天津地區(qū)黃瓜中風(fēng)險(xiǎn)性食源性致病菌污染水平分析

于海濤，劉 娜，李瑞環(huán)，徐石勇，黃鳳軍，趙 新

（1.天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院 種質(zhì)資源與生物技術(shù)研究所，天津 300381；2.天津市東麗區(qū)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所，天津 300300）

隨著消費(fèi)者生活水平的提高以及日常飲食習(xí)慣的多樣化，食品安全問題日漸成為社會(huì)關(guān)注的焦點(diǎn)[1]。據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）統(tǒng)計(jì)，在全球范圍內(nèi)每年約6億人患食源性疾病，因其導(dǎo)致死亡的人數(shù)約42萬人[2]。研究表明，微生物也是我國(guó)食源性疾病的主要誘發(fā)因素，其潛在的食品安全隱患不容忽視[3-5]。

食源性致病菌在自然界分布廣泛，近幾年國(guó)內(nèi)外已發(fā)生多起由食源性致病菌引起的生物安全事件[6-11]。例如，2016年美國(guó)因黃瓜暴發(fā)沙門氏菌疫情[12]，導(dǎo)致至少907人感染，其中6人死亡，204人住院。2000年日本金黃色葡萄球菌腸毒素導(dǎo)致的“血印乳品”事件[13]，14 000多人受感染，國(guó)內(nèi)外金黃色葡萄球菌腸毒素引起的食物中毒每年都有發(fā)生[14]。由此可見食源性致病菌是引起食物中毒的重要因素，因此調(diào)查即食生鮮果蔬中的病原微生物顯得尤為重要。

黃瓜作為北方居民餐桌上常見的蔬菜，多以生食為主，因其營(yíng)養(yǎng)豐富，深得廣大消費(fèi)者的喜愛。由于其表面不光滑，紋路較多，很容易寄生各種細(xì)菌，另外黃瓜生長(zhǎng)期較短，成熟過程中需要的肥料、灌溉水和土壤也是黃瓜中的食源性致病菌的主要來源[15-19]。因此，加大對(duì)黃瓜及種植投入品中的食源性致病菌篩查也十分重要。

本研究通過采集天津地區(qū)生產(chǎn)環(huán)節(jié)和市場(chǎng)環(huán)節(jié)的黃瓜樣本，對(duì)其進(jìn)行沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌及大腸桿菌O157∶H7的測(cè)定，確定天津地區(qū)黃瓜的主要風(fēng)險(xiǎn)因子為金黃色葡萄球菌和沙門氏菌，由于國(guó)內(nèi)外至今暫未發(fā)布沙門氏菌的定量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，本研究?jī)H對(duì)有定量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)的金黃色葡萄球菌進(jìn)行監(jiān)測(cè)，通過應(yīng)用IPMP 2014對(duì)金黃色葡萄球菌構(gòu)建預(yù)測(cè)生長(zhǎng)模型[20]，通過@Risk6風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估軟件對(duì)其進(jìn)行QMRA污染水平分析[21-22]，最終提出合理性建議，保證消費(fèi)者的食用安全。

1 材料和方法

1.1 樣品采集

2017—2019年，在天津市西青區(qū)選擇2個(gè)黃瓜生產(chǎn)基地作為采樣點(diǎn)，按照無菌采樣原則采集60份黃瓜樣本及38份基質(zhì)、井水、營(yíng)養(yǎng)液等基地交叉污染樣本。并在天津市南開區(qū)、河西區(qū)、河北區(qū)、河?xùn)|區(qū)、西青區(qū)和東麗區(qū)的大型農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)，按無菌采樣原則隨機(jī)采集黃瓜樣本98份。以上樣品均用無菌袋封閉，放于低溫樣品箱中保存，在6 h內(nèi)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室，24 h內(nèi)完成檢測(cè)。

