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    碳納米管作為載體在生物醫(yī)學(xué)中的研究進(jìn)展

    2022-12-13 00:28:11朱效博宋翠平楊智和李木子王桂琴趙思俊
    中國(guó)動(dòng)物檢疫 2022年3期
    關(guān)鍵詞:共價(jià)功能化羧基

    楊 敏,張 瑜,朱效博,王 濤,宋翠平,楊智和,李木子,王桂琴,趙思俊

    (1.寧夏大學(xué),寧夏銀川 750021;2.中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心,山東青島 266032;3.山西農(nóng)業(yè)大學(xué),山西晉中 030800;4.青島市智慧鄉(xiāng)村發(fā)展服務(wù)中心,山東青島 266200;5.天津農(nóng)學(xué)院,天津 300384)

    細(xì)胞對(duì)蛋白質(zhì)和核酸等外來物質(zhì)滲透性較差,使這些生物分子不易穿越細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞。因此有必要尋求可在細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸生物分子(如DNA、蛋白質(zhì)、藥物等)的新型載體,以便有效突破細(xì)胞膜屏障,運(yùn)送和使用細(xì)胞外的藥物并使其發(fā)揮功能[1-3]。目前諸多藥物載體的出現(xiàn)降低或避免了藥物在單獨(dú)使用過程中存在的組織分布差、溶解率低、選擇性缺乏等不足[4-5]。隨著人們對(duì)納米技術(shù)的深入探索,各種納米材料已被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中。其中,具有特殊性能的碳納米管(carbon nanotubes,CNTs)能有效跨越生物屏障,穿透多種細(xì)胞[6-7]。與傳統(tǒng)藥物載體相比,CNTs 具有體積小、比表面積高、可功能化、細(xì)胞穿透能力強(qiáng),以及可與更多的生物大分子和藥物結(jié)合的特點(diǎn),成為一類新型載體,使其在蛋白質(zhì)、基因和藥物的傳遞方面具有廣闊的應(yīng)用前景[8-9]。

    1 CNTs 的分類

    CNTs 可分為單壁碳納米管(single-walled carbon nanotubes,SWCNTs)和多壁碳納米管(multi-walled carbon nanotubes,MWCNTs)[10]。SWCNTs 由單個(gè)石墨烯組成,直徑通常為0.4~3.0 nm,長(zhǎng)度通常為20~1 000 nm;MWCNTs 由多層石墨烯組成,直徑通常為1.4~100.0 nm,長(zhǎng)度通常為1~50 μm。CNTs 的每個(gè)碳原子以sp2鍵結(jié)合,比金剛石中的sp3鍵更強(qiáng),使得CNTs 具有獨(dú)特的物理化學(xué)性質(zhì),如表面易修飾、能進(jìn)入細(xì)胞、生物相容性好、非免疫原性等[11-12]。

    2 CNTs 進(jìn)入細(xì)胞的方式

    通常認(rèn)為CNTs 進(jìn)入細(xì)胞有內(nèi)吞作用和被動(dòng)擴(kuò)散兩種方式。內(nèi)吞作用是細(xì)胞膜依靠能量吞噬細(xì)胞外物質(zhì),可進(jìn)一步分為胞飲作用、吞噬作用和網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)作用[13-14];被動(dòng)擴(kuò)散是CNTs 直接滲透到細(xì)胞質(zhì),通常是指CNTs 與脂膜的親脂作用,從而發(fā)生內(nèi)化[15]。Zhu 等[16]將釀酒酵母細(xì)胞加入到4 ℃條件下氧化的SWCNTs 懸液中,使用拉曼分光光度計(jì)定量測(cè)定釀酒酵母中氧化的SWCNTs,并用實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(real-time PCR)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)吞的相關(guān)基因,結(jié)果發(fā)現(xiàn)氧化的SWCNTs 可通過內(nèi)吞作用進(jìn)入釀酒酵母細(xì)胞,并分布到細(xì)胞質(zhì)、囊泡、溶酶體和細(xì)胞核中。Porter 等[17]將細(xì)胞與SWCNTs 溶液混合2 d 后發(fā)現(xiàn),大多數(shù)SWCNTs位于細(xì)胞的吞噬小體和溶酶體內(nèi),體現(xiàn)了SWCNTs的吞噬作用;第4 天,可觀察到SWCNTs 通過細(xì)胞膜轉(zhuǎn)移到鄰近的細(xì)胞質(zhì)中,表明此過程是脂質(zhì)雙分子層的被動(dòng)攝取。因此,SWCNTs 進(jìn)入細(xì)胞可能同時(shí)存在內(nèi)吞作用和被動(dòng)擴(kuò)散兩種方式。Dumortier 等[18]通過氧化/酰胺化處理和1,3-偶極環(huán)加成反應(yīng)制備了兩種類型功能化CNTs,研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)過功能化的CNTs 在體外均可被B 淋巴細(xì)胞、T 淋巴細(xì)胞以及巨噬細(xì)胞攝取,并且通過氧化/酰胺化處理的CNTs 可形成穩(wěn)定的水懸浮液。

