保健食品中葉黃素總量的高效液相色譜分析測定

劉艷榮 原敏 蒲雅潔

（山西健碩食品藥品研究院有限公司，山西太原 030006）

葉黃素是一種廣泛存在于蔬菜、水果、花卉等植物中的類胡蘿卜素，在自然界與玉米黃素同時存在，主要來源是萬壽菊植物。葉黃素是一種優(yōu)良的抗氧化劑，有保護視力、延緩動脈硬化、抗癌等功能，作為食品添加劑使用，和其他有益互補營養(yǎng)元素一起添加到食品中起保健作用。

根據(jù)文獻報道，高效液相色譜法是測定葉黃素的主要方法，該方法準確、可靠、靈敏度高。由于葉黃素本身結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定性，常常是以葉黃素微囊粉或葉黃素酯的形式添加到保健食品中，因此不同的提取方法對葉黃素測定結(jié)果的影響非常大。本文采用含BHT 的乙醇溶液對樣品中的葉黃素進行提取，在堿液中皂化轉(zhuǎn)化為游離葉黃素，然后混合有機溶劑萃取，采用高效液相色譜外標法定量，同時對其方法學(xué)內(nèi)容進行考查，試驗結(jié)果良好。該方法既可以有效提取保健食品樣品中的葉黃素，又可以準確定量。

1 材料與方法

1.1 儀器

LC-20AT 高效液相色譜儀，附紫外檢測器，日本島津儀器有限公司；UV1800 紫外可見分光光度計，日本島津儀器有限公司；電子分析天平，日本島津儀器有限公司；振蕩器，常州國華電器有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，瑞士步琦有限公司；低速離心機，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司。

1.2 試劑與材料

葉黃素標準品，CAS:127-40-2，成都德斯特；葉黃素保健食品，市售；甲醇、乙腈、環(huán)己烷、乙醚、正己烷、無水乙醇，均為色譜純；二丁基羥基甲苯（BHT）。氫氧化鉀，均為分析純；娃哈哈純凈水；孔徑0.45μm有機濾膜。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：C18色譜柱，5μm，250 mm×4.6 mm（內(nèi)徑）；柱溫：30 ℃；流動相：甲醇∶乙腈∶水=10:9:1；流速：1.0 mL/min；檢測波長：445 nm；進樣量：10μL。

1.3.2 標準溶液配制

準確稱取5 mg（精確至0.01 mg）葉黃素，以0.1% BHT 乙醇溶液溶解并定容至100 mL，配成50μg/mL 的標準儲備液。

1.3.3 標準儲備液校正

取1 mL 標準儲備液，以乙醇定容至25 mL。移取該溶液至1 cm 的石英比色皿中，以乙醇為空白，用分光光度計在波長445 nm處測定吸光度值。按下式計算標準溶液質(zhì)量濃度：

式中：X—標準溶液質(zhì)量濃度，μg/mL；

A—標準溶液的吸光度值；

E—乙醇中葉黃素的吸光系數(shù)，為2 550 dL/g；25—稀釋倍數(shù)；

10 000—轉(zhuǎn)換系數(shù)（g/dL轉(zhuǎn)化為μg/mL）。

1.3.4 樣品處理

準確稱取0.2 g 均勻試樣于50 mL 聚丙烯離心管中，加入約0.2 gBHT 和10 mL 乙醇，混勻，加入10 mL10%氫氧化鉀溶液，渦旋振蕩1 min 混勻，室溫避光振蕩皂化30 min，加10 mL 萃取溶劑（其中環(huán)己烷∶乙醚∶正己烷=20∶40∶40，含0.1%BHT）避光渦旋振蕩提取3 min，離心，重復(fù)提取2次，合并提取液，以10 mL 水洗滌，合并有機相于室溫減壓濃縮至近干，加0.1%BHT 乙醇溶液渦旋避光振蕩溶解殘渣并定容至10 mL，過孔徑0.45μm 濾膜，供液相色譜測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜柱的選擇

比較了C18和C302 種色譜柱的分離效果，結(jié)果表明，葉黃素都能很好的出峰。同等條件下，C30色譜柱由于碳鏈的長度與類胡蘿卜素化合物分子的長度接近，二者的相互作用得到了增強，更適合各種復(fù)雜異構(gòu)體的分離。因此，對于保健食品中葉黃素總量的檢測，選擇了應(yīng)用更為廣泛的C18色譜柱。

2.2 流動相的選擇

在查閱參考文獻的基礎(chǔ)上，選擇了甲醇-甲基叔丁基醚、乙腈-水、甲醇-乙腈-水共3 種流動相體系進行比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，甲醇-甲基叔丁基醚體系色譜柱平衡時間長，在反相色譜中應(yīng)用少；乙腈-水體系中葉黃素出峰早，與樣品中雜質(zhì)難以分離；甲醇-乙腈-水體系中能得到比較好的色譜峰。因此選擇甲醇-乙腈-水作為流動相體系。

2.3 標準曲線的線性范圍

從校正過的葉黃素標準儲備液中準確移取2.0 mL、4.0 mL、8.0 mL、10.0 mL、15.0 mL、25.0 mL溶液分別到6 個25 mL 棕色容量瓶中，用0.1 %BHT 乙醇溶液定容至刻度。將得到的標準系列工作液分別注入液相色譜中，測定相應(yīng)的峰面積，以葉黃素質(zhì)量濃度為橫坐標，以峰面積為縱坐標繪制標準曲線（見圖1），得到回歸方程為y=95 571x-164 969，R為0.999 4，R2為0.998 7，結(jié)果表明在4μg/mL～50μg/mL 范圍內(nèi)線性良好。

2.4 精密度

精密吸取10μL 葉黃素標準溶液（16μg/mL），重復(fù)進樣6 次測得葉黃素峰面積，結(jié)果如下頁表1所示。由表1 可知，RSD為0.33 %，表明儀器精密度良好。

表1 葉黃素精密度試驗結(jié)果

2.5 方法重復(fù)性

準確稱取6 份均勻試樣，按照1.3.4 的方式處理后進行樣品含量的測定，結(jié)果如表2所示。由表2可知，測得樣品中葉黃素平均含量為0.132 5 g/100g，RSD為1.67%。

表2 重復(fù)性試驗結(jié)果

2.6 方法準確度

準確稱取0.1 g 均勻樣品（精確至0.01 g）置于50 mL聚丙烯離心管中，平行稱取9份，按照1∶0.5、1∶1、1∶1.5 的比例分別加入校正后的標準溶液（50μg/mL）1.4 mL、2.8 mL、4.2 mL，每個比例3個平行。分別加入約0.2 gBHT 和10 mL 乙醇，混勻，后續(xù)操作過程同樣品測定，回收率試驗結(jié)果見表3。由表3 可知，回收率在102.10%～103.91%之間，表明該方法測定結(jié)果準確可靠。

表3 回收率試驗結(jié)果

2.7 實際樣品測定

選擇另外2 種樣品按照上述條件進行處理，每個樣品測定2 次，取平均值，按照外標法定量，結(jié)果見表4。

表4 試樣中葉黃素測定結(jié)果

3 結(jié)論

本文建立的保健食品中葉黃素總量的測定方法，具有良好的線性、精密度、重復(fù)性和滿意的回收率，具有靈敏度高，準確度高的優(yōu)點。通過對市售實際樣品的測定，結(jié)果均符合產(chǎn)品的標準要求，該方法可用于保健食品中葉黃素總量的分析測定。