小麥秸稈溶解性有機質(zhì)分級組分的分子光譜及對恩諾沙星的吸附作用

周向軍，童 霞

（1.天水師范學(xué)院生物工程與技術(shù)學(xué)院，甘肅 天水 741001；2.甘肅省農(nóng)業(yè)固體廢棄物資源化利用重點實驗室，甘肅 天水 741001）

溶解性有機質(zhì)（Dissolved Organic Matter,DOM）是指能溶解于水、酸或堿溶液，且能通過0.45 μm濾膜的異質(zhì)性有機化合物[1]。作為農(nóng)作物秸稈重要的有機組分之一，DOM不僅具有復(fù)雜多樣的化學(xué)結(jié)構(gòu)和環(huán)境行為，而且其高度的流動性和化學(xué)活性，通?？蓪r(nóng)田土壤系統(tǒng)的生物、化學(xué)過程等產(chǎn)生重要影響[2]。小麥秸稈還田腐解釋放的DOM，一方面可作為作物生長的碳源和能量來源，以及改變土壤微生物群落和土壤碳循環(huán)等，另一方面也不可避免地與土壤重金屬和抗生素類環(huán)境污染物發(fā)生相互作用[3]。恩諾沙星（Enrofloxacin,ENR）是一種氟喹諾酮類抗菌藥物，目前被廣泛用于預(yù)防和治療畜禽、水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)存在的微生物感染[4]。由于ENR具有吸收率低、半衰期長等特性，大部分仍以原藥形式進入食物鏈和生態(tài)系統(tǒng)。因此，ENR將不可避免地與DOM發(fā)生相互作用并影響ENR的遷移、轉(zhuǎn)化等。

目前，國內(nèi)外有關(guān)農(nóng)作物秸稈的相關(guān)研究，主要集中在秸稈堆肥腐解過程、DOM結(jié)構(gòu)特性、光化學(xué)活性以及秸稈生物炭對環(huán)境污染物控制等方面。雷琬螢等[5]對農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中有機物料腐解過程進行了綜述，指出紅外光譜、核磁共振波譜、熒光光譜等光譜技術(shù)是目前表征有機物料腐解特征的主要手段之一，同時也揭示了有機物料質(zhì)量、組分、化學(xué)結(jié)構(gòu)以及環(huán)境因素等是影響其腐解的主要因素。Gao等[6]從熒光光譜角度研究了小麥秸稈添加對鎘污染土壤DOM的影響。結(jié)果表明，溶解性有機碳與土壤鎘含量呈顯著正相關(guān)，且類胡敏酸、類富里酸和類色氨酸的相對含量變化能夠預(yù)示小麥秸稈DOM組成。陳天涯等[7]對老化玉米秸稈生物炭吸附諾氟沙星進行了研究。結(jié)果表明，老化可不同程度地影響生物炭的理化性質(zhì)和對諾氟沙星的吸附性能。Liu等[8]研究了小麥秸稈DOM介導(dǎo)的As(III)光氧化機理。結(jié)果表明，小麥秸稈DOM介導(dǎo)的羥自由基是As(III)光氧化的主要因素。余旭芳等[9]對小麥秸稈堆肥過程中水溶性有機物的結(jié)構(gòu)組成和變化等進行了研究，結(jié)果表明，小麥秸稈堆肥過程是微生物降解、化學(xué)聚合和水解等因素共同的作用，且在堆肥后期DOM腐殖化程度較高。目前，DOM結(jié)構(gòu)特征的研究主要集中在水體和土壤環(huán)境，缺少針對農(nóng)田土壤環(huán)境的相關(guān)研究，盡管有少量秸稈源DOM結(jié)構(gòu)特征的相關(guān)報道，但大多局限于DOM混合組分，有關(guān)DOM分級組分的光譜學(xué)特性和熒光組分解析，特別是小麥秸稈在不同腐解階段釋放的疏水酸性組分（HOA）、疏水堿性組分（HOB）、親水性組分（HIM）、酸不溶組分（AIM）和疏水中性組分（HON），其光譜學(xué)特性、熒光組分及對土壤吸附ENR的影響等未見報道。