    3 CNTs 的功能化

    CNTs 難溶于多數(shù)溶劑,且因π-π 共軛、疏水力、范德華力等作用,分散性較弱,極易在溶液中形成團(tuán)聚現(xiàn)象。CNTs 的特殊性能可被各種化學(xué)物質(zhì)功能化和修飾[19]。功能化使CNTs 表面性質(zhì)發(fā)生了改變,增加了其分散性、均勻性和溶解性。因此,CNTs 的功能化使其在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用更加廣泛,通過在CNTs 的側(cè)壁和末端引入不同基團(tuán),可將多肽、蛋白質(zhì)、核酸以及藥物等生物分子通過共價(jià)或非共價(jià)作用偶聯(lián)到CNTs 上[20],從而可以靶向病灶部位的組織、器官,達(dá)到治療疾病的目的[21]。根據(jù)功能化的分類可分為共價(jià)功能化和非共價(jià)功能化。

    3.1 共價(jià)功能化

    共價(jià)功能化通過改變CNTs 的結(jié)構(gòu),使碳雜化從sp2變?yōu)閟p3,從而改變CNTs 的特性,使CNTs具備負(fù)載藥物及生物分子的能力。共價(jià)功能化最常見的方法是通過強(qiáng)酸氧化處理CNTs,在其表面生成羧基基團(tuán)。盡管共價(jià)功能化破壞了CNTs 的π-π共軛,但其氧化為氨、凝集素和氨基酸等進(jìn)一步修飾提供了機(jī)會(huì)[22]。CNTs 表面的羧基在與亞硫酰氯反應(yīng)之后,對(duì)加入含有游離氨基團(tuán)的化合物進(jìn)行修飾[23];通過共價(jià)修飾,可以制備不同烷基鏈或末端官能團(tuán),生成不同的CNTs 復(fù)合物,從而增強(qiáng)CNTs 的生物相容性和靶向附著生物分子的潛力及其在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用[24]。

    3.2 非共價(jià)功能化

    CNTs 的非共價(jià)功能化是基于π-π 共軛、氫鍵、靜電、范德華力和疏水作用等不同的作用方式[25],通過表面活性劑、芳香族化合物、聚合物等進(jìn)行非共價(jià)功能化。此方法不會(huì)對(duì)CNTs 的獨(dú)特結(jié)構(gòu)造成破壞,并保留了CNTs 的物理、光學(xué)、熱和電性能等原有性質(zhì)[26],同時(shí)也保留了CNTs 的sp2雜化六元環(huán)和擴(kuò)展偶聯(lián)。

    4 CNTs 作為載體的應(yīng)用

    CNTs 特殊的性能和獨(dú)特的結(jié)構(gòu),可共價(jià)鍵合不同種類的化學(xué)基團(tuán),也可非共價(jià)偶聯(lián)多種生物大分子。同時(shí),CNTs 具有良好的細(xì)胞穿透性,作為載體時(shí),在增加藥物負(fù)載率、提高藥物療效方面顯示出潛在的應(yīng)用價(jià)值[27]。

    4.1 CNTs 作為蛋白質(zhì)載體

    Zhao 等[28]研究比較了3 種不同直徑MWCNTs 吸附牛血清蛋白的特征,發(fā)現(xiàn)直徑小于10 nm 的MWCNTs 相比直徑為10~20 nm 和20~40 nm的能吸附更多牛血清蛋白。周霜[29]發(fā)現(xiàn):CNTs可與肌紅蛋白發(fā)生較強(qiáng)的作用,通過改變肌紅蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu),使其主肽鏈發(fā)生去折疊或者重排;血液中的蛋白質(zhì)也可通過非共價(jià)相互作用與CNTs結(jié)合形成蛋白質(zhì)冠,從而影響CNTs 和血液的生物相容性。Lu 等[30]研究了3 種長(zhǎng)度為1~3 μm,直徑為1~2 nm,含不同官能團(tuán)的CNTs 對(duì)人血清白蛋白的吸附作用,發(fā)現(xiàn)羧基化SWCNTs 對(duì)人血清白蛋白的吸附率遠(yuǎn)高于羥基化SWCNTs 和氨基化SWCNTs 對(duì)人血清白蛋白的吸附率。隨后,Lu 等[31]又比較了人免疫球蛋白G、人血清白蛋白和纖維蛋白原與長(zhǎng)度為1~3 μm,直徑為1~2 nm的SWCNTs 的結(jié)合能力,結(jié)果發(fā)現(xiàn)纖維蛋白原與SWCNTs 的吸附量最高,且僅用人免疫球蛋白G與SWCNTs 結(jié)合就會(huì)刺激中性粒細(xì)胞中髓過氧化物酶的釋放。Nicoletti 等[32]研究表明:羧基或氨基功能化的MWCNTs 可以與免疫球蛋白等高豐度蛋白以及載脂蛋白、補(bǔ)體成分等低豐度蛋白形成蛋白冠;經(jīng)聚乙二醇功能化的MWCNTs 也可與人血漿蛋白形成蛋白冠[33]。以上研究均表明,CNTs 可與蛋白質(zhì)發(fā)生作用。

