水體日本血吸蟲尾蚴檢測技術(shù)的研究進(jìn)展

文雨松，李召軍，胡飛，林丹丹

江西省寄生蟲病防治研究所，江西省血吸蟲病預(yù)防控制重點實驗室，江西 南昌 330096

血吸蟲病是一種在世界范圍內(nèi)廣泛分布的寄生蟲病，嚴(yán)重阻礙社會經(jīng)濟發(fā)展、威脅公共衛(wèi)生安全[1]。人或動物主要是通過接觸含有血吸蟲尾蚴的水體而感染，感染的高發(fā)時期是春秋時節(jié)和長江汛期[2-3]。當(dāng)前血吸蟲病在我國已呈低流行態(tài)勢，構(gòu)建實施有效的監(jiān)測系統(tǒng)，加強監(jiān)測工作是控制血吸蟲病的重點[4]。對重點區(qū)域的水體監(jiān)測能及時發(fā)現(xiàn)風(fēng)險并采取應(yīng)急防控措施，從而有效保護人群的身體健康。因此，對水體日本血吸蟲尾蚴監(jiān)測預(yù)警是及時發(fā)現(xiàn)和處置疫情的重要措施之一[5]。尾蚴監(jiān)測預(yù)警的核心內(nèi)容是尾蚴檢測，本文主要就水體日本血吸蟲尾蚴檢測技術(shù)研究進(jìn)展做一綜述。

1 哨鼠法

哨鼠法是目前使用最廣泛的水體日本血吸蟲感染性檢測技術(shù)。哨鼠法是將人工飼養(yǎng)的成年健康小白鼠放入特制的鼠籠中，投放于需測定的水體，使小白鼠的腹部及尾部接觸水體，一般持續(xù)2天，每天投放4 小時，現(xiàn)場投放后轉(zhuǎn)移至實驗室飼養(yǎng)，飼養(yǎng)35天后解剖查蟲觀察血吸蟲感染情況[6]。

自20 世紀(jì)50 年代中期，哨鼠法一直是我國水體尾蚴檢測的主要方法，廣泛應(yīng)用在血吸蟲病綜合防治工作、汛期重點水域的監(jiān)測和科研實驗中[7-12]。例如陳陵等[11]利用哨鼠法在四川省血吸蟲病重點地區(qū)的重點水域開展血吸蟲監(jiān)測工作；涂永紅等[12]應(yīng)用哨鼠法在鄱陽湖區(qū)進(jìn)行以傳染源控制為主的血吸蟲病綜合防治工作。哨鼠法簡單易學(xué)，可適用于不同環(huán)境水體的測定，具有靈敏度高、準(zhǔn)確性強的優(yōu)點，但是周期長，通常需要1 個月左右，且存在哨鼠死亡或丟失的風(fēng)險。

為減少在監(jiān)測過程中哨鼠死亡或丟失的情況，吳鋒等[13]設(shè)計制作了漂浮式哨鼠籠，其能隨水位自由升降同時保證小鼠與水面充分接觸。在多年的現(xiàn)場應(yīng)用中，該鼠籠因總回收率和哨鼠回收率高、成本低廉，已廣泛應(yīng)用于國家監(jiān)測點的疫水檢測。楊坤等[14]針對血吸蟲尾蚴懸浮于水面不能主動移位的特性，采用智能化技術(shù)，研發(fā)了一種運動式哨鼠血吸蟲感染性水體檢測儀，以增加血吸蟲尾蚴被檢測的概率。該設(shè)備能夠在水體中遙控航行，大幅增加哨鼠接觸血吸蟲尾蚴的機會，使現(xiàn)場檢測時間由傳統(tǒng)方法的8 小時減少到1 小時，哨鼠感染率由15%增加到40%，哨鼠感染度（蟲負(fù)荷）由0.25條/只增加到2.55 條/只，大幅提高了現(xiàn)場疫水檢測的效能，目前已在江蘇省沿江重點水域監(jiān)測預(yù)警體系中發(fā)揮重要作用[6]。

為解決檢測周期長和尾蚴感染度低時解剖哨鼠查蟲法可能存在漏檢的缺點，有研究者利用分子生物學(xué)方法來提高檢測效率和精度。張凡等[15]以SjR2為目的片段建立巢式PCR法，發(fā)現(xiàn)巢式PCR可以快速敏感地檢測出血吸蟲尾蚴，在2013年的監(jiān)測工作中發(fā)現(xiàn)8個哨鼠監(jiān)測點中有2只小鼠血清巢式PCR擴增陽性，但在小鼠解剖時并未發(fā)現(xiàn)蟲體。王玠等[16]利用Western blot檢測哨鼠血清中Sj23HD抗體，可發(fā)現(xiàn)哨鼠早期感染，使哨鼠法的預(yù)警時間比解剖查蟲法提前2～3周，從而提高哨鼠法的預(yù)警效能。上述方法在實驗室內(nèi)均取得了較好的效果，但尚未在現(xiàn)場監(jiān)測中推廣應(yīng)用。