DOM分離、富集和純化技術(shù)主要有：膜過濾、非離子大孔樹脂、離子交換樹脂、氧化鋁/活性炭吸附法等。其中，非離子大孔樹脂法[10]具有pH范圍寬、樹脂可再生、負載量較高、對DOM選擇性強且效率高等優(yōu)點，是DOM分級分離的最有效手段之一。DOM表征技術(shù)主要有：光譜學(xué)技術(shù)、色譜技術(shù)、質(zhì)譜技術(shù)、熱力學(xué)技術(shù)、X射線能譜技術(shù)、原子力顯微鏡和電鏡技術(shù)等。其中，多光譜聯(lián)用技術(shù)是DOM表征的主要手段，與色譜、質(zhì)譜等技術(shù)相比較，其具有簡便快捷、靈敏度高、選擇性強和不破壞樣品等優(yōu)點，可迅速實現(xiàn)DOM組分的定性表征和定量分析[11]，并且可以提供比單一光譜更為詳細的結(jié)構(gòu)信息。如紫外光譜可用于研究DOM共軛雙鍵的吸收狀況，揭示DOM的結(jié)構(gòu)組成、性質(zhì)和來源[12]；紅外光譜可用于分析DOM官能團和化學(xué)鍵組成；三維熒光光譜用于表征經(jīng)激發(fā)后可發(fā)射熒光的DOM組分[13]，包括類胡敏酸、類富里酸和類蛋白質(zhì)等；同步熒光光譜能獲得較為清晰、獨特甚至是三維熒光光譜難以獲得的結(jié)構(gòu)信息[14]，其峰形、帶寬、峰位置不僅可隨波長差Δλ發(fā)生變化，而且DOM的熒光團也可以通過較高的波長差Δλ得以區(qū)分[15]。因此，本研究利用DAX-8樹脂分級分離得到小麥秸稈不同腐解階段的5種DOM組分，采用紫外-可見光譜、三維熒光光譜和同步熒光光譜法進行光譜分析和熒光組分解析并研究其對ENR的吸附作用，以期為秸稈還田后用于降低抗生素類污染物的遷移等提供基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 供試材料及儀器設(shè)備

小麥秸稈風(fēng)干后粉碎過20目，粒徑約1 mm，備用。Supelite DAX-8樹脂購自Sigma公司，其余試劑均為分析純。

UV-2600紫外分光光度計：島津（中國）有限公司；F-7000熒光分光光度計：日立（中國）有限公司；Centrifuge 5810R離心機：德國艾本德公司；YZ1515x蠕動泵：蘭格恒流泵有限公司。

1.2 研究方法

1.2.1 菌液制備 試驗土壤為天水市秦州區(qū)農(nóng)田黃綿土，采樣方法為五點取樣法，棄去雜物后過20目篩，低溫保存。稱取15.0 g新鮮土壤于錐形瓶中，加入100 mL蒸餾水分散均勻。120 r·min-1室溫振蕩5 h，4℃靜置過夜。上清液4 000 r·min-1離心10 min，濾液即為菌液[16]。

1.2.2 小麥秸稈腐解 稱取5.0 g小麥秸稈粉末于錐形瓶中，分別加入30.0 g石英砂和50.0 mL蒸餾水，分散均勻后加入10.0 mL菌液，保鮮膜封口，頂部用針扎空。25℃和120 r·min-1恒溫避光振蕩。第0、5、10、15、25、35、50天分別取樣5.0 mL并及時補充水分。15.0 mL樣液中加入15.0 mL蒸餾水，混勻后用8層紗布過濾，4℃、8 000 r·min-1離心10 min，上清液經(jīng)0.45 μm濾膜抽濾，即為DOM[17]。

