黑木耳的性狀特征和膨脹度與麥角甾醇含量相關性研究

曾敏芳，包海鷹※，宋超，趙卉，畢融冰

（1.吉林農業(yè)大學中藥材學院，吉林 長春 130118；2.中國農業(yè)科學院特產研究所，吉林 長春 130112）

黑木耳是擔子菌門Basidiomycota 蘑菇綱Agaricomycetes 木耳目Auriculariales 木耳科Auriculariaceae、木耳屬Auricularia 黑木耳Auricularia heimuer F.Wu et al 的子實體，性平，味甘；歸胃、大腸經；具有滋陰潤肺、養(yǎng)胃潤腸和血止血的功效，主治虛勞咳嗽、痰中帶血、胃腸燥熱、口干便秘、血瘀積聚、月經不調和崩漏便血等[1]。黑木耳又名木耳、木蛾、木菌、樹雞、云耳、耳子、黑菜、細木耳和光木耳等，是我國傳統(tǒng)的藥食同源膠質真菌[2,3]。

麥角甾醇（ergosterol）又稱麥角固醇，是真菌類的特征甾醇，能促進人體對鈣、磷的吸收，是人體外源性維生素D2的良好來源之一[4]，常被用以改善嬰幼兒及高齡人群缺乏維生素D 而導致的佝僂病、軟骨病和骨質疏松癥[5]。同時本實驗室通過研究發(fā)現(xiàn)從蒙古口蘑中提取的麥角甾醇具有顯著的抗腫瘤活性[6]，此外麥角甾醇還具有增強人體免疫力、抗炎鎮(zhèn)痛[7]、抗血小板聚集[8]、降低膽固醇[9]、抗纖維化、抗氧化和延緩衰老等多種藥理作用[10,11]。目前麥角甾醇已經成為評價食藥用菌的質量評價指標之一[12]。

黑木耳不僅是百姓餐桌上的常見食用菌，而且還應用于中藥制劑如產復康顆粒、骨疏康顆粒、骨疏康膠囊和妙濟丸中[12]，但黑木耳質量標準中未有活性成分指標的評價，更多的是將黑木耳視為食品對其總糖、粗蛋白和粗纖維等營養(yǎng)成分進行質量評價[13]，忽視了其藥用價值。為推動黑木耳產業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，多種成分和生物活性評價黑木耳勢在必行。本研究擬將麥角甾醇作為黑木耳質量評價指標之一，目前麥角甾醇最常用的檢測方法主要參考地方標準DB44/T1991-2017 靈芝及其相關產品中麥角甾醇測定的高效液相色譜法[14,15]，關于超高效液相色譜法（UPLC）測定黑木耳麥角甾醇暫未見相關研究，因此本研究擬建立快速分析黑木耳中麥角甾醇含量的超高效液相色譜法，同時分析黑木耳麥角甾醇含量是否與性狀特征和膨脹度相關，為該藥材的質量評價提供科學依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 實驗樣品

從全國不同省份的市場隨機購買46 批黑木耳樣品，經吉林農業(yè)大學包海鷹教授鑒定均為黑木耳Auricularia heimuer F.Wu et al 的子實體。黑木耳市場價格差額大，在78～505 元/kg 之間，本次實驗將黑木耳價格分為8 個等級，一級在80 元/kg 以內，此后每一級加40 元，直至大于320 元/kg 的定義為8 級。具體信息見表1。

表1 黑木耳來源信息Table 1 The source information of Auricularia heimuer

1.2 實驗儀器

游標卡尺[香港杭泰（國際）集團有限公司]，膨脹度測定管，ST07B 型高速萬能粉碎機（上海樹立儀器儀表有限公司），ACQUITY 型超高效液相色譜儀（沃特世公司），Waters ACQUITY UPLC BEH C18 色譜柱（100 mm 2.1 mm，1.7m），MS204S 型電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]，KS-700XDS 型超聲儀（昆山潔力美超聲儀器有限公司），HC-3018 型高速離心機（安徽中科中佳科學儀器有限公司），MX-S 型渦旋混勻器[大龍興創(chuàng)實驗儀器（北京）有限公司]，Milli-Q Advantage 型超純水器（密理博公司）。