    4.2 CNTs 作為基因載體

    基因傳遞到細(xì)胞的方法可分為兩種:病毒基因載體和非病毒基因載體。病毒基因載體是病毒攜帶基因進(jìn)入細(xì)胞,此法可高效遞送基因,使基因高水平表達(dá),但是會(huì)造成機(jī)體產(chǎn)生炎癥反應(yīng)和免疫原性;非病毒基因載體是通過物理和化學(xué)方法使目的基因進(jìn)入細(xì)胞[15]。Nahle 等[34]將NR8383 大鼠肺泡巨噬細(xì)胞作為體外模型研究后發(fā)現(xiàn):經(jīng)氨基或羧基功能化的MWCNTs 可改變哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白信號(hào)通路,從而增加Lamtor(晚期溶酶體和核內(nèi)體接頭蛋白)編碼基因的表達(dá);此外,氨基功能化的MWCNTs可激活轉(zhuǎn)錄因子EB并誘導(dǎo)自噬,羧基功能化的MWCNTs 可改變真核翻譯起始因子4 和磷酸蛋白70 核糖體蛋白S6 激酶信號(hào)通路,并上調(diào)Toll 樣受體2 基因的表達(dá)。Edwards 等[35]研究發(fā)現(xiàn),經(jīng)聚酰胺-胺型樹枝狀功能化的CNTs 能有效傳遞雙鏈核糖核酸(double stranded RNA,dsRNA)、聚酰胺-胺型樹枝狀-CNTs-dsRNA復(fù)合物,使其快速進(jìn)入靶細(xì)胞,并誘導(dǎo)產(chǎn)生比單獨(dú)使用dsRNA 更強(qiáng)的效果。Munk[36]等將羧基化MWCNTs 與質(zhì)粒DNA 以5:1(質(zhì)量比)的比例混合,渦動(dòng)孵育形成羧基化MWCNTs-質(zhì)粒DNA 復(fù)合物,然后將含綠色熒光蛋白基因的質(zhì)粒DNA 導(dǎo)入成纖維細(xì)胞,利用流式細(xì)胞儀、熒光成像和realtime PCR 分析,證明羧基化MWCNTs 可將質(zhì)粒DNA 傳遞到牛原代成纖維細(xì)胞。開放閱讀框149(open reading frame149,ORF149)基因是編碼錦鯉皰疹病毒(koi herpes virus,KHV)的主要免疫原性蛋白之一。Hu 等[37]構(gòu)建了重組質(zhì)粒pcDNAORF149,制備了SWCNTs-pcDNA-ORF149 復(fù)合物,用于制作KHV 疫苗,結(jié)果發(fā)現(xiàn)相同劑量下,注射SWCNT-pcDNA-ORF149 疫苗的抗體含量遠(yuǎn)高于只注射pcDNA-ORF149 的抗體含量,免疫效果提高了33.9%。SWCNTs-pcDNA-ORF149 疫苗不但可誘導(dǎo)錦鯉產(chǎn)生血清抗體,而且還提高了酶活性和免疫相關(guān)基因表達(dá)水平,并提出肌肉注射10 μg SWCNTs-pcDNA-ORF149 對(duì)錦鯉抵抗KHV 的免疫效果最佳。Munk 等[38]將MWCNTs 與質(zhì)粒DNA偶聯(lián),形成MWCNTs-質(zhì)粒DNA 復(fù)合物,用于體外受精牛胚胎的轉(zhuǎn)染,發(fā)現(xiàn)MWCNTs-質(zhì)粒DNA可穿過透明帶,進(jìn)入胚胎中,且不會(huì)改變胚胎中的基因水平表達(dá)。以上研究均表明,CNTs可作為載體,提高基因的表達(dá)水平。

