兵團(tuán)第十四師四十七團(tuán)設(shè)施蔬菜根結(jié)線蟲(chóng)種類鑒定*

馬少軍，劉佳偉，金玉華，李克梅*

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052；2.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)第十二師農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所）

根結(jié)線蟲(chóng)（Meloidogyne spp.）在世界各地廣泛分布，寄主范圍廣，幾乎能夠侵染所有的蔬菜作物，常造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1]。迄今，全世界已報(bào)道100多種根結(jié)線蟲(chóng)，常見(jiàn)的根結(jié)線蟲(chóng)種類主要是南方根結(jié)線蟲(chóng)（Meloidogyn incognita）、爪哇根結(jié)線蟲(chóng)（M.javanica）、花生根結(jié)線蟲(chóng)（M.arenaria）與北方根結(jié)線蟲(chóng)（M.hapla）[2]。新疆兵團(tuán)第十四師四十七團(tuán)地處新疆較溫暖的和田地區(qū)墨玉縣，光熱資源充足，冬季無(wú)嚴(yán)寒，開(kāi)春早，降水少，具有發(fā)展設(shè)施農(nóng)業(yè)得天獨(dú)厚的自然條件。四十七團(tuán)有設(shè)施大棚500 多座，主要種植番茄、辣椒和十字花科蔬菜，還有部分黃瓜、豇豆、芹菜等蔬菜。新疆地處中國(guó)西北邊陲，冬季氣候寒冷，并不利于根結(jié)線蟲(chóng)在室外越冬，很長(zhǎng)時(shí)間以來(lái)，未見(jiàn)根結(jié)線蟲(chóng)在新疆大面積危害的報(bào)道。但設(shè)施農(nóng)業(yè)的保溫條件好、復(fù)種指數(shù)高、栽培模式單一，有利于土壤中根結(jié)線蟲(chóng)繁殖積累，為新疆設(shè)施作物根結(jié)線蟲(chóng)病的發(fā)生提供了適宜環(huán)境[3]，蔬菜根結(jié)線蟲(chóng)病已逐漸成為當(dāng)前新疆設(shè)施蔬菜主要病害之一，嚴(yán)重影響蔬菜的產(chǎn)量和品質(zhì)。

全俊仁[4]等首次發(fā)現(xiàn)在新疆石河子溫室中北方根結(jié)線蟲(chóng)（M.hapla）侵染危害辣椒。杜蘭英[5]等報(bào)道根結(jié)線蟲(chóng)病在新疆哈密危害大棚、溫室的黃瓜、番茄、茄子等蔬菜，并提出病害防治建議，但未明確根結(jié)線蟲(chóng)的種類。李克梅[6]等報(bào)道新疆阿克蘇、吐魯番和庫(kù)爾勒等地區(qū)危害蔬菜的為南方根結(jié)線蟲(chóng)與北方根結(jié)線蟲(chóng)的混合種群。本研究鑒定了根結(jié)線蟲(chóng)病新發(fā)生地四十七團(tuán)設(shè)施蔬菜根結(jié)線蟲(chóng)的種類，研究結(jié)果可為該地蔬菜根結(jié)線蟲(chóng)病的來(lái)源追溯及其病害綜合防控提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2020年9月至2021年5月在第十四師四十七團(tuán)大棚中采集4批15份蔬菜根結(jié)線蟲(chóng)病病株（其中番茄8份，豇豆2份，黃瓜3份，芹菜2份），流水清洗干凈，放置于4 ℃冰箱中備用，從每個(gè)病株中隨機(jī)挑取20個(gè)白色雌蟲(chóng)和20個(gè)卵囊，以備后續(xù)使用。

1.2 根結(jié)線蟲(chóng)會(huì)陰花紋的觀察

雌蟲(chóng)會(huì)陰花紋玻片的制作參照謝輝[7]的方法，即在解剖鏡下，滴加45%乳酸至載玻片中央做浮載劑，將根結(jié)線蟲(chóng)成熟雌蟲(chóng)移入其中，用手術(shù)刀切取蟲(chóng)體后部角質(zhì)膜，清除內(nèi)部附著物，再將其移至另一滴干凈的45%乳酸液滴中清洗和修正，加蓋玻片，置顯微鏡下觀察拍照。將觀察的會(huì)陰花紋形態(tài)特征與文獻(xiàn)資料對(duì)比，初步鑒定根結(jié)線蟲(chóng)種類。