1.2 培養(yǎng)基與儀器設(shè)備

緩沖蛋白胨水（BPW），四硫磺酸鈉煌綠（TTB）增菌液，亞硒酸鹽胱氨酸（SC）增菌液，亞硫酸鉍（BS）瓊脂，HE瓊脂，木糖賴氨酸脫氧膽鹽（XLD）瓊脂，生化鑒定試劑盒；7.5%氯化鈉肉湯，血瓊脂平板，Baird-Parker瓊脂平板；李氏增菌肉體LB（LB1，LB2），1%鹽酸吖啶黃溶液，1%萘啶酮酸鈉鹽，PALCAM瓊脂，生化鑒定試劑盒；改良EC肉湯，改良山梨醇麥康凱瓊脂，大腸埃希氏菌O157顯色瓊脂，生化鑒定試劑盒等均購(gòu)自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司。

拍擊式均質(zhì)器（上海之信儀器有限公司），全自動(dòng)高壓滅菌鍋（日本YAMATO有限公司），電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒有限公司），電子天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司），電動(dòng)移液器（Thermo有限公司），生物安全柜（ESCO公司），超凈工作臺(tái)（蘇州金燕凈化設(shè)備有限公司），OLYMPUS CX31顯微鏡（奧林巴斯公司）。

1.3 方法

1.3.1 致病菌篩查 黃瓜及基地交叉污染樣本中沙門氏菌，金黃色葡萄球菌，單核細(xì)胞增生李斯特氏菌及大腸桿菌O157∶H7的分離鑒定分別基于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 4789.4—2016，GB/T 4789.10—2016，GB/T 4789.30—2016，GB/T 4789.36—2016[23-26]。

1.3.2 膳食問卷調(diào)查 針對(duì)天津地區(qū)的居民設(shè)計(jì)1份調(diào)查問卷，采用隨機(jī)發(fā)放的原則選取100人進(jìn)行膳食調(diào)研，問題包括購(gòu)買黃瓜后當(dāng)天食用量、存放溫度、存放時(shí)間、家庭用餐人數(shù)、人均每餐食用量、人均每星期黃瓜食用次數(shù)、常去攤位日銷量，由此了解天津地區(qū)居民對(duì)黃瓜的消費(fèi)情況。

1.3.3 預(yù)測(cè)模型構(gòu)建 無菌環(huán)境下將黃瓜切成小丁，紫外滅菌30 min，稱取20 g于無菌均質(zhì)袋中，再用無菌吸管吸取1 mL濃度為2×104CFU·mL-1的金黃色葡萄球菌均勻的接種于均質(zhì)袋中的黃瓜丁上，使黃瓜丁的帶菌量為1×103CFU·mL-1。將接種后的黃瓜丁分別放于10、15、20、25、30、35℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，按照預(yù)定時(shí)間間隔取樣，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。應(yīng)用IPMP 2014中的Huang Model對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行生長(zhǎng)曲線的擬合，建立一級(jí)預(yù)測(cè)模型，其中一級(jí)預(yù)測(cè)模型（Huang Model）的表達(dá)式為：

式中，t，時(shí)間(h)；Y(t)，t時(shí)的菌數(shù)(ln CFU·g-1)；Y0，初始菌數(shù)(ln CFU·g-1)；Ymax，最大菌數(shù)(ln CFU·g-1)；μmax，最大比生長(zhǎng)速率(ln CFU·g-1·h-1)；λ，延滯期時(shí)間（h）；α，延滯期變異系數(shù)為4。

應(yīng)用IPMP 2014中的Arrhenius-type對(duì)金黃色葡萄球菌的最大比生長(zhǎng)速率與溫度進(jìn)行生長(zhǎng)曲線的擬合，建立二級(jí)預(yù)測(cè)模型，其中二級(jí)預(yù)測(cè)模型（Arrhenius-type）的表達(dá)式為：

式中，μmax，最大比生長(zhǎng)速率(ln CFU·g-1·h-1)；T，特定生長(zhǎng)溫度(℃)；R，氣體常數(shù)（8.134 J·mol-1）；△G’，與細(xì)菌生長(zhǎng)有關(guān)的一種動(dòng)能；a和n，模型的參數(shù)。