1.3 標準品與試劑

麥角甾醇標準品（HPLC≥98%，上海源葉生物科技有限公司，批號：J03D10R104657），無水甲醇（色譜純，默克股份兩合公司，批號：I1126907-101），乙腈[色譜純，賽默飛世爾科技（中國）有限公司，批號：F21LAL202]，超純水。

2 方法

2.1 黑木耳性狀觀察

采用中藥鑒定方法中的性狀鑒定方法對46 份實驗樣品進行性狀觀察，并記錄黑木耳干品的外觀特征。同時每份樣品用游標卡尺測量10 個黑木耳的長度和寬度，之后再將樣品放燒杯中加清水浸泡5 h 以上直至完全泡發(fā)，用游標卡尺測量泡發(fā)后的黑木耳的長度，寬度與中間的厚度，泡發(fā)前和泡發(fā)后的樣品分別拍照記錄。

2.2 黑木耳膨脹度測定

先在膨脹度測定管中加入5 mL 水，再加入0.2 g（精確至0.000 1 g）粉碎過100 目篩的黑木耳粉末，用玻璃棒攪拌將粉末與水混合均勻，少量多次地加水，使黑木耳粉末充分被水浸潤沉于測定管底部，并除去氣泡，最后定容至25 mL 膨脹度測定管刻度線，密塞，靜置。開始1 h 內每30 min 用玻璃棒充分攪拌1 次，然后靜置4 h，讀取黑木耳粉末膨脹后的體積（mL），再靜置1h，如上讀數(shù)，至連續(xù)兩次讀數(shù)的差異不超過0.1mL為止。最后一次讀取的數(shù)值按公式S=V/W 計算，準確至0.1，其中S為膨脹度，V為樣品膨脹后的體積（mL），W 為黑木耳的重量（g）。

2.3 麥角甾醇含量的測定

2.3.1 色譜條件 色譜柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（100 mm 2.1 mm，1.7m）；柱溫35 ℃，檢測波長282 nm，流動相：乙腈：水（98:2）；流速0.5 mL/min；進樣量2L；運行時間5 min。

2.3.2 標準品溶液的制備 精密稱取20 mg（精確至0.000 01 g）麥角甾醇標品于50 mL 容量瓶中，用無水甲醇配制成0.4 mg/mL 標準品儲備液溶液。

2.3.3 供試品溶液的制備 精密稱取0.5 g 粉碎（精確至0.000 1 g）過100 目篩的黑木耳粉末于50 mL離心管中，按照不同料液比1:10（g/mL）、1:20（g/mL）、1:50（g/mL）添加無水甲醇，再根據(jù)不同超聲時間（30min，60 min）進行提取，7 000 r/min 離心6 min，過濾，將上清液用無水甲醇定容至25 mL。提取液經0.22m 微孔有機相濾膜進行UPLC 測定。根據(jù)峰面積確定提取效率。最后根據(jù)最佳提取條件對實驗樣品進行提取。

2.3.4 專屬性考察實驗 分別將麥角甾醇標準品、供試品溶液和提取溶劑無水甲醇經0.22m 微孔有機相濾膜過濾后按2.3.1 色譜條件進行測定分析。

2.3.5 線性考察 將0.4 mg/mL麥角甾醇儲備液用無水甲醇稀釋成0.08 mg/mL、0.04 mg/mL、0.02 mg/mL、0.008 mg/mL、0.004 mg/mL 和0.001 6 mg/mL 一系列標準品溶液。按2.3.1 色譜條件分別進樣分析，測定峰面積，以麥角甾醇質量濃度（X，mg/mL）對色譜峰峰面積（Y）繪制標準曲線。

2.3.6 精密度實驗 取濃度為0.02 mg/mL 標準品溶液按2.3.1 色譜條件連續(xù)進樣6 次，測定保留時間和峰面積。

2.3.7 重復性實驗 精密稱取6 份46 號樣品0.5 g（精確至0.000 1 g），按照2.3.3 最佳實驗方法制備供試品溶液并按照2.3.1 色譜條件測定6 份樣品中麥角甾醇的含量和保留時間。

2.3.8 穩(wěn)定性實驗 取制備好的1 號黑木耳供試品溶液，按照2.3.1 色譜條件分別在0 h、2 h、4 h、8 h、12 h和24 h 進行含量測定。

