Fe3O4納米酶對(duì)潛指印中物質(zhì)信息的可視化識(shí)別

黃 銳, 周 毅

(1.西南政法大學(xué)刑事偵查學(xué)院,重慶 401120;2.重慶高校物證技術(shù)工程研究中心,重慶 401120;3.重慶高校刑事技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,重慶 401120)

0 引言

汗?jié)撝赣?潛指印),即通過手指汗孔分泌的汗液在載體上形成的實(shí)際存在而裸眼不易見的指印,是犯罪現(xiàn)場(chǎng)和日常生活中“常見”的指印遺留形態(tài)。汗液作為人體的重要代謝產(chǎn)物,包含了諸多代謝物質(zhì)[1];根據(jù)洛卡德物質(zhì)交換原理,指印中保留了接觸物的信息,即“觸物留痕”[2]。這兩個(gè)因素使得無處不在的潛指印不僅包含了認(rèn)定遺留人身份的指紋二維形態(tài)信息,還隱藏了更高維的物質(zhì)信息。在顯現(xiàn)潛指印形態(tài)的同時(shí),挖掘其中的物質(zhì)信息可進(jìn)一步推斷更多的個(gè)體信息,如指印遺留時(shí)間、指印遺留人是否患病等[3]。另外,當(dāng)指印紋線模糊殘缺時(shí),對(duì)其中物質(zhì)信息的挖掘具有重要意義。

潛指印中的物質(zhì)分為外源性物質(zhì)、內(nèi)源性物質(zhì)、半內(nèi)源性物質(zhì)[4]。外源性物質(zhì)為“觸物留痕”所產(chǎn)生的指印中本身不存在的殘留物;內(nèi)源性物質(zhì)為指尖汗液中自然的分泌物;半內(nèi)源性物質(zhì)為吸食香煙、毒物或藥物等后指尖皮膚異常分泌的代謝物。對(duì)指印中物質(zhì)成分的挖掘主要集中在外源性和半內(nèi)源性物質(zhì),如Lees H等人對(duì)不同載體上指印中10種爆炸殘留物進(jìn)行了定性和定量分析[5];其中內(nèi)源性物質(zhì)多是用于保證指印紋線的顯現(xiàn)和指印遺留時(shí)間的推斷,如Xu等人以指印中內(nèi)源的蛋白質(zhì)/多肽分泌物為基礎(chǔ),研究了指印化學(xué)成像和模式識(shí)別的交叉融合[6];Girod等人使用傅里葉變換紅外光譜(FTIR)研究了指印遺留時(shí)間[7]。然而,現(xiàn)有的關(guān)于指印中物質(zhì)信息挖掘的技術(shù)方法多是借助大型儀器,如光譜法、質(zhì)譜法、電化學(xué)法等[3],這些技術(shù)雖然準(zhǔn)確度和靈敏度較高,但其技術(shù)成本高、操作流程相對(duì)復(fù)雜,使其大多滯留于科研試驗(yàn),并未給偵查實(shí)踐帶來實(shí)質(zhì)性的提升。因此,亟需開發(fā)出一種低成本、高效率的指印物質(zhì)信息識(shí)別技術(shù)。

2007年,我國科學(xué)家首次發(fā)現(xiàn)無機(jī)材料Fe3O4在納米尺度呈現(xiàn)出類似天然酶——辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)的生物活性,其催化效率與天然酶相近,并首次提出納米酶的概念[8]。納米酶是一類既有納米材料理化特性,又蘊(yùn)含酶學(xué)催化功能的新一代人工模擬酶。與傳統(tǒng)的模擬酶相比,納米酶具有更高的催化效率,其還具備對(duì)熱、酸和堿的穩(wěn)定性,可規(guī)?；苽?價(jià)格較低等優(yōu)點(diǎn)[8-9]。在指紋成像領(lǐng)域,納米Fe3O4因其無毒、表面易于修飾且具有超順磁性,許多研究者將其功能化形成磁性熒光納米材料,應(yīng)用于犯罪現(xiàn)場(chǎng)潛指印的顯現(xiàn),取得良好的效果[10-11]。