2 黏附法

2.1 粘取法 此法是根據(jù)日本血吸蟲尾蚴常停留在水體表面和易吸附在物體上的特性而設(shè)計。一般采用尼龍絹或卡普隆制作成長條縫在竹竿上，展開紗布在水面上粘觸；每粘觸8～10 m2水面后，卷起紗布放入甲醛中染色固定，鏡檢查蚴。粘取法由陳光裕等多次改進(jìn)后被廣泛應(yīng)用于現(xiàn)場監(jiān)測中。陳光裕等[17-19]發(fā)現(xiàn)粘取法與水面尾蚴密度有一定關(guān)系，在實驗中當(dāng)尾蚴密度超過34條/m2時，每次都能查到尾蚴；隨著尾蚴密度降低，尾蚴的檢出率隨之下降。隨著我國血吸蟲病的控制，水體中尾蚴密度降低，目前粘取法很少應(yīng)用在現(xiàn)場監(jiān)測中。

2.2 C-6膜法 C-6膜是蔡士椿等[20]篩選的一種吸附力強的薄膜材料，可以吸附血吸蟲尾蚴。在黏蚴后的C-6膜面上直接噴布CS16染液，可使尾蚴著染黃、藍(lán)雙色且體態(tài)完好率高，易于識別，故檢測結(jié)果較準(zhǔn)確。該法曾在20世紀(jì)90年代現(xiàn)場監(jiān)測中廣泛應(yīng)用。周云等[21]認(rèn)為C-6 膜法成本低，每次檢測費用約為哨鼠法的1%，操作簡單，鏡檢即可判斷。黃四喜等[22]分別采用C-6膜法和哨鼠法測定水體中日本血吸蟲尾蚴，發(fā)現(xiàn)用C-6 膜獲取尾蚴陽性率為1.73%（1/58），哨鼠法陽性率2.83%（6/213），差異無統(tǒng)計學(xué)意義；劉榆華等[23]現(xiàn)場檢測結(jié)果認(rèn)為在陽性螺密度高的地區(qū)C-6 膜法和哨鼠法檢出效果無差異，但在陽性螺密度低的地區(qū)C-6 膜法檢出率低于哨鼠法。在當(dāng)前低流行狀態(tài)下，傳統(tǒng)C-6 膜法收集尾蚴效果甚微。曲國立等[24]利用大豆油、異佛爾酮等試劑結(jié)合C-6膜、PE膜檢測方法來探索適用于湖區(qū)的快速敏感的疫水檢測技術(shù)，其結(jié)果表明利用擴展劑可以提高C-6膜和PE膜收集尾蚴的效果，能快速檢出低密度的水體尾蚴。

2.3 網(wǎng)撈法 此法于1961 年由俞順章等介紹，網(wǎng)撈法一般使用細(xì)卡普隆紗布，制作尖底的漏頂形網(wǎng)袋（口徑和形式可根據(jù)現(xiàn)場情況制定），用回形針臨時封閉底部[25]。在待檢測的水域范圍內(nèi)撈取若干次后，收集網(wǎng)袋利用染色劑鏡下觀察尾蚴。陽桂芬等[26]使用C-6膜法和網(wǎng)撈法對東洞庭湖外洲部分水域進(jìn)行了檢測，在同一環(huán)境中網(wǎng)撈法查獲5條尾蚴，C-6膜法查獲1條，在后續(xù)的兩次實驗中網(wǎng)撈法效果均優(yōu)于C-6膜法，兩種方法都能快速獲得檢測結(jié)果。

3 富集法

高艷春等[27]根據(jù)血吸蟲尾蚴的生活習(xí)性和生理特點，設(shè)計機械裝置來收集尾蚴并對影響富集效率的各種技術(shù)參數(shù)進(jìn)行了研究。其研究結(jié)果表明，在潛水泵功率40 W、濾網(wǎng)目數(shù)為400目的情況下工作5 小時的尾蚴富集效果最好。該裝置操作簡單，使用方便，并且可以檢測到活的尾蚴；但在尾蚴密度較低時，難以富集。

