基于UPLC-QE-Orbitrap-MS的贛南地區(qū)產(chǎn)鐵皮石斛莖和根水提物的成分表征

謝樹春，李小軍，程齊來(lái)，范平龍

（1.贛南醫(yī)學(xué)院2021級(jí)碩士研究生；2.贛南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，江西 贛州 341000）

蘭科石斛屬鐵皮石斛（Dendrobium officinaleKimura et Migo），為2020年版《中國(guó)藥典》中藥品種鐵皮石斛的基原植物，具有“益胃生津，滋陰清熱”的功效，中醫(yī)臨床用于熱病傷津、口干煩渴、胃陰不足、食少干嘔、病后虛熱不退、陰虛火旺、骨蒸勞熱、目暗不明、筋骨痿軟等病癥［1］。唐代醫(yī)學(xué)典籍《道藏》將鐵皮石斛列為“中華九大仙草之首”，歷來(lái)受人追捧。現(xiàn)代藥理研究表明，鐵皮石斛具有增強(qiáng)免疫功能［2］、抗腫瘤［3］、延緩衰老［4］、抗疲勞［5］、降血糖［6］、改善胃腸功能［7］等作用。從我國(guó)鐵皮石斛產(chǎn)量分布來(lái)看，鐵皮石斛主要分布在浙江、云南、廣東、廣西等地，其中浙江省鐵皮石斛的產(chǎn)量最多，占42%，其次是云南省，占28%［8］。江西省鐵皮石斛的規(guī)模種植在2010年以前就已出現(xiàn)，主要途徑是由浙江投資者在我省建立的苗木基地引進(jìn)鐵皮石斛種植［9］。野生鐵皮石斛對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境的溫度、濕度、水源等條件有著苛刻要求，而仿野生栽培的興起，加上贛南地區(qū)自然環(huán)境適合鐵皮石斛的仿野生栽培，鐵皮石斛種植得以在贛南地區(qū)迅速發(fā)展。

鐵皮石斛主要開發(fā)利用部位是莖，富含多糖、生物堿、有機(jī)酸、黃酮類等成分［10］。鐵皮石斛藥用資源中還有小量的根、葉和花等組成，但迄今為止，文獻(xiàn)對(duì)鐵皮石斛根、葉、花的研究報(bào)道較少、較淺，特別是對(duì)鐵皮石斛根的化學(xué)成分研究及藥理研究十分匱乏。因此，在采收時(shí)，大量的根作為藥材廢棄物直接丟棄，造成了一定的生物資源浪費(fèi)。為了提高鐵皮石斛植物資源的綜合利用度，加上目前對(duì)贛南地區(qū)產(chǎn)鐵皮石斛化學(xué)成分研究資料空白，本實(shí)驗(yàn)采用超高效液相色譜-四級(jí)桿-靜電軌道串聯(lián)高分辨質(zhì)譜法（UPLC-QE-Orbitrap-MS）對(duì)贛南地區(qū)產(chǎn)鐵皮石斛莖和根的化學(xué)成分進(jìn)行定性分析，初步比較二者成分差異，以期為進(jìn)一步中藥成分體內(nèi)代謝研究及藥效物質(zhì)研究奠定基礎(chǔ)，為后續(xù)進(jìn)一步擴(kuò)大藥用部位提供依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器Ultimate 3000 RS型超高效液相色譜儀，賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；Q Exactive高分辨質(zhì)譜儀，賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；Direct-Q?5純水/超純水一體機(jī)系統(tǒng)，德國(guó)默克密理博；MS105DU半微量電子天平，梅特勒·托利多國(guó)際貿(mào)易有限公司；D3024R速微量冷凍離心機(jī)，北京大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；MX-F渦旋振蕩器，武漢賽維爾生物科技有限公司；MTV-100多管渦旋混合儀，杭州奧盛儀器有限公司；JP-040S超聲波清洗器，深圳潔盟清洗設(shè)備有限公司。