然而,現(xiàn)有的將納米Fe3O4相關(guān)材料應(yīng)用于指紋成像的研究中,只運(yùn)用了超順磁性,未曾運(yùn)用其納米酶催化特性。因此,利用材料的多重特性來降低指印物質(zhì)識(shí)別的成本或許是一種可行途徑。同時(shí),借助計(jì)算機(jī)識(shí)別進(jìn)一步提升識(shí)別效率,特別是當(dāng)肉眼難以辨別是否產(chǎn)生顏色變化時(shí),其具有更大的優(yōu)勢(shì)。HSV、RGB和灰度,是不同的表達(dá)色彩的顏色空間(色彩空間)[12-14],將其應(yīng)用于對(duì)潛指印物質(zhì)顏色的分析,有助于對(duì)識(shí)別效率和準(zhǔn)確率的提升。H2O2既是外源性物質(zhì)的產(chǎn)物,又是內(nèi)源性物質(zhì)的產(chǎn)物。作為過氧化炸藥爆炸后的殘留物,對(duì)H2O2進(jìn)行快速檢測(cè)能為案件提供更多的線索與物證[15];同時(shí)H2O2還是汗液分泌物中葡萄糖、乳酸、尿素等的中間產(chǎn)物,這些分泌物與人體疾病,如糖尿病、癌癥、風(fēng)濕病等息息相關(guān)[16-17]。

因此,本文以H2O2為突破口,協(xié)同納米酶Fe3O4的超順磁性和辣根過氧化物酶樣活性,并在Matlab中設(shè)計(jì)和運(yùn)用HSV、RGB和灰度程序?qū)撝赣D像進(jìn)行分析,實(shí)現(xiàn)了對(duì)潛指印二維形態(tài)的顯現(xiàn)及其中H2O2的定性與半定量分析,并初步實(shí)現(xiàn)了葡萄糖的定性分析,提供了一種低門檻、高效率的潛指印物質(zhì)識(shí)別新方法和新思路,流程如圖1所示。

圖1 整體流程示意圖

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

硫酸亞鐵(FeSO4·7H2O)、氯化高鐵(FeCl3·6H2O)、無水乙醇(C2H5OH)、過氧化氫(H2O2,30wt%)、冰醋酸(CH3COOH)、醋酸鈉(CH3COONa)、PBS緩沖液、四甲基聯(lián)苯胺(TMB)、葡萄糖(D-Glucose)、葡萄糖氧化酶(GOx,180 U/mg)均購于上海阿拉丁生化科技有限公司;所有化學(xué)試劑為分析純,實(shí)驗(yàn)中所用水均為超純水。

Milli-Q超純水機(jī)(美國密理博公司);pH計(jì)(上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司);JP-040超聲儀(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司);ESJ200-4B分析天平(沈陽龍騰電子有限公司);DZF-6020真空干燥箱(上海申賢恒溫廠);TG16B臺(tái)式高速離心機(jī)(湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司);Thermo-Fisher DXR2拉曼光譜儀(美國賽默飛)。

1.2 潛指印中H2O2的原位可視化方法

志愿者將手洗凈并用紙巾擦干,用指尖擦過額頭,收集一些皮脂,然后用指尖蘸取H2O2溶液(5×102mM)。將指尖和拇指揉搓,使該物質(zhì)與指尖上的皮脂混合。在載玻片上捺印指印,獲得汗?jié)撝赣颖?。用我們之前的方法[11]合成納米Fe3O4,將Fe3O4與TMB按質(zhì)量比1∶1混合并充分研磨。

“抖顯+噴顯”分為兩步:抖顯:用磁性刷吸取研磨好的混合粉末,并將其至于載玻片指印外側(cè),通過抖動(dòng)使得混合粉末從載玻片一端經(jīng)過潛指印落向另一端,用磁性刷將多余的粉末吸走,在白色背景下拍照取樣a。噴顯:將HAc-NaAc緩沖液(pH3.2)超聲5 min。取1 mL緩沖液裝入噴霧器中,用噴霧器朝指印a噴顯,噴完即止,4 min后在白色背景下拍照取樣b。其中拍照的手機(jī)、參數(shù)、距離、拍照時(shí)的角度和背景光照,以及噴顯時(shí)噴霧器及其高度和角度保持一致。

