激素合劑，對PCOS所致的月經(jīng)失調(diào)、雄激素高等癥狀具有一定的治療作用；二甲雙胍為胰島素增敏劑，可以改善胰島素抵抗。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，金匱腎氣丸可降低PCOS模型大鼠卵巢系數(shù)，增加各級卵泡數(shù)量，改善卵泡囊性病變。這表明金匱腎氣丸對PCOS模型大鼠具有較好的改善作用。

GnRH是下丘腦-垂體-性腺（HPG）軸的主要調(diào)控因子，可與下丘腦和腺垂體的GnRH受體結(jié)合后調(diào)控LH和FSH的分泌過程[14]。LH、FSH、E2和相應(yīng)激素受體一起協(xié)同作用于卵巢，調(diào)控雌孕激素的分泌，進(jìn)而影響雌性機(jī)體的動情周期、卵泡發(fā)育及排卵過程[15]。PCOS患者長期大量分泌GnRH，從而導(dǎo)致LH、FSH分泌失衡，即LH水平升高，F(xiàn)SH水平下降；LH水平升高進(jìn)一步促進(jìn)卵泡膜細(xì)胞合成大量T，從而在卵巢內(nèi)形成高雄激素環(huán)境，進(jìn)而阻礙優(yōu)勢卵泡發(fā)育，形成PCOS[16―18]。PCOS患者卵巢通?？梢婎w粒細(xì)胞損傷，E2分泌水平下降，這也是加劇卵泡閉鎖與排卵障礙的主要原因[19]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，金匱腎氣丸可升高E2、FSH水平，降低T、GnRH、LH水平。這表明金匱腎氣丸可以通過調(diào)控激素分泌水平來改善PCOS。

LKB1、AMPK均為真核細(xì)胞中的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，廣泛表達(dá)于各種組織中，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)一磷酸腺苷（AMP）/三磷酸腺苷（ATP）比值升高時(shí)，AMP與AMPK-γ調(diào)節(jié)亞基結(jié)合，將LKB1磷酸化為p-LKB1，p-LKB1又會與AMPK-α亞基上的Thr172位點(diǎn)結(jié)合，將該位點(diǎn)磷酸化為p-AMPK，進(jìn)而開啟分解代謝途徑以升高ATP水平，同時(shí)關(guān)閉合成代謝途徑以降低ATP消耗，維持能量平衡[20―21]。有研究表明，LKB1/AMPK信號通路與胰島素抵抗相關(guān)，且LKB1、AMPK蛋白表達(dá)水平降低是胰島素抵抗發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[22]，由此推測PCOS引起的胰島素抵抗可能與下調(diào)LKB1/AMPK信號通路活性有關(guān)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PCOS模型大鼠卵巢組織中LKB1、AMPK蛋白和mRNA的表達(dá)水平均顯著降低，即LKB1/AMPK信號通路被抑制。經(jīng)金匱腎氣丸干預(yù)后，大鼠卵巢組織中LKB1、AMPK蛋白和mRNA的表達(dá)水平顯著升高。這表明金匱腎氣丸可通過上調(diào)LKB1/AMPK信號通路活性來改善PCOS。

綜上所述，金匱腎氣丸對PCOS模型大鼠性激素水平異常、胰島素抵抗及卵巢囊性改變均有較好的改善作用，其作用機(jī)制可能與上調(diào)LKB1/AMPK信號通路活性有關(guān)。