閃式提取法研究糙葉五加根皮和莖的脂溶性成分

唐思琪，徐依，2，羅姣，黃浩，劉向前，李小軍

（1.贛南醫(yī)學院藥學院國家中藥現(xiàn)代化工程技術研究中心-客家中醫(yī)藥資源研究分中心；2.贛南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院，江西 贛州 341000；3.湖南中醫(yī)藥大學藥學院，湖南 長沙 410208）

閃式提取法又名組織破碎提取法，該法利用閃式提取器在適當溶劑和條件下，將植物藥材組織快速破碎，通過高速振動攪拌使有效成分迅速釋放，從而達到快速提取的目的。由于一次提取可以在幾秒到幾分鐘內(nèi)完成，提取速度是傳統(tǒng)方法的百倍以上，因此稱為閃式提取法［1］。該法具有室溫操作、提取速度快、范圍廣、高效節(jié)能、設備簡單、操作方便、環(huán)保等優(yōu)點，適用于各種成分及大多數(shù)溶劑，已廣泛應用于中草藥的提取。另外，由于其提取環(huán)境為室溫，特別適用于熱敏性成分的提取。閃式提取法在中草藥提取方面相較其他傳統(tǒng)方法具有顯著的優(yōu)勢［2］。

糙 葉 五 加［Acanthopanax henryi（Olive.）Harms］又名亨利五加，為五加科五加屬植物，主要分布于湖南、江西、山西、四川、甘肅、浙江等地，是中國特有的植物［3］。五加皮（Acanthopanacis Cortex）作為傳統(tǒng)中藥使用歷史悠久，2020版《中國藥典》記載的五加皮為細柱五加（Acanthopanax gracilistylusW.W.Smith）的根皮［4］，但民間也會以糙葉五加的根皮入藥，如收載于湖南省中藥材地方標準的糙葉五加根皮，也稱“五加皮”［5］，其性味溫辛，具有祛風濕、強筋骨、化淤血、祛水消腫等功效，常用于風濕痹痛、筋骨虛軟、跌打損傷、疝氣腹痛、脾腎陽虛、乏力等病癥［5-6］?，F(xiàn)代藥理學研究表明，糙葉五加提取物及其化學成分具有多種藥理活性，如抗炎、抗神經(jīng)炎、抗菌、抗脂肪蓄積、抗腫瘤、抗氧化、抗乙酰膽堿酯酶、抗丁酰膽堿酯酶及抗透明質(zhì)酸酶等活性［6-13］。前期研究報道了糙葉五加主要含有萜類（單萜、二萜、三萜皂苷）、苯丙素類、咖啡?；鼘幩嵫苌?、黃酮類、木脂素類、甾體等二次代謝產(chǎn)物［6，14-21］，然而，對于糙葉五加的揮發(fā)性及脂溶性化學成分鮮見報道［6］。閃式提取法是近幾十年發(fā)展起來的一項新型物理組織破碎提取技術，在中草藥研究方面特別是在熱敏性成分的研究上顯示出越來越廣闊的發(fā)展?jié)摿Γ?2］。本研究首次采用閃式提取法對糙葉五加根皮和莖中的脂溶性成分進行提取，并運用GC-MS對其進行化學組分和含量的比較分析，為進一步闡明其脂溶性部位的物質(zhì)基礎及開發(fā)利用糙葉五加資源提供實驗依據(jù)和理論參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料安捷倫7890B-7000D型氣相色譜—三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國安捷倫）；JHBE-20A閃式提取器（北京金鼐科技發(fā)展有限公司）；RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮）；無水乙醇、石油醚、正己烷、二氯甲烷（分析純，國藥）。

實驗樣品于2021年3月份采自湖南省新化，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學藥學院劉向前教授鑒定為五加科五加屬植物糙葉五加［Acanthopanax henryi（Olive.）Harms］的根皮和莖，標本保存于贛南醫(yī)學院江西省高校天然產(chǎn)物研究與開發(fā)重點實驗室，標本號分別為AHR202103和AHS202103。

1.2 方法

1.2.1 脂溶性成分的提取分別取自然陰干后的糙葉五加根皮和莖各100 g，粉碎至粗粉（保證藥材粉末直徑小于閃式提取器刀頭內(nèi)徑），裝入提取罐中，加300 mL無水乙醇浸泡12 h后，在4～5擋提取1 min，連續(xù)提取2次后合并提取液（2×300 mL），減壓回收溶劑得總浸膏?？偨嗉尤?50 mL蒸餾水分散后用石油醚（60～90）萃取3次（3×200 mL），回收溶劑，得石油醚萃取物。取100 μL石油醚萃取物（脂溶性成分）溶于1 mL二氯甲烷中，用于GC-MS分析。