1.2.3 DOM組分提取DAX-8樹脂預(yù)處理：將DAX-8樹脂以0.1 mol·L-1NaOH浸泡24 h，期間更換浸泡液共5次，棄去浸泡液后用超純水小心清洗3次，每次30 min，再用少量甲醇替換超純水，65℃索氏抽提24 h，最后以超純水替換甲醇清洗10次。

DAX-8濕法裝柱：柱中加入2 cm超純水，將上述預(yù)處理的DAX-8樹脂輕輕攪成漿狀加入柱中。液面始終要高于樹脂2～5 cm，用玻璃棒輕輕攪動除去氣泡。先以8倍柱體積的0.1 mol·L-1NaOH洗柱，再以5倍柱體積的超純水過柱，然后以3倍柱體積的0.1 mol·L-1HCl洗柱，最后以10倍柱體積的超純水淋洗過柱，重復(fù)2～3次。

DOM分級分離[18]：（1）控制1 mol·L-1流速使DOM樣品經(jīng)過DAX-8樹脂，以2倍柱體積的超純水洗脫，收集的洗脫液即為非吸附成分。（2）以0.5倍柱體積的0.1 mol·L-1HCl和1.5倍柱體積0.01 mol·L-1HCl反洗，收集反洗液，即為HOB。（3）將第一步形成的非吸附成分調(diào)至pH 2.0，離心后將沉淀物用0.1 mol·L-1NaOH溶解，即為AIM。上清液過DAX-8樹脂，以1倍柱體積的0.01 mol·L-1HCl淋洗，濾出液即為HIM。（4）用0.5倍柱體積的0.1 mol·L-1NaOH和1.5倍柱體積的超純水反洗，收集反洗液，即為HOA。（5）將DAX-8樹脂抽干并在室溫干燥過夜，以甲醇索氏抽提，溶于甲醇的有機物即為HON。

1.2.4 紫外-可見光譜 以超純水為空白，在250～600 nm內(nèi)測定5種DOM組分的紫外吸收值，波長間隔為0.5 nm。以波長橫坐標(biāo)，紫外吸收值為縱坐標(biāo)，繪制紫外-可見圖譜。

1.2.5 同步熒光光譜 以超純水為空白，設(shè)定光源為150W氙燈，PMT電壓700V，固定波長差Δλ=60nm，掃描速度1 200nm·min-1，在250～500 nm范圍內(nèi)掃描同光熒光光譜。

1.2.6 三維熒光光譜 以超純水為空白，Ex為220～400 nm，Em為250～550 nm，波長步長10 nm，狹縫5 nm，掃描速度1 200 nm·min-1，光電倍增管電壓700 V。樣品稀釋以避免高濃度DOM組分內(nèi)濾效應(yīng)的干擾，同時以超純水作空白去除拉曼散射[19]，利用origin尋找各DOM組分的熒光峰。

1.2.7 ENR吸附率的計算 分別吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL的10 μg·mL-1的ENR，用蒸餾水補充至3.0 mL，在273 nm處測定OD值。以ENR濃度(μg·mL-1)為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線[20]。標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.088 6x+0.000 2，R2=0.999 3，y為OD273，x為濃度(μg·mL-1)。由于AIM組分的體積不足以進行吸附試驗，故僅選擇其他4種DOM組分。10.0 mL DOM加入100 μg·mL-1的ENR 1.0 mL，混勻后加入0.20 g黃綿土，室溫避光，120 r·min-1吸附24 h達到平衡后，8 000 r·min-1離心10 min，在273 nm測定OD值。吸附率（%）計算公式如下：

式中，η為去除率，%；c0和ce分別為初始和平衡時ENR濃度，μg·mL-1。

1.2.8 統(tǒng)計分析與作圖 采用origin 2021作圖，數(shù)據(jù)重復(fù)3次且以x±s表示。利用SPSS 16.0中的“LSD”法進行統(tǒng)計分析，P<0.05為顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 DOM的紫外-可見光譜