2.3.9 加標回收實驗 加入相當于已知1 號樣品含量80%，100%和120%的濃度為0.4 mg/mL 的麥角甾醇標準品，制備供試品溶液，按照2.3.1 色譜條件測定麥角甾醇含量，計算回收率和RSD 值。

2.3.10 樣品含量的測定 將所有黑木耳樣品按照2.3.3 項下最佳實驗方法制備供試品溶液，按2.3.1 色譜條件測定樣品麥角甾醇含量。

2.4 麥角甾醇含量與性狀特征和膨脹度相關性分析

使用SPSS 22.0 將黑木耳麥角甾醇含量與泡發(fā)后的厚度以及膨脹度進行Pearson 相關性分析。

3 結果

3.1 性狀特征和膨脹度

46 份黑木耳干燥子實體呈不規(guī)則的塊片狀，長13.62～35.10 mm，寬8.75～26.35 mm，多皺縮，表面平滑，正面多呈黑色，部分為紅褐色，黑褐色或黃褐色，背面大多為黃灰色，少數(shù)呈黑灰色、灰色或灰白色，質脆易折斷。加水浸泡后則膨脹，形似耳狀或不規(guī)則形，邊緣全緣，呈黑褐色，紅褐色或棕褐色，柔潤而微透明，長26.63～72.09mm，寬22.13～58.64mm，厚0.55～1.67mm。因Y44 號樣品特殊的包裝技術，因此無法測該樣品干燥子實體的長度和寬度。黑木耳的膨脹度大小在15.0～42.3 之間，具體結果見圖1、圖2、圖3、表2和表10。

圖1 樣品Y1-Y16 性狀特征Fig.1 Characteristics of sample Y1-Y16

圖2 樣品Y17-Y32 性狀特征Fig.2 Characteristics of sample Y1-Y16

圖3 樣品Y33-Y46 性狀特征Fig.3 Characteristics of sample Y33-Y46

表2 黑木耳干燥品性狀特征Table 2 Characteristics of dried Auricularia heimuer

續(xù)表

3.2 麥角甾醇含量的測定

3.2.1 色譜條件 將本次實驗UPLC 色譜條件和結果與地方標準DB44/T 1991-2017 進行相關比較，見表3。結果表明在同樣靈敏度高，穩(wěn)定性好，準確度高的條件下，UPLC 法分析更快，出峰快且效果好，運行時間短，在樣本量大的情況下，能節(jié)省更多的時間。

表3 HPLC 與UPLC 比較結果Table 3 Comparison of HPLC and UPLC results

3.2.2 供試品溶液的制備 實驗樣品不同提取條件結果如表4如示，結果表明最好的提取條件是精密稱取0.5 g 粉末（精確至0.000 1 g）過100 目篩的黑木耳粉末于50 mL離心管中，加25 mL無水甲醇，渦旋混勻，超聲提取1 h，7 000 r/min 離心6 min，過濾，將上清液用無水甲醇定容至25 mL。提取液經0.22m 微孔有機相濾膜進行UPLC 測定。

表4 不同提取條件黑木耳麥角甾醇含量提取結果Table 4 Extraction results of Auricularia heimuer ergosterol content under different extraction conditions

3.2.3 專屬性考察結果 專屬性考察結果見色譜圖4、圖5和圖6。結果表明麥角甾醇標準品和供試品麥角甾醇峰的保留時間和UV光譜圖一致，且無水甲醇溶劑在相應保留時間內沒有峰出現(xiàn)，說明該方法專屬性良好。

圖4 麥角甾醇標準品色譜圖Fig.4 Chromatogram of ergosterol standard

圖5 供試品色譜圖Fig.5 Chromatogram of sample

圖6 無水甲醇色譜圖Fig.6 Chromatogram of methanol

3.2.4 線性考察結果 線性考察結果見表5，可得標準曲線回歸方程為y=5514333.6315x+820.384（R2=0.9999），說明麥角甾醇在0.001 6～0.08mg/mL范圍內呈良好的線性關系。

表5 線性關系考察試驗結果（n=6）Table 5 Linear relationship examination results (n=6)

3.2.5 精密度實驗結果 精密度實驗結果見表6?？傻名溄晴薮嫉谋Ａ魰r間的RSD值為0.18%，峰面積的RSD 值為0.20%，說明儀器精密度良好。

表6 精密度試驗結果（n=6）Table 6 Precision test results (n=6)