1.3.4 污染水平分析 為便于計(jì)算，當(dāng)黃瓜試樣中金黃色葡萄球菌濃度低于最低檢出限時(shí)，假設(shè)金黃色葡萄球菌菌量為最低檢出限的50%(5 CFU·g-1)。定性陽性，而定量為陰性的黃瓜試樣，實(shí)際待菌量低于10 CFU·g-1時(shí)，假設(shè)金黃色葡萄球菌菌量為10 CFU·g-1。結(jié)合IPMP 2014構(gòu)建的一級(jí)模型、二級(jí)模型及膳食調(diào)查結(jié)果，獲得不同溫度條件下金黃色葡萄球菌的最大比生長(zhǎng)速率。應(yīng)用@Risk 6風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估軟件設(shè)置變量參數(shù)，進(jìn)行黃瓜中金黃色葡萄球菌定量風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，結(jié)合現(xiàn)有數(shù)據(jù)分析黃瓜中金黃色葡萄球菌污染水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 篩查結(jié)果

對(duì)采集的黃瓜樣本及基地交叉樣本進(jìn)行沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌及大腸桿菌O157∶H7篩查，經(jīng)檢驗(yàn)僅市場(chǎng)環(huán)節(jié)的黃瓜中金黃色葡萄球菌和沙門氏菌有不同程度的檢出，金黃色葡萄球菌檢出比例為2/196，污染量分別為210、3 000 CFU·g-1；沙門氏菌檢出比例為1/196。致病菌篩查結(jié)果如表1所示。

表1 天津地區(qū)黃瓜中致病菌篩查結(jié)果

2.2 膳食調(diào)查結(jié)果

根據(jù)天津地區(qū)居民食用黃瓜的消費(fèi)習(xí)慣，并結(jié)合@Risk 6軟件對(duì)風(fēng)險(xiǎn)因素的分析，設(shè)置7道問題，隨機(jī)抽取100人進(jìn)行調(diào)研，具體匯總結(jié)果如表2。

表2 問卷調(diào)研結(jié)果匯總

2.3 預(yù)測(cè)模型構(gòu)建

通過建立不同溫度條件下黃瓜中金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)模型，每隔一定的時(shí)間進(jìn)行沙門氏菌定量檢測(cè)，獲得其在10、l5、20、25、30、35℃下的生長(zhǎng)數(shù)據(jù)，應(yīng)用IPMP軟件進(jìn)行擬合，以定量描述特定環(huán)境條件下對(duì)金黃色葡萄球菌在黃瓜上的生長(zhǎng)、殘存和死亡動(dòng)態(tài)，從而對(duì)金黃色葡萄球菌的存活情況做出較為科學(xué)的預(yù)測(cè)，為監(jiān)控即食黃瓜的食品安全和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供參考，為下一步的風(fēng)險(xiǎn)概率分析提供了技術(shù)支撐，具體模型見圖1、圖2。

圖1 黃瓜中金黃色葡萄球菌二級(jí)模型

圖2 黃瓜中金黃色葡萄球菌一級(jí)模型

2.4 污染水平分析

研究表明，食物中金黃色葡萄球菌的濃度大于105CFU·g-1時(shí)即可產(chǎn)生致病的腸毒素[27]，引發(fā)食物中毒，出現(xiàn)嘔吐、惡心、腹痛、腹瀉等癥狀。因此，把105CFU·g-1認(rèn)為導(dǎo)致金黃色葡萄球菌食物中毒的最小濃度。

結(jié)合黃瓜中金黃色葡萄球菌的篩查結(jié)果、家庭食用黃瓜的膳食調(diào)研結(jié)果、金黃色葡萄球菌食物中毒診斷標(biāo)準(zhǔn)（105CFU·g-1）以及金黃色葡萄球菌預(yù)測(cè)模型參數(shù)，設(shè)置黃瓜中金黃色葡萄球菌QMRA污染水平分析，模型中的參數(shù)分布均以@Risk 6軟件的語法設(shè)立，具體見表3。經(jīng)@Risk 6軟件10 000次迭代模擬天津地區(qū)黃瓜食用時(shí)金黃色葡萄球菌的最終污染量/概率分布為86.0%在0.00～5.00 log CFU·g-1，超過中毒診斷標(biāo)準(zhǔn)5.00 log CFU·g-1的風(fēng)險(xiǎn)概率為14.0%，具體見圖3。