1.3 原位可視化條件的優(yōu)化

保證其他條件一致,將TMB與納米Fe3O4分別按質(zhì)量比10∶1、5∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶5和1∶10的比例混合并充分研磨,探究TMB與Fe3O4之間的最優(yōu)搭配比例;保證其他條件一致,分別將pH3.2、3.6、4.0、4.4、4.8、5.2、5.8的HAc-NaAc緩沖液超聲5 min,探究原位識(shí)別的最優(yōu)pH值。

1.4 潛指印中H2O2的定性分析

在載玻片上捺印指印,以最優(yōu)原位識(shí)別條件獲得“抖顯+噴顯”指印,并在白色背景下,通過智能手機(jī)固定為圖像數(shù)據(jù)。將所得指印圖像輸入自編代碼,分別計(jì)算圖像每個(gè)像素點(diǎn)的HSV數(shù)據(jù)(色相、飽和度、明度),根據(jù)色相值對(duì)H2O2進(jìn)行定性,并用拉曼光譜儀對(duì)定性結(jié)果加以驗(yàn)證。

1.5 潛指印中H2O2的半定量分析

用手指蘸取不同濃度H2O2溶液(0 mM、5×10-3mM、5×10-2mM、5×10-1mM、5×100mM、5×101mM、5×102mM、5×103mM),在載玻片上捺印指印,獲得相應(yīng)濃度的“抖顯+噴顯”指印的圖像數(shù)據(jù)。將其輸入自編代碼,分別計(jì)算出變色前/后每張圖像中各個(gè)像素點(diǎn)的RGB/灰度值及平均值,進(jìn)一步計(jì)算變色前后圖像數(shù)據(jù)之間的差值(△值),構(gòu)建圖像△RGB、△R、△G、△B和△Gray與H2O2濃度數(shù)量級(jí)之間的映射關(guān)系,實(shí)現(xiàn)潛指印上H2O2的半定量分析。

1.6 模擬現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用及比較

在6種不同材質(zhì)/顏色的客體進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)模擬,選取手機(jī)充電器、快遞盒、紙杯、A4紙、筆記本封面、洗潔精瓶子等生活常見物品作為客體,在這些客體上捺印不同濃度H2O2的潛指印,并進(jìn)行原位識(shí)別,探究本方法的準(zhǔn)確性、普適性。同時(shí)將本方法和材料與公安民警辦案過程中顯現(xiàn)指印時(shí)常用的磁性粉、金粉、銀粉的顯現(xiàn)效果進(jìn)行進(jìn)一步的比較。

1.7 潛指印中葡萄糖的識(shí)別

將手指視為上下兩部分,下部蘸取葡萄糖粉末,上部保持正常,在載玻片上捺印指印并抖顯。在兩部分滴加等量葡萄糖氧化酶溶液,孵育半小時(shí)后拍照固定,隨后用HSV程序進(jìn)行定性分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 潛指印上H2O2的原位可視化

圖2展現(xiàn)了原位可視化的原理和效果。“抖顯+噴顯”后,納米Fe3O4優(yōu)異的超順磁性使其均勻分布在指印紋線上,同時(shí)HAc-NaAc水珠隨機(jī)分布在指印紋線周圍,在水分干燥的過程中產(chǎn)生了咖啡環(huán)效應(yīng)[18-19],即“在液體蒸發(fā)過程中,由于毛細(xì)管從液體中心向外流動(dòng),會(huì)將懸浮物帶到邊緣,直至幾乎所有的懸浮物都沉淀下來,使得水珠形成環(huán)狀”。當(dāng)水珠里的HAc-NaAc被帶到指印紋線邊緣時(shí),由于分子表面張力,部分HAc-NaAc和水珠會(huì)吸附在指印紋線上的Fe3O4@TMB混合粉末表面。此時(shí),TMB逐漸溶解在HAc-NaAc水珠里,同時(shí)指印中的油脂會(huì)在水珠表面形成一層水油膜,從而減少水分的蒸發(fā),為TMB、H2O2和納米Fe3O4的變色反應(yīng)提供微小的液體環(huán)境,使得變色反應(yīng)能夠在指印上(固體表面)順利進(jìn)行,且不會(huì)破壞其紋線形態(tài)。方程式為:

該過程體現(xiàn)了納米Fe3O4的納米酶催化特性:第一步,H2O2從納米Fe3O4顆粒表面的Fe2+獲得電子形成H2O,Fe2+被氧化為Fe3+;第二步,TMB(白色)失去電子變?yōu)閛xTMB(藍(lán)綠色),Fe3+獲得電子被還原成Fe2+[20]。由圖可知,“抖顯+噴顯”后指紋的整體顏色從灰黑色變?yōu)榱怂{(lán)綠色,與變色原理相符。指印圖像中可觀察到多個(gè)起點(diǎn)、終點(diǎn)等清晰的指紋二級(jí)特征。相較于“抖顯+噴顯”的方法,“抖顯+滴顯”的潛指印圖像呈糊狀,如圖2(b),是由于“抖顯+滴顯”時(shí)Fe3O4@TMB混合粉末與指紋乳突紋線屬于物理吸附,二者結(jié)合不夠穩(wěn)定,大顆粒水滴表面張力大于物理吸附力,水滴在擴(kuò)散的同時(shí)也帶著Fe3O4@TMB混合粉末擴(kuò)散。而“抖顯+噴顯”的方法成功發(fā)揮出了納米Fe3O4的雙重特性,并將水滴霧化解決了大顆粒水滴表面張力帶來的破壞,實(shí)現(xiàn)了對(duì)潛指印上H2O2的原位可視化。

圖2 潛指印H2O2原位可視化原理及效果

2.2 條件的優(yōu)化

為進(jìn)一步優(yōu)化原位可視化的效果,探究了原位可視化時(shí)TMB與納米Fe3O4的最優(yōu)比例搭配,以及最適pH。圖3中a1到a7、b1到b7分別是TMB與Fe3O4質(zhì)量比為10∶1、5∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶5和1∶10的“抖顯+噴顯”之后的指印圖像(溫度、pH、H2O2濃度一致);c1到c7、d1到d7分別是HAc-NaAc緩沖液pH3.2、3.6、4.0、4.4、4.8、5.2和5.8的“抖顯+噴顯”之后的指印圖像(溫度、TMB與Fe3O4質(zhì)量比、H2O2濃度一致)。

圖3 原位可視化不同條件的示意圖

圖3中從a1到a7,由于納米Fe3O4占比越來越多,指印紋線的顏色由淺至深。而b1到b7對(duì)應(yīng)的顏色變化卻并非如此,b1和b2變色前后變色不明顯,原因在于a1和a2中納米Fe3O4的占比低,在變色反應(yīng)時(shí)所提供的催化位點(diǎn)不足;而b6和b7中由于納米Fe3O4的占比過高,變色后藍(lán)綠色受黑色的干擾較重;在b3、b4、b5中,b3的效果最好,因此TMB與納米Fe3O4的最優(yōu)比例為2∶1。

相較于a1到a7,c1到c7的紋線顏色深淺更均勻,但仍然存在一些差異,這是指印捺印時(shí)的力度、油脂含量的差異造成的,在可控誤差范圍之內(nèi)。與HRP酶相似,納米Fe3O4過氧化物酶樣活性也受溶液pH值的影響。當(dāng)pH在3.2~3.6范圍變化時(shí),納米Fe3O4的催化活性隨pH增大而增強(qiáng),當(dāng)pH為3.6時(shí)的催化活性最高,此后隨著pH值增大其催化活性降低,因此選取3.6為最佳pH,根據(jù)已有文獻(xiàn)報(bào)道[21],在H2O2與TMB的反應(yīng)過程中,羥基自由基(·OH)的產(chǎn)生發(fā)揮了重要作用,而pH值的變化會(huì)對(duì)該過程產(chǎn)生影響。此現(xiàn)象與溶液中TMB、H2O2和納米Fe3O4反應(yīng)的最適pH值一致[8]。此外,本方法對(duì)于不同形成時(shí)間的潛指印顯現(xiàn)效果,在前期的工作中已有探究,結(jié)果表明潛指印中殘留物會(huì)隨時(shí)間的解吸、電離和汽化,本方法的最佳顯現(xiàn)時(shí)間應(yīng)控制在5天之內(nèi)[22]。