1.2 材料鐵皮石斛，2020年12月采集于江西省龍南市江西新靈倍康石斛科技有限公司鐵皮石斛種植基地。藥材樣本由贛南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院程齊來(lái)教授鑒定為鐵皮石斛（Dendrobium officinaleKimura et Migo），憑證標(biāo)本（GY2020125YC）保存在贛南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院中藥標(biāo)本館。色譜純甲醇、甲酸（上海阿拉丁生化科技股份有限公司），其他所用試劑均為分析純（西隴化工股份有限公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 供試品溶液制備將采集的鮮藥鐵皮石斛分離莖和根，去除雜質(zhì)，陰干。莖和根分別進(jìn)行粉碎，加10倍量蒸餾水浸泡1 h，煮沸提取2次，每次2 h，抽濾得提取液，合并2次提取液。所得提取液，濃縮至5倍水體積，3 000 r·min-1離心10 min，收集上清液，減壓濃縮并進(jìn)行真空冷凍干燥，分別得到鐵皮石斛莖和根的凍干水提物。精密稱取10 mg的凍干水提物樣本，加入80%甲醇1 mL，研磨5 min，再渦旋5 min，4℃條件下離心10 min，離心力20 000×g，取上清，經(jīng)0.22 μm的微孔濾膜過(guò)濾，即得供試品溶液，每組平行設(shè)置3個(gè)重復(fù)，放置4℃冰箱備用。

2.2 色譜條件Welch Ultimate XB-C18型色譜柱（50 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流動(dòng)相為甲醇（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脫（0～1 min，2%A；1～5 min，2%～20%A；5～10 min，20%～50%A；10～15 min，50%～80% A；15～20 min，80%～95% A；20～25 min，95% A；25～26 min，95%～2% A；26～30 min，2% A）；流量：0.3 mL·min-1；柱溫箱溫度：35.0℃；自動(dòng)進(jìn)樣器溫度：10.0℃；自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)樣體積量：5.00 μL。

2.3 質(zhì)譜條件采用電噴霧離子源（ESI），在正負(fù)離子切換掃描模式下分別進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)分析。掃描模式：Full mass/dd-MS2，F(xiàn)ull mass分辨率為70 000，dd-MS2分辨率為17 500；掃描范圍：150.0～2 000 m·z-1；電噴霧電壓：3 800 V（Positive）；毛細(xì)管溫度：300℃；碰撞氣：高純氬氣（純度≥99.999%）；鞘氣：氮?dú)猓兌取?9.999%），40 Arb；輔 助 氣：氮 氣（純 度≥99.999%），350℃；數(shù)據(jù)采集時(shí)間為30 min。

2.4 數(shù)據(jù)分析UPLC-QE-Orbitrap-MS采集的數(shù)據(jù)通過(guò)CD2.1（Thermo Fisher）完成數(shù)據(jù)初步整理后進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)檢索比對(duì)（mzCloud，mzVault），篩選出贛南地區(qū)產(chǎn)鐵皮石斛莖和根可能存在的化合物。在此基礎(chǔ)上，利用Thermo Xcalibur 2.2分析軟件對(duì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)一步分析和處理，并結(jié)合相關(guān)參考文獻(xiàn)推導(dǎo)拆分碎片，最終確定贛南地區(qū)產(chǎn)鐵皮石斛莖和根的化合物。得到的數(shù)據(jù)輸入SIMCA-P 14.1軟件進(jìn)行無(wú)監(jiān)督的主成分分析（PCA），從總體上得到莖和根之間的總體成分差異和變異度大小，并使用Draw Venn Diagram軟件對(duì)根和莖化學(xué)成分進(jìn)行Venn差異分析。

3 結(jié)果

3.1 贛南地區(qū)產(chǎn)鐵皮石斛莖和根的化學(xué)成分定性分析本實(shí)驗(yàn)基于UPLC-QE-Orbitrap-MS技術(shù)對(duì)贛南地區(qū)產(chǎn)鐵皮石斛莖和根的水提物進(jìn)行化學(xué)成分表征，通過(guò)比較贛南地區(qū)產(chǎn)鐵皮石斛莖和根的總離子流圖（見圖1），發(fā)現(xiàn)莖和根間成分種類差異較小。從兩個(gè)不同部位總離子流圖中分離出598個(gè)質(zhì)量峰，結(jié)合參考文獻(xiàn)和mzCloud數(shù)據(jù)庫(kù)，綜合考慮保留時(shí)間、分子式、精確分子量、特征性離子碎片，分別鑒定了29個(gè)共有化學(xué)成分（包括12個(gè)有機(jī)酚酸類、10個(gè)黃酮類、3個(gè)核苷類、3個(gè)脂肪酸類及1個(gè)酰胺類物質(zhì)，見表1）和5個(gè)差異化學(xué)成分（根：3個(gè)有機(jī)酸類、1個(gè)黃酮類；莖：1個(gè)脂肪酸。見表2）。