    4.3 CNTs 作為抗癌藥物載體

    CNTs 比表面積高,可以很容易結(jié)合各種藥物進(jìn)行藥物傳遞,達(dá)到理想的治療效果。Salastrevi?o 等[39]設(shè)計(jì)了一種透明質(zhì)酸與氧化MWCNTs的復(fù)合物作為載體,結(jié)合藥物卡鉑用于體外模型肺癌的治療,初步研究表明氧化MWCNTs-透明質(zhì)酸-卡鉑復(fù)合物具有良好的體外特異性抗癌作用。Jawahar 等[40]將純化的CNTs 與聚乙二醇、葉酸溶液一起超聲,形成葉酸-聚乙二醇-CNTs的復(fù)合物,然后將鹽酸雷洛昔芬通過疏水作用與葉酸-聚乙二醇-CNTs 結(jié)合,結(jié)果發(fā)現(xiàn)葉酸-聚乙二醇-CNTs有助于提高鹽酸雷洛昔芬的載藥率,載藥率為74.2%±4.67%,因而可提高乳腺癌的治療療效,還能作為活性靶向配體靶向癌細(xì)胞。Li 等[41]制備了一種CNTs(Fe)/羥基磷灰石的復(fù)合物,再用殼聚糖和葉酸對(duì)所合成的CNTs(Fe)/羥基磷灰石復(fù)合物進(jìn)行化學(xué)修飾,制備了一種新型磁性靶向藥物載體,發(fā)現(xiàn)葉酸-殼聚糖-CNTs(Fe)/羥基磷灰石復(fù)合物對(duì)多西環(huán)素的平均載藥率可達(dá)130%,并且鐵磁性可以使載體在磁場(chǎng)下傳遞藥物,從而實(shí)現(xiàn)藥物的靶向作用。Jagusiak 等[42]制備了SWCNTs 與剛果紅的復(fù)合物,然后將多西環(huán)素偶聯(lián)到SWCNTs-剛果紅的復(fù)合物上,結(jié)果發(fā)現(xiàn)SWCNTs-剛果紅大大增加了多西環(huán)素的載藥率,與藥物結(jié)合的高能力可能會(huì)降低體內(nèi)藥物載體復(fù)合物的排泄率,延長(zhǎng)藥物在靶位點(diǎn)的作用時(shí)間。Tavakolifard 等[43]用紫杉醇、葉酸對(duì)SWCNTs 進(jìn)行功能化,形成了紫杉醇-葉酸-SWCNTs 的復(fù)合物,通過傅里葉紅外光譜、紫外可見吸收光譜等方法檢測(cè)都證明葉酸和紫杉醇已成功加載到SWCNTs 上。Rathod 等[44]通過使用乙二胺和苯基硼酸基團(tuán)對(duì)CNTs 表面進(jìn)行雙官能團(tuán)化,形成了乙二胺-苯基硼酸-CNTs 的復(fù)合物,然后在功能化后的CNTs 上加入紫杉醇,結(jié)果發(fā)現(xiàn)紫杉醇通過π-π 相互作用偶聯(lián)到CNTs 上,且載藥率可高達(dá)30.85%。Comparetti 等[45]也研究發(fā)現(xiàn),CNTs 是紫杉醇治療癌細(xì)胞的有效載體,并將抗前列腺特異性膜抗原的抗體和負(fù)載紫杉醇的CNTs 分別作用于前列腺癌細(xì)胞和結(jié)腸癌細(xì)胞,結(jié)果發(fā)現(xiàn)抗前列腺特異性膜抗原的抗體可增強(qiáng)CNTs-紫杉醇藥物的療效和對(duì)前列腺癌細(xì)胞的殺傷作用,但對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的殺傷效果不明顯,展示了該方法的特異性。以上研究均表明,CNTs 可作為載體,增加藥物的載藥率并提高藥物療效。

    5 小結(jié)和展望

    本文綜述了CNTs 功能化的方法和其穿透細(xì)胞的優(yōu)異能力,及其作為載體在蛋白質(zhì)、基因和抗癌藥物等方面的研究進(jìn)展。近年來,越來越多的研究團(tuán)隊(duì)探索了將生物分子偶聯(lián)到CNTs 的各種方法,在這過程中,如果能更好地通過功能化提高CNTs在溶液中的分散性、穩(wěn)定性,增強(qiáng)組織相容性,以最大限度地提高其與生物分子的偶聯(lián)率和活性,這將進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)CNTs 的有效利用。

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