2.3 定性分析

HSV顏色空間對(duì)顏色的表達(dá)相對(duì)于RGB和灰度更符合人類觀察色彩的方式。所以用HSV程序來代替肉眼進(jìn)行定性的判定。此程序是在本課題組之前研究的基礎(chǔ)上[7]作出了進(jìn)一步的優(yōu)化。圖4中(a)和(c)中上下兩枚指印分別是變色前/后的指印圖像,二維表格是指印圖像經(jīng)HSV程序分析后的色相圖,橫坐標(biāo)代表色相(H),縱坐標(biāo)表示像素點(diǎn)的個(gè)數(shù),其中,為便于計(jì)算和表達(dá),我們?cè)诔绦蛑袑SV模型的色相(H)的范圍從(0°~360°)[12]調(diào)整為(0~1);(b)和(d)是HSV三維散點(diǎn)圖,3個(gè)坐標(biāo)軸分別代表了像素點(diǎn)的色相(H)、飽和度(S)和明度(V),其中小點(diǎn)的顏色直接反映了指印圖像像素點(diǎn)的顏色。

圖4 指印定性分析圖

變色前的指印圖像整體偏黃,如色相圖(a)顯示,該指印圖像像素點(diǎn)的色相范圍分布在(0.1~0.2)區(qū)間,超過10×104的像素點(diǎn)集中在0.12,因此(b)中多數(shù)的小點(diǎn)存在重疊現(xiàn)象,肉眼觀察到的黃色小點(diǎn)數(shù)量較少;變色后的指印圖像出現(xiàn)了oxTMB對(duì)應(yīng)的藍(lán)綠色,色相圖(c)中顯示其像素點(diǎn)的色相范圍分布在(0.46~0.52)區(qū)間,集中在0.48,但相較于(a)其像素點(diǎn)顏色的分布范圍更窄,因此(d)中的顏色小點(diǎn)的在H軸的分布范圍相較于(b)也更窄。圖(e)中的指印為低濃度H2O2的指印圖像,肉眼難以分辨指印中有藍(lán)綠色產(chǎn)生,而從其對(duì)應(yīng)的色相圖和三維散點(diǎn)圖(f)中可直觀地觀察到藍(lán)綠色像素點(diǎn)的存在?？梢?利用HSV程序?qū)⒅赣〉淖兩闆r進(jìn)行數(shù)據(jù)化、量化表達(dá),相較于肉眼更為靈敏、客觀。

為驗(yàn)證藍(lán)綠色是否由oxTMB產(chǎn)生,圖5是對(duì)原位可視化前后潛指印中隨機(jī)5處紋線進(jìn)行拉曼檢測(cè)的結(jié)果。TMB在被氧化前,在1 189、1 332和1 609 cm-1處存在較強(qiáng)的拉曼峰[23],當(dāng)其被氧化成oxTMB后拉曼強(qiáng)度會(huì)有所下降,因此通過比對(duì)變色前后的拉曼強(qiáng)度即可驗(yàn)證。由于本實(shí)驗(yàn)對(duì)TMB進(jìn)行拉曼檢測(cè)時(shí)所用載體是載玻片,且TMB表面附有Fe3O4,其拉曼峰有不同程度的偏移(變?yōu)? 166、1 345和1 603 cm-1)。圖5顯示,顯色后指印(曲線1~5)的拉曼強(qiáng)度都明顯低于顯色前(曲線6~10)的強(qiáng)度,與鐘麗云等人的實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象一致[24],因此變色后指印中的藍(lán)綠色是由oxTMB產(chǎn)生,所以根據(jù)三維散點(diǎn)圖和色相圖中的顏色變化即可實(shí)現(xiàn)潛指印中H2O2的定性分析。