4 仿生膜法

以往的尾蚴收集方法多屬于被動收集方式，而彭國華等[28]根據(jù)尾蚴趨向動物皮脂的特性，研制仿生膜用以吸附尾蚴，同時結(jié)合分子生物學(xué)技術(shù)來進(jìn)行尾蚴的快速檢測。其結(jié)果表明，利用豬皮為主要原料制成的仿生動物皮膜采集器，在實驗室和現(xiàn)場均能檢測到血吸蟲尾蚴，檢測效果與哨鼠法相近，但工作效率顯著高于哨鼠法。進(jìn)一步比較不同組成材料的動物皮膜檢測效果，結(jié)果表明添加與未添加苯甲酸鈉的動物皮膜檢測結(jié)果差異無統(tǒng)計學(xué)意義，兩種膜與尾蚴對照組檢測結(jié)果差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，只要有尾蚴黏附在膜上均能有效檢出[29]。孫成松等[30]在安徽省對受洪澇災(zāi)害影響的血吸蟲病高風(fēng)險環(huán)境，分別使用了智能哨鼠疫水檢測儀和仿生皮膜水面尾蚴快速檢測技術(shù)進(jìn)行檢測，在兩處環(huán)境中仿生膜檢測到尾蚴而哨鼠法卻未檢測到尾蚴，認(rèn)為仿生膜法在檢測敏感性和即時性等方面均優(yōu)于哨鼠法。

5 環(huán)境DNA（environmental DNA,eDNA）法

eDNA法是指從環(huán)境樣品（土壤、沉積物和水體等）中直接提取DNA片段后利用測序技術(shù)進(jìn)行定性或定量分析的方法，目前廣泛應(yīng)用于水生生物的檢測，是一種檢測速度快、特異性高的方法[31]。國外有研究[32]表明，eDNA 法可應(yīng)用于華支睪吸蟲及其中間宿主魚類的檢測。Alzaylaee等[33-34]在實驗室通過eDNA法檢測含有曼氏血吸蟲尾蚴的水體，發(fā)現(xiàn)eDNA 法可以準(zhǔn)確地檢測出曼氏血吸蟲尾蚴；在現(xiàn)場檢測中，部分水樣也可檢測到尾蚴。Sato 等[35]應(yīng)用eDNA 法在馬達(dá)加斯加血吸蟲病流行地區(qū)取樣檢測，在提取的水樣中檢測到曼氏血吸蟲尾蚴。Fornillos 等[36]應(yīng)用eDNA 法在菲律賓血吸蟲病流行區(qū)取樣檢測，可以檢測出血吸蟲及其中間宿主的存在，但無法確定水中是否存在尾蚴，認(rèn)為eDNA法對于血吸蟲病防治有著較好的應(yīng)用前景。

6 結(jié) 語

綜上，哨鼠法是目前現(xiàn)場工作較為常用的方法，缺點是時效性低，無法即時預(yù)警。C-6膜法結(jié)合擴散劑在實驗室中有良好的效果，但尚未在現(xiàn)場監(jiān)測中進(jìn)行效果評估，且使用的擴散劑會造成一定程度的水體污染。尾蚴富集法雖操作簡單方便，可以檢測到活體尾蚴，但在水體尾蚴密度低的情況下檢測效果不理想，還需進(jìn)一步優(yōu)化。仿生膜法檢測速度快但檢測過程相對復(fù)雜，不同材質(zhì)的仿生膜尾蚴收集效果存在差異。eDNA 法敏感性高、水樣采集便捷，但在血吸蟲病防治中的實際應(yīng)用效果尚未有系統(tǒng)性的研究，且檢測費用較高。

隨著我國消除血吸蟲病進(jìn)程的推進(jìn)，血吸蟲病流行區(qū)呈現(xiàn)低感染率和低感染度的態(tài)勢，這種低流行態(tài)勢對水體感染性監(jiān)測提出了更高要求，傳統(tǒng)檢測方法的敏感性已難以滿足防治需求。通過多學(xué)科交叉融合，利用分子生物學(xué)、計算機工程等先進(jìn)技術(shù)，研發(fā)敏感、特異、便捷且適宜現(xiàn)場應(yīng)用的血吸蟲水體感染性檢測技術(shù)，探索適合當(dāng)前防治工作需要的血吸蟲病監(jiān)測預(yù)警系統(tǒng)與監(jiān)測技術(shù)，提升我國血吸蟲病監(jiān)測系統(tǒng)的敏感性，是我國血吸蟲病消除工作待解決的重大課題[37]。