1.3 常見(jiàn)根結(jié)線蟲(chóng)特異性引物PCR檢測(cè)鑒定

1.3.1 單條線蟲(chóng)DNA的提取

解剖鏡下挑取孵化的單條根結(jié)線蟲(chóng)二齡幼蟲(chóng)放入含有8 μL ddH2O的PCR管中，繼而置液氮冰凍2 min，65 ℃溫育1 min，重復(fù)3個(gè)循環(huán)后，再加入1 μL蛋白酶K和1 μLBuffer，65 ℃保溫90 min，95 ℃加熱10 min。得到的線蟲(chóng)DNA可用于進(jìn)一步的PCR或于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 特異性引物PCR擴(kuò)增鑒定常見(jiàn)根結(jié)線蟲(chóng)

對(duì)4種常見(jiàn)的根結(jié)線蟲(chóng)檢測(cè)鑒定，分別采用Randig[8]等報(bào)道的特異性引物Inc-K14-F和Inc-K14-R檢測(cè)南方根結(jié)線蟲(chóng)，Petersen[9]等報(bào)道的特異性引物Fh和Rh檢測(cè)北方根結(jié)線蟲(chóng)，F(xiàn)argette[10]等報(bào)道的特異性引物Far和Rar、Fjav和Rjav分別擴(kuò)增檢測(cè)花生根結(jié)線蟲(chóng)和爪哇根結(jié)線蟲(chóng)（表1）。統(tǒng)一采用25 μL的反應(yīng)體系：12.5 μL 2×Easy Taq Mix，引物各2 μL，根結(jié)線蟲(chóng)DNA模板1 μL，ddH2O7.5 μL。擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s、退火溫度（上述4種根結(jié)線蟲(chóng)分別是64 ℃、58 ℃、61 ℃、64 ℃）40 s、72 ℃延伸1.5 min，變性、退火、延伸循環(huán)反應(yīng)40次，72 ℃保溫10 min。電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，在紫外照膠儀上觀察并拍照。

表1 本研究所用引物信息

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)病癥狀

蔬菜根結(jié)線蟲(chóng)病從苗期到成株期均可發(fā)生。受害植株地上部生長(zhǎng)緩慢，葉片變小，變黃。結(jié)實(shí)少，甚至不結(jié)實(shí)，果實(shí)發(fā)育緩慢，嚴(yán)重時(shí)植株停止生長(zhǎng)，植株早衰。根結(jié)線蟲(chóng)寄生在蔬菜根內(nèi)，病根部膨大，形成畸形根結(jié)，根結(jié)外部通常附著有大量膠質(zhì)狀卵囊（圖1A）。解剖根結(jié)，可見(jiàn)近球形或長(zhǎng)橢圓形的雌蟲(chóng)，雌蟲(chóng)有突出的短頸，乳白色，陰門(mén)和肛門(mén)位于末端，無(wú)尾（圖1B）。

圖1 番茄根結(jié)線蟲(chóng)病根癥狀及根結(jié)線蟲(chóng)雌成蟲(chóng)蟲(chóng)態(tài)

2.2 根結(jié)線蟲(chóng)的形態(tài)學(xué)鑒定

切取成熟雌蟲(chóng)的會(huì)陰花紋，在生物顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)供試根結(jié)線蟲(chóng)會(huì)陰花紋背弓比較高，似乎方形；側(cè)區(qū)側(cè)線清楚、光滑，線紋斷裂分叉形成刻痕；線紋由細(xì)到粗，呈“Z”形（圖2）。與南方根結(jié)線蟲(chóng)（M.incognita）的會(huì)陰花紋相似[1]。

圖2 供試根結(jié)線蟲(chóng)成熟雌蟲(chóng)會(huì)陰花紋

2.3 特異性引物PCR檢測(cè)鑒定

用特異性引物PCR擴(kuò)增檢測(cè)采集保存的根結(jié)線蟲(chóng)群體，其中以Inc-K14-F/Inc-K14-R為引物（檢測(cè)南方根結(jié)線蟲(chóng)）的樣品中擴(kuò)增出400 bp左右的條帶，而引物Fh/Rh（檢測(cè)北方根結(jié)線蟲(chóng)）、Far/Rar（檢測(cè)花生根結(jié)線蟲(chóng)）和Fjav/Rjav（檢測(cè)爪哇根結(jié)線蟲(chóng)）在不同的樣品中均沒(méi)有擴(kuò)增出特異性條帶（圖3）。