5種DOM組分的紫外可見光譜見圖1。由圖1可以看出，隨著腐解時間的不斷延長，5種DOM組分的紫外可見光譜隨著波長的增加而不同程度地降低，整體呈寬而鈍的吸收峰，不具有明顯的特征性吸收峰。5種DOM組分均在210～215nm范圍內(nèi)存在強吸收峰，此時儀器噪音對吸收強度影響較大，原因歸屬為體系中大量無機離子如NO3-等吸收[21-22]。HOA、AIM和HON組分在280 nm附近均存在不同程度的吸收峰，該吸收峰歸屬為蛋白質(zhì)、木質(zhì)素磺酸及其衍生物中苯環(huán)上的π電子躍遷，但腐解第5天后HIM和HOB組分在280 nm附近的吸收峰趨于完全消失。當(dāng)腐解第0天時，HOA和HIM組分在330～360 nm范圍內(nèi)還存在一個極弱的肩峰，這表明腐解起始時HOA和HIM組分可能存在芳香醛酮類化合物、脂肪醛酮或α、β不飽和羰基化合物[23]。隨著腐解的進行，HOB組分的吸收值接近于零，這表明其被土壤微生物徹底降解或轉(zhuǎn)化為其他化合物。HON組分相對較為復(fù)雜，當(dāng)腐解第5天時在225～235 nm范圍內(nèi)出現(xiàn)了明顯的紫外吸收峰，歸屬為酰胺類化合物或其衍生物。隨后，該峰逐漸形成肩峰并最終趨于消失。

圖1 DOM分級組分的紫外-可見光譜

2.2 DOM的同步熒光光譜

5種DOM組分的同步熒光光譜見圖2。同步熒光光譜的峰位置取決于DOM芳環(huán)結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，Ex=200～250 nm歸 屬 為 類 酪 氨 酸，Ex=250～300 nm為類蛋白質(zhì)，Ex=300～380 nm為類富里酸，Ex=380～550 nm為類胡敏酸[15]。由圖2可以看出，5種DOM組分在230 nm附近不同程度地存在類酪氨酸熒光峰，這充分表明同步熒光光譜可以識別表1中三維熒光光譜難以識別的類酪氨酸。

由圖2-A可以看出，當(dāng)腐解第0天時，HOA的4個 主 要 熒 光 峰 位 于238 nm、288 nm、335～337 nm和375～377 nm，前兩者分別歸屬為類酪氨酸和類蛋白質(zhì)物質(zhì)，后兩者歸屬為類富里酸物質(zhì)。其中，288 nm的熒光峰常歸因于具有1個芳環(huán)結(jié)構(gòu)的熒光團，335～337 nm的熒光峰常含有2個共軛芳環(huán)。當(dāng)腐解第5天時，288 nm的熒光峰藍移至280～284 nm，335～337 nm的熒光峰藍移至315～320 nm且形成肩峰，375～377 nm的熒光峰未發(fā)生明顯變化。當(dāng)腐解第10～50天時，335～337 nm的熒光峰完全消失，288 nm和375～377 nm的熒光峰發(fā)生輕微紅移；由圖2-B可以看出，當(dāng)腐解第0天時，HIM的熒光峰位于276～280 nm、335～342 nm，分別歸屬為類蛋白質(zhì)和類富里酸。在腐解第5～50天內(nèi)，276～280 nm的熒光峰逐漸紅移并傾向于形成肩峰，335～342 nm的熒光峰形基本保持不變；由圖2-C可以看出，當(dāng)腐解第0天時，AIM的熒光峰類似于HOA，位于286～288 nm、330～333 nm和375～378 nm(肩峰)，歸屬為類蛋白質(zhì)和類富里酸。在腐解第5～50天內(nèi)，286～288 nm的熒光峰未發(fā)生明顯變化，330～333 nm的熒光峰傾向于形成肩峰或甚至完全消失，375～378 nm的肩峰逐漸形成明顯的熒光峰并最終發(fā)生紅移；由圖2-D可以看出，當(dāng)腐解第0天時，HOB的熒光峰位于275～280 nm和370～385 nm，歸屬為類蛋白質(zhì)和類富里酸。當(dāng)腐解第5天時，275～280 nm的熒光峰發(fā)生紅移，325～345 nm和345～375 nm出現(xiàn)較寬的熒光峰，這表明類富里酸物質(zhì)不斷被微生物降解。當(dāng)腐解第10～50天時，HOB的熒光峰基本保持不變；由圖2-E可以看出，當(dāng)腐解第0～10天時，HON的熒光峰約在280 nm附近，歸屬為類蛋白物質(zhì)，并在腐解第20天后紅移至290 nm附近。同時在325～340 nm和370～380 nm范圍內(nèi)出現(xiàn)極弱的熒光峰，這表明此時HON組分中類富里酸含量極低。