1.2.2 GC-MS測試條件GC條件：色譜柱為DB-5MS石英毛細管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），程序升溫初溫為60℃，保持4 min，以10℃·min-1的速率升至180℃，保持5 min，再以5℃·min-1升溫至250℃，保持5 min，進樣口溫度為250℃，載氣為氦氣，柱前壓為72 kPa，進樣量1 μL，流速1.2 mL·min-1。

MS條件：離子源為EI，離子源溫度230℃，電子能量70 eV，接口溫度270℃，溶劑延遲時間為3 min，掃描質(zhì)量范圍為60～600 amu。檢索普庫為NIST17.L質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫，并與標準譜圖對照，鑒定各組分峰。

2 結(jié)果

依據(jù)糙葉五加不同部位脂溶性成分總離子流色譜圖，采用NIST17.L質(zhì)譜計算機數(shù)據(jù)系統(tǒng)進行檢索，對質(zhì)譜相似度＞70%的化合物進行收集整理，以鑒定化合物，運用面積歸一法計算得到不同化學成分占總體的相對百分含量。糙葉五加根皮和莖的脂溶性化學成分種類和含量均存在一定的差異，從其根皮和莖的脂溶性成分中共鑒定出68個化合物，其中根皮和莖中分別鑒定出47和24種脂溶性化學成分，分別占總量的78.86%和91.87%。閃式提取糙葉五加根皮和莖脂溶性成分的總離子流色譜圖、化學成分及其含量詳見圖1～2和表1。

表1 閃式提取糙葉五加根皮和莖脂溶性成分的組成和相對含量

圖1 閃式提取糙葉五加根皮脂溶性成分的總離子流色譜圖

圖2 閃式提取糙葉五加莖脂溶性成分的總離子流色譜圖

續(xù)表1閃式提取糙葉五加根皮和莖脂溶性成分的組成和相對含量

續(xù)表1閃式提取糙葉五加根皮和莖脂溶性成分的組成和相對含量

續(xù)表1閃式提取糙葉五加根皮和莖脂溶性成分的組成和相對含量

續(xù)表1閃式提取糙葉五加根皮和莖脂溶性成分的組成和相對含量

續(xù)表1閃式提取糙葉五加根皮和莖脂溶性成分的組成和相對含量

續(xù)表1閃式提取糙葉五加根皮和莖脂溶性成分的組成和相對含量

3 討論

本實驗首次通過GC-MS聯(lián)用技術對閃式提取法提取的糙葉五加根皮和莖的脂溶性化學成分進行分析研究，結(jié)果顯示，糙葉五加根皮脂溶性成分的主要種類為倍半萜及其含氧衍生物（45.84%）、長鏈脂肪酸及其酯類（23.37%）以及少量的小分子酚類（3.19%）、長鏈多不飽和烯烴（1.36%）、酚酸酯類（0.88%）、長鏈脂肪醛（0.6%）、甾體類（0.11%）、烷烴類（0.1%）；其莖中主要含有倍半萜及其含氧衍生物（39.37%）、長鏈烷烴（30.2%）、小分子酚類（8.05%）、長鏈脂肪醇（7.35%）及少量的脂肪酸（4.48%）、酚 酸 酯 類（1.71%）、長 鏈 脂 肪 醛（0.71%）。其中，糙葉五加根皮中含量＞5%的主要脂溶性成分為9-Octadecenoic acid，（E）-（7.2%）、9，12-Octadecadienoic acid（Z，Z）-（6.9%）、Naphthalene，1，2，3，4，4a，5，6，8a-octahydro-7-methyl-4-methylene-1-（1-methylethyl）-，（1.alpha.，4a.beta.，8a.alpha.）-（6.74%）、trans-Sesquisabinene hydrate（5.63%）、Linoleic acid ethyl ester（亞油酸乙酯，5.01%）；其莖中含量＞5%的主要脂溶性成分為Pentacosane（正二十五烷，27.75%）、Naphthalene，decahydro-4a-methyl-1-methylene-7-（1-methylethenyl）-，［4aR-（4a.alpha.，7.alpha.，8a.beta.）］-（12.63%）、2，6，10-Dodecatrien-1-ol，3，7，11-trimethyl-，acetate，（E，E）-（12.39%）、1-Hexadecanol（7.35%）、2-Isopropenyl-4a，8-dimethyl-1，2，3，4，4a，5，6，8a-octahydronaphthalene（7.33%）；根皮和莖中共檢測鑒定出3種共有成分，分別為Pentadecanal-（根皮：0.33%；莖：0.36%）、Benzenepropanoic acid，3，5-bis（1，1-dimethylethyl）-4-hydroxy-，ethyl ester（根皮：3.19%；莖：8.05%）、Phthalic acid，butyl hept-4-yl ester（根皮：0.88%；莖：1.71%）。結(jié)果表明閃式提取法提取的糙葉五加根皮和莖的脂溶性化學成分種類和含量均存在一定的差異，建議在藥用時注意區(qū)分，對于它們的藥理活性評價有待進一步進行。