圖5 拉曼驗(yàn)證圖

2.4 半定量分析

潛指印中H2O2半定量分析的原理為:

其中“x”表示指印圖像的RGB/灰度值。不同濃度H2O2的指印的Δx(變化值)不同,因此計(jì)算出各濃度梯度的Δx(變化值)即可實(shí)現(xiàn)指印中H2O2的半定量分析。

圖6是H2O2的多通道半定量分析圖,內(nèi)嵌圖為含有不同濃度數(shù)量級(jí)H2O2的指印圖像。其中,紅色、綠色、藍(lán)色、棕橙色、灰色曲線分別代表△R、△G、△B、△RGB、△Gray,橫坐標(biāo)為H2O2濃度的對(duì)數(shù)(Log),縱坐標(biāo)為變化值的大小;指印內(nèi)嵌圖分為8行5列,每一行代表不同濃度的H2O2(從下至上H2O2濃度分別為0 mM、5×10-3mM、5×10-2mM、5×10-1mM、5×100mM、5×101mM、5×102mM、5×103mM),每一行的5個(gè)正方塊代表同一枚指印的5個(gè)不同區(qū)域(由于指印圖像邊緣沒有指印紋線,會(huì)影響定量的準(zhǔn)確性,故以五點(diǎn)取樣法,在含有指印紋線的區(qū)域隨機(jī)選取5個(gè)區(qū)域,用這5個(gè)區(qū)域的變色情況代表整枚指印的變色情況)。

圖6 半定量分析圖

圖6中,不同△x(變化值)曲線的形態(tài)表明,H2O2濃度的對(duì)數(shù)與△x(變化值)的大小不成正比,二者關(guān)系滿足于Peak Functions函數(shù)中Asym2Sig曲線的分布樣式,

其中y0為偏移量;A為振幅;xc為水平方向的中心點(diǎn);w1,w2,w3為寬度參量,并且w2,w3決定峰值位置[25]。在較低H2O2濃度時(shí)(5×10-3mM~5×10-1mM)其催化反應(yīng)速率緩慢,這是因?yàn)榧{米Fe3O4對(duì)H2O2的親和力不強(qiáng);而在較高H2O2濃度時(shí)(5×102mM~5×103mM),由于納米Fe3O4的催化位點(diǎn)不夠,多個(gè)H2O2分子對(duì)Fe3O4上的單個(gè)催化位點(diǎn)產(chǎn)生了競(jìng)爭,而單一催化位點(diǎn)的競(jìng)爭導(dǎo)致了催化活性的降低。因此,在較高H2O2濃度時(shí),其催化反應(yīng)速率也逐步減緩,此現(xiàn)象與研究前期在溶液中利用紫外可見光譜測(cè)得的數(shù)據(jù)相符[23],驗(yàn)證了半定量的準(zhǔn)確性與科學(xué)性。

相對(duì)于△G和△B曲線,△R、△RGB和△Gray曲線擬合程度更高,是因?yàn)門MB與H2O2的產(chǎn)物顏色呈“藍(lán)綠色”,與綠色通道(△G)和藍(lán)色通道(△B)顏色重合,會(huì)影響其準(zhǔn)確性。因此在半定量分析時(shí)應(yīng)選擇△R、△RGB和△Gray 3個(gè)通道,而當(dāng)潛指印圖像的背景存在紅色干擾時(shí),應(yīng)選擇△RGB、△Gray通道;另外,由于△RGB是由△R、△G、△B組合而成,其擬合程度會(huì)受△G、△B的影響。因此,綜合各因素,選取△Gray通道進(jìn)行半定量分析更為準(zhǔn)確。圖7(g)為單獨(dú)的△Gray通道半定量箱線圖,其中小寫字母(a、b、c、d、e、f、g)表示不同濃度梯度的顯著差異(P＜0.05)。