圖2 DOM分級組分的同步熒光光譜

2.3 DOM的三維熒光光譜

三維熒光光譜克服了普通熒光光譜僅能給出寬而無特征的熒光峰，以及同步熒光光譜易受拉曼散射影響等缺陷[27]。根據(jù)熒光峰位置[28-29]，DOM的三維熒光光譜分為5個區(qū)域：類酪氨酸蛋白質(zhì)（Ex/Em=220～250 nm/280～330 nm）、類色氨酸蛋白質(zhì)（Ex/Em=220～250 nm/330～370 nm）、類富里酸（Ex/Em=220～250 nm/370～550 nm）、微生物代謝產(chǎn)生的類蛋 白（Ex/Em=250～400 nm/280～370 nm）和類胡敏酸（Ex/Em=＞250 nm/370～550 nm）。不同腐解過程DOM的熒光峰位置和熒光類型見表1。

表1 不同腐解過程DOM的熒光峰位置和熒光類型

在腐解第0～5天，HOA組分以類胡敏酸分解為主，當(dāng)腐解第5天后，類富里酸不斷團聚形成類胡敏酸；在腐解第0～5天，HOB組分釋放的類蛋白和類富里酸團聚形成類胡敏酸，隨后類胡敏酸被土壤微生物分解形成類富里酸，并在腐解第25天后開始轉(zhuǎn)化為類胡敏酸；在腐解第0～10天時，HON組分以微生物代謝產(chǎn)生的類蛋白為主，當(dāng)腐解第15天后逐漸轉(zhuǎn)化形成類富里酸和類胡敏酸混合組分，隨后類富里酸進一步團聚形成類胡敏酸物質(zhì)；在腐解第0～10天，AIM組分以類胡敏酸為主，腐解第15天后類胡敏酸首先分解形成類蛋白物質(zhì)并進一步被降解而消失，腐解第50天時重新形成類胡敏酸；在腐解第0天，HIM組分以類蛋白物質(zhì)為主，隨后被徹底分解或在腐解體系中轉(zhuǎn)化為其他化合物，并在腐解第35天后形成類胡敏酸物質(zhì)。

2.4 DOM對ENR吸附率的影響

4種DOM組分對ENR吸附率的影響見圖3。在腐解第0～50天范圍內(nèi)，4種DOM組分對土壤吸附ENR的影響均呈“W”型波動趨勢，且在不同腐解過程中其對土壤吸附ENR的影響程度不同。在腐解第0～5天，4種DOM組分均顯著降低了土壤吸附ENR的能力（P＜0.05）。在腐解第5～10天，HOA和HOB組分對土壤吸附ENR的影響不顯著（P＞0.05），但HON和HIM組分顯著增加了土壤吸附ENR的能力（P＜0.05）。在腐解第10～15天，除HIM組分外，HOA、HOB和HON組分顯著增加了土壤吸附ENR的能力（P＜0.05）。在腐解第15～25天，除HOA和HOB組分外，HON和HIM組分顯著增加了其對土壤吸附ENR的能力（P＜0.05）。在腐解第25～35天，4種DOM組分均顯著降低了其對土壤吸附ENR的影響（P＜0.05）。在腐解第35～50天，除HOB組分外，HOA、HON和HIM組分對土壤吸附ENR的影響顯著（P＜0.05）。