表3 污染水平QMRA模型

圖3 黃瓜中金黃色葡萄球菌的最終污染量/概率分布

針對(duì)天津地區(qū)黃瓜的初始污染水平篩查結(jié)果，應(yīng)用@Risk 6風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估軟件，筆者發(fā)現(xiàn)，貯藏溫度、貯藏時(shí)間、最大生長(zhǎng)量與污染比例/概率分布的相關(guān)系數(shù)依次為0.73、0.61、0.03，其中貯藏溫度/概率分布相關(guān)性最大，其次為貯藏時(shí)間，如圖4所示。

圖4 黃瓜中金黃色葡萄球菌的最終污染量/概率分布相關(guān)系數(shù)

為了降低風(fēng)險(xiǎn)概率，參考最終污染量/概率分布相關(guān)系數(shù)，控制關(guān)鍵變量，如將貯藏時(shí)間嚴(yán)格控制在24 h食用完畢，經(jīng)@Risk 6軟件10 000次迭代，模擬天津地區(qū)居民食用黃瓜時(shí)金黃色葡萄球菌的最終污染量/概率分布為94.0 %在5.00 log CFU·g-1以下，超過中毒診斷標(biāo)準(zhǔn)5.00 log CFU·g-1的風(fēng)險(xiǎn)概率為6.0%，具體見圖5；如將貯藏溫度嚴(yán)格控制在冰箱6℃保存，金黃色葡萄球菌的最終污染量/概率分布為99.0%在5.00 log CFU·g-1以下，具體見圖6。因此，控制相關(guān)性最大的貯藏溫度，可有效地保證天津地區(qū)的黃瓜在現(xiàn)有100份居民食用習(xí)慣調(diào)研數(shù)據(jù)下的食用安全性。

圖5 黃瓜24 h食用完畢黃瓜中金黃色葡萄球菌的最終污染量/概率分布

圖6 黃瓜冰箱6℃貯藏方式下金黃色葡萄球菌的最終污染量/概率分布

3 結(jié)論與討論

近年來，由食源性致病菌引起的食物中毒事件不斷增加，食源性疾病日漸成為威脅人們健康和生命安全的關(guān)鍵因素，國(guó)內(nèi)外一些實(shí)驗(yàn)室已對(duì)食源性致病菌的定量風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估進(jìn)行試驗(yàn)[28-30]。本研究通過對(duì)天津市生產(chǎn)環(huán)節(jié)、市場(chǎng)環(huán)節(jié)的黃瓜進(jìn)行沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌及大腸桿菌O157∶H7的檢測(cè)，金黃色葡萄球菌和沙門氏菌有不同程度的檢出，檢出比例分別為2/158和1/158，其他2種菌均未檢出，確定天津地區(qū)黃瓜中的主要風(fēng)險(xiǎn)因子為金黃色葡萄球菌和沙門氏菌。雖檢出比例不高，但對(duì)天津地區(qū)即食生鮮果蔬的食品安全來說仍存在一定的風(fēng)險(xiǎn)隱患。

本研究通過對(duì)生產(chǎn)環(huán)節(jié)和市場(chǎng)環(huán)節(jié)的黃瓜進(jìn)行食源性致病菌的篩查，并對(duì)主要風(fēng)險(xiǎn)因子進(jìn)行污染水平分析，其試驗(yàn)數(shù)據(jù)可為居民食用提供參考。但還缺少對(duì)種植、運(yùn)輸過程中金黃色葡萄球菌的評(píng)估，不能對(duì)黃瓜“農(nóng)田到餐桌”的全程進(jìn)行定量風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，在未來的試驗(yàn)中還需進(jìn)一步完善。

通過應(yīng)用@Risk6風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估軟件，設(shè)置黃瓜中金黃色葡萄球菌QMRA污染水平分析，筆者發(fā)現(xiàn)，貯藏溫度與最終污染量/概率分布相關(guān)性最大，其次為貯藏時(shí)間。因此，建議居民最好在購(gòu)買黃瓜后全部冰箱低溫保存，以降低微生物的生長(zhǎng)速度，有效降低居民食用黃瓜感染金黃色葡萄球菌的風(fēng)險(xiǎn)概率；其次，如果不能滿足冰箱保存的條件，建議居民在購(gòu)買后24 h內(nèi)食用完畢，以保障居民的食用安全。