3.2.6 重復性實驗結果 重復性實驗結果見表7。結果表明6 份46 號樣品保留時間的RSD 值為0.41%，麥角甾醇含量的RSD值為0.53%，表明方法重復性良好。

表7 重復性試驗結果（n=6）Table 7 Repeatability test results (n=6)

3.2.7 穩(wěn)定性實驗結果 穩(wěn)定性實驗結果見表8?？傻迷摌悠返钠骄溄晴薮己繛?.656 3 mg/g，RSD為0.23%，表明樣品在24 h 內基本穩(wěn)定。

表8 樣品穩(wěn)定性試驗結果（n=6）Table 8 Sample stability test results (n=6)

3.2.8 加標回收實驗結果 加標回收實驗結果見表9?？傻眉訕藰悠返钠骄厥章蕿?00.84%，RSD 值為0.55%，說明方法準確性良好。

表9 加標回收率試驗結果（n=6）Table 9 Spiked recovery test results (n=6)

3.2.9 麥角甾醇含量結果 46 份黑木耳麥角甾醇含量結果見表10。采用SPSS22.0 對測得的麥角甾醇數(shù)據(jù)結果進行單因素方差分析，從測定結果（表10）可以看出市售46 份黑木耳麥角甾醇含量在0.1359～0.8936mg/g之間，含量差異顯著（P＜0.01），平均含量為0.6075mg/g，大于平均水平的有25 份。

表10 黑木耳的性狀特征和膨脹度及麥角甾醇的含量Table 10 Characteristics,turgidity and ergosterol content of Auricularia heimue

3.3 黑木耳麥角甾醇含量與性狀特征和膨脹度相關性分析

在日常生活中，大家普遍認為泡發(fā)性高的，厚度大的以及泡發(fā)后狀似小碗的是好木耳，因此使用SPSS 22.0 將黑木耳麥角甾醇含量與泡發(fā)后的厚度以及膨脹度進行Pearson 相關性分析，結果見表11，黑木耳的麥角甾醇含量與其厚度和膨脹度分別存在極顯著正相關關系（P＜0.01）。

表11 麥角甾醇與性狀特征和膨脹度Pearson 相關性分析Table 11 Pearson correlation Analysis of Ergosterol with traits and swelling degree

3.4 黑木耳麥角甾醇含量與價位和產地相關性分析

目前市場上黑木耳價格差異大，結合表1和表11可以看出麥角甾醇含量最高的Y20（0.893 6 mg/g），價格為87.6 元/kg，但價格最貴的Y9（509.2 元/kg），含量為0.537 3 mg/g，含量差異顯著（P＜0.01），說明黑木耳市場定價存在很大的自由度；不同價位的黑木耳的麥角甾醇含量差異明顯（P＜0.01），但是不成線性關系，例如從含量來看，是Y36＜Y9＜Y16，但是從價位等級來看是Y16＜Y36＜Y9；同價位的不同產地黑木耳麥角甾醇含量差異顯著（P＜0.01），例如Y2，Y5，Y6，Y13 和Y31；同價位同省份同縣區(qū)的黑木耳麥角甾醇含量差異顯著（P＜0.01），例如Y16 和Y17；同時也有不同價位不同產地的黑木耳麥角甾醇含量無差異性，例如Y8，Y14，Y19，Y23，Y34，說明黑木耳麥角甾醇含量與產地無特殊聯(lián)系。

4 結論

目前市場上黑木耳質量參差不齊，麥角甾醇含量差異顯著，且麥角甾醇含量與厚度和膨脹度分別存在極顯著正相關關系（P＜0.01）。但是黑木耳麥角甾醇含量與產地和價格等因素無關。同時本研究建立了黑木耳中麥角甾醇含量測定的超高效液相色譜法（UPLC），色譜條件是使用Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（100 mm 2.1 mm，1.7m），柱溫35 ℃，進樣量2L，檢測波長282 nm，流動相為乙腈：水（98:2），流速0.5 mL/min，與常用的高效液相色譜法相比，該方法檢測更快速，出峰快，運行時間短，靈敏度高，準確度高，具有很好的穩(wěn)定性和重復性。本文為將黑木耳中麥角甾醇含量作為評價指標對其進行質量評價提供了參考，為進一步研究、生產和應用黑木耳作為功能性食品和治療劑提供了研究基礎。