2.5 模擬現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用及比較

為檢驗(yàn)本方法的普適性,在不同材質(zhì)/不同顏色客體上進(jìn)行了模擬現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用,如圖7所示。其中a為洗潔精瓶子(其中H2O2的濃度為5×102mM)、b為紙杯(濃度為5×101mM)、c為快遞盒(濃度為2×101mM)、d為A4紙(濃度為1×100mM)、e為筆記本封面(濃度為2×10-1mM)、f為手機(jī)充電器(濃度為2×10-2mM)。

經(jīng)過原位可視化識(shí)別,可觀察到諸多的指印細(xì)節(jié),說明“抖顯+噴顯”的方法適用于多種小體積客體上潛指印的顯現(xiàn)。圖7中(a1/a2、b1/b2、c1/c2、d1/d2、e1/e2、f1/f2)分別對(duì)應(yīng)6種客體上“變色前”和“變色后”的指印,其中,3種白色背景的差異最大(b1/b2、d1/d2、f1/f2),黃色背景(a1/a2)、棕色背景(c1/c2)的差異稍小,而紅色背景(e1/e2)的差異最小。如圖7中h與h',變色產(chǎn)生的藍(lán)綠色在紅色背景襯托下呈黑色,肉眼難以辨別出有藍(lán)綠色的出現(xiàn),但從所得的定性圖譜中可觀察到藍(lán)色像素點(diǎn)的存在,進(jìn)一步印證了計(jì)算機(jī)識(shí)別相較于肉眼更為靈敏、準(zhǔn)確。隨后進(jìn)一步對(duì)3種白色背景下指印中H2O2的進(jìn)行半定量分析(客體分別為b紙杯、d A4紙、f手機(jī)充電器),如圖7中g(shù)所示。其中b、d、f的半定量結(jié)果與其測(cè)得的濃度與實(shí)際濃度相符,半定量結(jié)果在誤差范圍之內(nèi)。

圖7 現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用圖

以載玻片為客體,將本方法和材料與傳統(tǒng)的磁性粉、金粉、銀粉的潛指印顯現(xiàn)效果進(jìn)行比較。如圖8,a為納米Fe3O4@TMB抖顯的潛指印,b,c和d分別為傳統(tǒng)磁性粉、銀粉、金粉抖顯的潛指印,a',b',c'和d'分別是Fe3O4@TMB、傳統(tǒng)磁性粉、銀粉和金粉“刷顯”的潛指印。a1和a'1分別為a和a'中心花紋處的超景深3D放大圖像。

圖8中通過“抖顯”形成的指印圖像,Fe3O4@TMB的顯現(xiàn)效果(a)最佳,其中脊線與谷線對(duì)比明顯,說明Fe3O4@TMB對(duì)潛指印紋線具有較高的選擇性。由于傳統(tǒng)的磁性粉(b)、銀粉(c)和金粉(d)對(duì)潛指印紋線的選擇性較低,用其抖顯形成的指印圖像較模糊。其中,磁性粉的顯現(xiàn)效果優(yōu)于銀粉,銀粉優(yōu)于金粉,這是因?yàn)椴煌@現(xiàn)材料的顆粒尺寸、形態(tài)不同,而顆粒的尺寸和形態(tài)則使得該材料對(duì)指印紋線的選擇性不同。

圖8 不同材料和方法指紋成像圖

通過“刷顯”形成的指印圖像中,顯現(xiàn)效果銀粉＞Fe3O4@TMB＞磁性粉＞金粉。而相較于抖顯,“刷顯”的效果磁性粉、銀粉、金粉提升了,Fe3O4@TMB反而有所下降,說明傳統(tǒng)顯現(xiàn)材料更適合于“刷顯”,Fe3O4@TMB更適合于“抖顯”。由于Fe3O4@TMB顯現(xiàn)指印紋線后還需進(jìn)行下一步變色環(huán)節(jié),故紋線上粉末越多則越有利于后續(xù)的變色反應(yīng)。將a1和a'1對(duì)比可知,Fe3O4@TMB通過抖顯形成的指印相較于刷顯,指印紋線上的粉末更多,更有利于后續(xù)的變色反應(yīng)。