圖3 根結(jié)線蟲(chóng)經(jīng)特異性引物擴(kuò)增的電泳圖譜

3 結(jié)論與討論

本文通過(guò)比對(duì)根結(jié)線蟲(chóng)成熟雌蟲(chóng)的會(huì)陰花紋形態(tài)特征，結(jié)合特異性引物PCR擴(kuò)增檢測(cè)，將來(lái)自兵團(tuán)第十四師四十七團(tuán)的15個(gè)設(shè)施蔬菜根結(jié)線蟲(chóng)群體均鑒定為南方根結(jié)線蟲(chóng)，而未見(jiàn)其它根結(jié)線蟲(chóng)種類。

蔬菜根結(jié)線蟲(chóng)病在世界各地廣泛分布危害。自然條件下，4種常見(jiàn)根結(jié)線蟲(chóng)中，北方根結(jié)線蟲(chóng)主要分布在寒溫帶地區(qū)，而其他3種則主要分布在熱帶地區(qū)，其中對(duì)農(nóng)作物危害最嚴(yán)重的是南方根結(jié)線蟲(chóng)[11-12]。關(guān)于根結(jié)線蟲(chóng)的鑒定常采用形態(tài)觀察結(jié)合同工酶技術(shù)等方法。王暄[13]等通過(guò)形態(tài)觀察和同工酶分析，報(bào)道了中國(guó)根結(jié)線蟲(chóng)新紀(jì)錄種——西班牙根結(jié)線蟲(chóng)。柳永娥[14]等通過(guò)雌蟲(chóng)會(huì)陰花紋觀察與蘋(píng)果酸脫氫酶和酯酶測(cè)定相結(jié)合的方法，鑒定了甘肅省白銀市保護(hù)地蔬菜根結(jié)線蟲(chóng)病的病原有2種，為南方根結(jié)線蟲(chóng)和爪哇根結(jié)線蟲(chóng)，其中優(yōu)勢(shì)種群為南方根結(jié)線蟲(chóng)。但是上述方法往往會(huì)受限于蟲(chóng)態(tài)的發(fā)育階段，供試線蟲(chóng)需要量大且需要技術(shù)人員有較高的專業(yè)水平，耗時(shí)較長(zhǎng)。而采用雌成蟲(chóng)會(huì)陰花紋特征結(jié)合特異性引物PCR擴(kuò)增技術(shù)的鑒定方法得到越來(lái)越多的應(yīng)用。楊艷梅[15]等采用雌成蟲(chóng)會(huì)陰花紋形態(tài)觀察及分子生物學(xué)檢測(cè)（rDNA-ITS區(qū)和SCAR特異性鑒定）技術(shù)，鑒定了云南省部分煙區(qū)根結(jié)線蟲(chóng)種類，主要有南方根結(jié)線蟲(chóng)、花生根結(jié)線蟲(chóng)和爪哇根結(jié)線蟲(chóng)，其中花生根結(jié)線蟲(chóng)為優(yōu)勢(shì)種群。羅佳[2]等用該技術(shù)將重慶番茄根結(jié)線蟲(chóng)病的病原鑒定為南方根結(jié)線蟲(chóng)。

我國(guó)已報(bào)道作物根結(jié)線蟲(chóng)40余種，本研究?jī)H對(duì)4種常見(jiàn)根結(jié)線蟲(chóng)進(jìn)行鑒定，明確危害四十七團(tuán)設(shè)施蔬菜的根結(jié)線蟲(chóng)為南方根結(jié)線蟲(chóng)，暫未發(fā)現(xiàn)其它根結(jié)線蟲(chóng)種類。關(guān)于新疆設(shè)施蔬菜根結(jié)線蟲(chóng)的種類和分布還需要在今后的工作中加強(qiáng)監(jiān)測(cè)，尤其在種苗調(diào)運(yùn)過(guò)程中需加強(qiáng)檢疫，防止其它種類根結(jié)線蟲(chóng)的人為傳播。