圖3 DOM組分對土壤吸附ENR的影響

3 結(jié)論與討論

DAX-8樹脂可用于小麥秸稈DOM組分的分級分離，共得到HOA、HOB、HIM、HON和AIM共5個組分。5種DOM組分結(jié)構(gòu)存在一定的差異性，其紫外-可見吸收值均隨著波長的增加而降低。利用同步熒光光譜可以識別三維熒光光譜難以分辨的部分類蛋白質(zhì)熒光峰。在腐解第0～50天范圍內(nèi)，HOA組分由類蛋白物質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)轭惡羲嵛镔|(zhì)，而HIM、HOB、AIM和HON組分由類蛋白質(zhì)逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)轭惖鞍着c類胡敏酸物質(zhì)共存。在不同腐解階段，5種DOM組分的三維熒光峰類型和位置有所不同，但均傾向于在腐解后期團聚成類胡敏酸物質(zhì)；隨腐解時間的延長，4種DOM組分對恩諾沙星的吸附作用呈波動趨勢，且不同腐解階段的影響作用不同。

通過紫外-可見光譜筆者發(fā)現(xiàn)，在不同腐解階段，5種DOM組分的紫外-可見光譜峰形具有一定的差異性，這說明DAX-8樹脂法可用于分級分離小麥秸稈DOM。研究發(fā)現(xiàn)，由于DOM結(jié)構(gòu)中不同生色團的吸收光譜之間具有相互重疊性，以及生色團的電子供體和電子受體間存在相互作用等原因[30]，5種DOM組分的紫外-可見光譜也具有一定的相似性。研究還發(fā)現(xiàn)，5種DOM組分的紫外-可見吸收值幾乎均隨著波長的增加而降低，該研究結(jié)果與余旭芳等[9]關(guān)于小麥秸稈DOM組分的紫外-可見光譜形狀的研究結(jié)果相似。通過同步熒光光譜筆者發(fā)現(xiàn)，在三維熒光光譜中難以分辨的部分熒光峰，可在同步熒光光譜中得以識別，如在腐解第0～50天范圍內(nèi)，5種DOM組分幾乎均在285～295 nm范圍內(nèi)存在類蛋白熒光峰，但三維熒光光譜中僅在部分腐解階段和部分DOM組分中存在類蛋白熒光峰。再如，在同步熒光光譜中，筆者發(fā)現(xiàn)HIM組分可產(chǎn)生3個熒光峰，但在三維熒光光譜中并未完全檢測到這一現(xiàn)象，這表明同步熒光光譜可以提供三維熒光光譜難以提供的DOM結(jié)構(gòu)信息，可作為三維熒光光譜信息的有效補充。通過三維熒光光譜筆者發(fā)現(xiàn)，與腐解第0天相比較，HIM和AIM組分在腐解中期、后期的熒光峰存在消失現(xiàn)象，原因可能是HIM、AIM組分分別作為親水性組分和酸不溶組分的這一特性決定了其在秸稈源DOM中的含量相對較少，同時也與上述2種DOM組分與其他化合物發(fā)生相互作用引起的熒光猝滅有關(guān)[31]。在腐解后期，5種DOM組分傾向于團聚形成分子量較大的類胡敏酸物質(zhì)，這一結(jié)果也與韋夢雪等[32]關(guān)于水稻、油菜秸稈還田腐解過程傾向于形成類腐殖質(zhì)物質(zhì)的結(jié)論相一致。研究還發(fā)現(xiàn)，5種DOM腐解過程中熒光峰類型、位置等均發(fā)生不同程度地變化，這表明小麥秸稈腐解過程不同程度地改變了其熒光組成。