2.6 潛指印中葡萄糖的識(shí)別

圖9是對(duì)潛指印中葡萄糖檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。由于葡萄糖與葡萄糖氧化酶反應(yīng)的最適pH在7左右,而TMB與H2O2反應(yīng)的最適pH在3~4之間,這使得對(duì)潛指印(固體表面)中葡萄糖的識(shí)別需要兩次改變pH,較難控制,目前只能以“抖顯+滴顯”的方式進(jìn)行葡萄糖的可視化識(shí)別,無法實(shí)現(xiàn)原位可視化識(shí)別,但并不影響其的定性分析。

為增加定性效果,圖9(a)中左側(cè)指印下部粘附有額外葡萄糖粉末、上部未添加。通過“抖顯+滴顯”后,指印中產(chǎn)生如下偶聯(lián)反應(yīng),

反應(yīng)結(jié)果如圖9(a)中右側(cè)指印所示。其中,指印上半部分未發(fā)生肉眼可見的變色,下半部分產(chǎn)生明顯藍(lán)綠色。盡管“抖顯+滴顯”不能實(shí)現(xiàn)指印中葡萄糖的原位識(shí)別,但部分指印細(xì)節(jié)可以被拍照固定。由于手指下部額外附著有葡萄糖,經(jīng)“抖顯+滴顯”后,潛指紋上存在明顯的藍(lán)綠色,如圖9(c)所示。由于圖9(b)中的指印沒有額外的葡萄糖,潛指紋上半部分未出現(xiàn)明顯藍(lán)綠色,但其局部放大圖中存在少量藍(lán)綠色像素,這可歸因于捺印指印時(shí)附著的汗液中存在極少量的葡萄糖。

圖9 潛指印中葡萄糖識(shí)別圖

3 總結(jié)與展望

本研究將納米Fe3O4的雙重特性(超順磁性和辣根過氧化物酶樣活性)協(xié)同用于潛指印成像,實(shí)現(xiàn)了對(duì)其二維形態(tài)及其中物質(zhì)信息的同步可視化識(shí)別?！岸讹@+噴顯”的方法適用于對(duì)多種客體上潛指印的成像,但由于納米Fe3O4對(duì)H2O2的親和力較低,檢測(cè)限還有待進(jìn)一步提升。進(jìn)一步設(shè)計(jì)HSV、RGB和灰度相關(guān)的程序,輔助實(shí)現(xiàn)了對(duì)潛指印中H2O2的定性與半定量分析。相較于肉眼觀察,HSV定性識(shí)別更為靈敏、客觀;用灰度進(jìn)行半定量更準(zhǔn)確,不過目前還無法滿足犯罪現(xiàn)場(chǎng)復(fù)雜背景下的定量分析。與傳統(tǒng)顯現(xiàn)方法和材料相比,Fe3O4@TMB對(duì)指印紋線的選擇性更高,對(duì)潛指印顯現(xiàn)的效果更好;潛指印中葡萄糖的識(shí)別需要兩次改變pH,較難控制,目前僅初步實(shí)現(xiàn)了定性分析,對(duì)其原位識(shí)別和定量分析還有待進(jìn)一步完善。

綜上,合理利用顯現(xiàn)材料的多功能性可挖掘出更多的信息,將顯現(xiàn)方法與計(jì)算機(jī)技術(shù)結(jié)合,可更好地將指印信息進(jìn)行數(shù)據(jù)化與量化。在下一步的工作中,本團(tuán)隊(duì)將進(jìn)一步提升納米材料的性能、開發(fā)更為普適性的定量方法,擬實(shí)現(xiàn)對(duì)潛指印中更多的內(nèi)源性物質(zhì)和外源性物質(zhì)的原位識(shí)別,從其中挖掘出更多有價(jià)值的信息。