天然倍半萜類化合物在醫(yī)藥行業(yè)有著重要的作用，其藥理活性豐富多樣，包括抗炎、抗腫瘤、保護神經(jīng)系統(tǒng)、保護胃腸道、保肝、抗菌和抗病毒、降血糖等活性［23-24］。糙葉五加根皮和莖脂溶性成分中含有豐富的倍半萜類化合物，比如根皮和莖中的杜松烷型倍半萜具有多種重要的藥理活性，如抗菌、抗炎、降血糖、抗腫瘤等［24］，具有深度開發(fā)的價值。另外，有研究報道，根皮中的倍半萜成分trans-Sesquisabinene hydrate具有一定的抗金黃色葡萄球菌的活性［25］；莖中的鏈狀倍半萜2，6，10-Dodecatrien-1-ol，3，7，11-trimethyl-，acetate，（E，E）-具有抗氧化的活性［26］。

同時，糙葉五加根皮脂溶性成分中含有較多的不飽和脂肪酸，具有重要的醫(yī)藥功效，如亞油酸［9，12-Octadecadienoic acid（Z，Z）-］具有降低血脂、軟化血管、降低血壓、促進微循環(huán)的作用，可預防或減少心血管病的發(fā)病率，特別是對高血壓、高血脂、心絞痛、冠心病、動脈粥樣硬化、老年性肥胖癥等的防治極為有利，能起到防止人體血清膽固醇在血管壁的沉積，有“血管清道夫”的美譽，具有防治動脈粥樣硬化及心血管疾病的保健效果［27］；亞油酸乙酯（Linoleic acid ethyl ester）也具有降低血液中膽固醇和血脂的作用，主要用作制藥原料，防治動脈粥樣硬化癥［27］。同時，研究報道，亞油酸乙酯對HepG2細胞具有較明顯的保護作用，表明其具有潛在的護肝活性［28］。糙葉五加莖中的9（E），11（E）-Conjugated linoleic acid［9（E），11（E）-共軛亞油酸］具有多種生物活性，如能影響免疫功能并具有預防肥胖、糖尿病和動脈粥樣硬化的作用，同時還具有抑制腫瘤的作用，如具有延緩皮膚癌、促進人乳腺癌和前列腺癌細胞的凋亡等作用。其抑制腫瘤的作用機制包括調(diào)節(jié)類二十烷酸的代謝影響癌細胞凋亡（內(nèi)質(zhì)途徑），作為配體激活過氧化物酶體增殖劑激活受體γ（PPARγ）調(diào)節(jié)細胞的分化和代謝（核途徑），以及誘導癌細胞產(chǎn)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激途徑調(diào)節(jié)細胞代謝［29］。另外，研究報道，共軛亞油酸對丙烯醛誘導的雄性大鼠腦線粒體功能具有保護作用［30］，對WM793黑色素瘤細胞也具有抑制作用［31］。

糙葉五加根皮中還發(fā)現(xiàn)了角鯊烯（Squalene），它是一種無毒性的海洋生物活性物質(zhì)，是一種高度不飽和烯烴類化合物，具有提高體內(nèi)超氧化物歧化酶活性、抗腫瘤、抗衰老等多種功能［32］。研究表明，角鯊烯還有耐缺氧、促進皮膚健康、用于化妝品的保濕劑和抗氧化劑及自由基清除劑的作用，另外，角鯊烯也可用作高級香皂的高脂劑、食品機械設備中的潤滑劑、殺蟲劑、衣物護理劑、鉛筆芯穩(wěn)定劑等［33］。同時，角鯊烯還是植物體內(nèi)合成甾體和三萜類二次代謝產(chǎn)物的重要前體物質(zhì)，這也為前期研究從該植物中報道的甾體和三萜化合物提供了佐證［4，13］。其莖中發(fā)現(xiàn)的1-Hexadecanol（正十六烷醇）可用于制造香料、化妝品、洗滌劑、增塑劑等，適用于各類化妝品中，作為基質(zhì)，特別適合于膏霜及乳液；在醫(yī)藥中，可直接用于W/O乳化劑膏體、軟膏基質(zhì)，也可用于消泡劑、水土保溫劑、成色劑、氣相色譜固定液等［34］。本研究進一步豐富了中國特產(chǎn)五加科五加屬植物糙葉五加脂溶性成分的研究內(nèi)容，為對其進行深入化學成分和藥理活性研究提供了參考依據(jù)，也為糙葉五加的質(zhì)量評價提供了實驗依據(jù)和理論參考。