表1 贛南地區(qū)產(chǎn)鐵皮石斛莖和根水提物中29個(gè)共有化合物的定性分析結(jié)果

表2 贛南地區(qū)產(chǎn)鐵皮石斛莖和根水提物中5個(gè)差異化合物的定性分析結(jié)果

圖1 贛南地區(qū)產(chǎn)鐵皮石斛莖（A）和根（B）的水提物UPLC-QE-Orbitrap-MS總離子流圖

3.2 贛南地區(qū)產(chǎn)鐵皮石斛莖和根差異成分分析利用SIMCA-P 14.1軟件對(duì)預(yù)處理后的數(shù)據(jù)進(jìn)行PCA分析及Draw Venn Diagram軟件進(jìn)行Venn差異分析，篩選差異成分。通過(guò)PCA主成分分析得分散點(diǎn)圖，能夠直觀地顯示出二者之間的整體差異，結(jié)果見圖2。橫坐標(biāo)為描述多維數(shù)據(jù)矩陣中最顯著的特性；縱坐標(biāo)為除橫坐標(biāo)以外的所能描述多維數(shù)據(jù)矩陣中最顯著的特性。在橫坐標(biāo)上，根和莖并未明顯分離，這說(shuō)明兩個(gè)部位不同化學(xué)成分種類的差異并不明顯。在縱坐標(biāo)上，莖與根明顯分離，且莖、根分別分布在不同側(cè)，這說(shuō)明部位之間的化學(xué)成分含量是第二顯著的特性，二者成分含量相差較大。使用Draw Venn Diagram軟件對(duì)二者成分進(jìn)行差異分析發(fā)現(xiàn)，莖和根有520個(gè)共有質(zhì)量峰，18個(gè)莖特有質(zhì)量峰和60個(gè)根特有質(zhì)量峰，進(jìn)一步表明二者成分種類大致相同（見圖3）。

圖2 贛南地區(qū)產(chǎn)鐵皮石斛莖和根水提物成分的PCA分析

圖3 贛南地區(qū)產(chǎn)鐵皮石斛莖和根水提物成分的Venn差異分析

4 討論

鐵皮石斛屬于名貴中草藥，資源短缺，且鐵皮石斛根為氣生根，雜質(zhì)污染少，較易凈制，民間用于食療較廣泛。浙江、福建等地民間常將鐵皮石斛根洗凈曬干，煲湯服用，亦有釀酒時(shí)摻入進(jìn)行發(fā)酵，取其保健功效。因此，對(duì)鐵皮石斛根部的物質(zhì)基礎(chǔ)進(jìn)行系統(tǒng)研究，為鐵皮石斛根的進(jìn)一步開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)具有重要意義。本研究采用UPLC-QE-Orbitrap-MS技術(shù)對(duì)贛南地區(qū)產(chǎn)鐵皮石斛根和莖水提物的主要化學(xué)成分進(jìn)行了全面表征。通過(guò)參考已有的鐵皮石斛化學(xué)成分研究報(bào)道［11-16］并結(jié)合mzCloud數(shù)據(jù)庫(kù)檢索比對(duì)，共鑒定出29個(gè)共有化合物、4個(gè)根差異化合物及1個(gè)莖差異化合物。對(duì)鐵皮石斛莖和根水提物化學(xué)成分進(jìn)行Venn差異分析，莖水提物的差異成分有18個(gè)，根水提物的差異成分有60個(gè)，主要為有機(jī)酸和黃酮類。二者化學(xué)成分種類差異較小，成分相似，表明鐵皮石斛根進(jìn)一步開發(fā)其食療、藥用等功能具有可行性。