葡萄糖對脂多糖刺激下的奶牛乳腺上皮細胞炎癥相關(guān)基因表達的影響

張金友 宋金婷 李 偉 莊雨龍 李長志 宋偉紅

(1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院，大慶 163319；2.黑龍江省農(nóng)墾科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，哈爾濱 150038)

乳腺炎是奶牛養(yǎng)殖過程中發(fā)病率較高的一種疾病，是造成養(yǎng)殖場經(jīng)濟損失的主要疾病之一。奶牛乳腺發(fā)生炎癥后不但會造成乳腺組織的損壞減少當(dāng)期產(chǎn)奶量，還會因使用抗生素治療而增加原料奶的安全風(fēng)險。盡管乳腺炎的發(fā)生可以由代謝、生理變化和創(chuàng)傷等引起，但是但目前普遍認為更常見的原因或主要原因是由致病性微生物造成的。有幾種類型的微生物與乳腺炎的發(fā)生有關(guān)，主要包括細菌、真菌和酵母菌。大腸桿菌是導(dǎo)致奶牛乳腺炎最常見的革蘭氏陰性菌病原體[1]。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是革蘭氏陰性菌外膜的主要成分，被認為是激發(fā)先天性免疫反應(yīng)的強烈刺激因素[2]。在乳腺組織受到病原微生物感染后，乳腺組織的免疫系統(tǒng)被激活以消除病原體，而多種先天性免疫因子及促炎癥因子參與其中并發(fā)揮重要作用。腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和白細胞介素-6(interleukin-6,IL-6)作為促炎癥因子可以刺激中性粒細胞的殺菌活性，并增加局部炎癥反應(yīng)[3]。當(dāng)乳腺上皮細胞受到LPS的刺激后，可以大量產(chǎn)生TNF-α和IL-6[4-5]。白細胞介素-8(interleukin-8,IL-8)可以介導(dǎo)中性粒細胞募集到感染部位，并誘導(dǎo)中性粒細胞的殺菌作用[6]。乳鐵蛋白(lactoferrin,LF)是一種由上皮細胞、巨噬細胞和中性粒細胞產(chǎn)生的抗菌肽，它可以抑制細菌在體內(nèi)的生長并阻止細菌逃脫機體免疫系統(tǒng)對它們的清除[7]。而LPS的刺激可以增加乳腺上皮細胞中IL-8和LF的合成[7-8]。盡管越來越多的研究揭示了免疫因子和促炎癥因子在乳腺感染過程中的變化和作用，但奶牛機體的代謝狀態(tài)，比如血糖濃度，對這個過程的影響卻往往被忽略。眾所周知，圍產(chǎn)期奶牛經(jīng)常處于能量負平衡狀態(tài)，尤其是在產(chǎn)后初期由于大量泌乳的需要而使得奶牛體內(nèi)的葡萄糖大部分被用于乳糖合成和能量供給，致使血糖濃度處于較低水平。而產(chǎn)后初期也正是奶牛免疫力較低和多種傳染性疾病的高發(fā)時期，其中也包括乳腺炎。一些研究表明，能量負平衡造成了奶牛的免疫抑制[9]，減少了免疫細胞的數(shù)量，降低了殺滅病原菌的能力和免疫系統(tǒng)的敏感性[10]。有研究證實葡萄糖濃度的變化對腫瘤細胞胰島素樣生長因子-1(insulin-like growth factor-1，IGF-1)、轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-beta 1,TGF-β1)的分泌和IL-6 mRNA的表達產(chǎn)生影響[11-13]。此外，葡萄糖也對早孕絨毛細胞滋養(yǎng)細胞IL-6和TNF-α的表達以及單核細胞IL-6的表達具有顯著影響[14-15]。然而，葡萄糖對乳腺上皮細胞炎癥相關(guān)基因表達的影響少有研究和報道。而對這方面的研究將有助于揭示能量負平衡對乳腺免疫功能的影響，對深入理解乳腺炎發(fā)病機制、降低奶牛乳腺感染風(fēng)險和提高乳腺抗菌能力等方面具有理論研究和應(yīng)用價值。因此，本試驗將對葡萄糖對LPS刺激下的奶牛乳腺上皮細胞炎癥相關(guān)基因表達的影響進行研究，以期為了解不同能量水平對乳腺上皮細胞免疫反應(yīng)能力的影響提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

試驗中使用的乳腺組織采自哈爾濱市周邊屠宰場宰殺的泌乳期奶牛。挑選現(xiàn)場宰殺奶牛的健康乳腺，取出乳腺中間部位的組織立即放入含有抗生素的生理鹽水中，2 h內(nèi)帶回實驗室進行處理。

1.2 主要儀器與試劑

CO2細胞培養(yǎng)箱購自Thermo Forma公司；倒置顯微鏡、激光掃描共聚焦顯微鏡、正置熒光顯微鏡均購自Leica公司；PCR儀購自Eppendoff公司。

試驗所使用的主要試劑及來源見表1。

表1 主要試劑與來源

續(xù)表1試劑 Reagent來源 SourcePrime Script? RT Reagent Kit、SYBR? Premix ExTaqTM寶生物工程(大連)有限公司DMEM/F12、BODIPY493/503、Ⅰ型膠原酶和TrizolDMEM/F12, BODIPY493/503, type Ⅰ collagenase and Trizol賽默飛世爾科技(中國)有限公司

1.3 乳腺上皮細胞的分離與純化

奶牛乳腺上皮細胞分離與純化方法詳見本團隊以往的研究報道[16],簡要操作過程如下：取出新鮮的乳腺組織→剔除多余組織→氟康唑注射液清洗3次→含有雙抗的D-Hank’s溶液清洗4次→剪碎成組織碎塊→D-Hank’s溶液清洗3次→膠原酶溶液中37 ℃消化2～3 h直至組織塊溶解→濾網(wǎng)過濾→收集濾液離心→棄上清液，加入DMEM/F12培養(yǎng)液吹打混勻后離心→重復(fù)前一步驟→第3次離心后棄去上清液→加入含有10胎牛血清(FBS)的DMEM/F12培養(yǎng)液，輕輕吹打混勻→將細胞懸液轉(zhuǎn)移入培養(yǎng)皿，調(diào)整細胞密度→37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)至80%鋪滿→利用細胞差異性貼壁技術(shù)對乳腺上皮細胞進行純化操作。

1.4 乳腺上皮細胞的鑒定

純化后乳腺上皮細胞的鑒定詳見本團隊前期的文獻[9]報道，簡要操作步驟如下：細胞爬片培養(yǎng)→固定→清洗→TBST封閉→角蛋白18抗體孵育過夜→TBST清洗→二抗孵育→TBST清洗→溴化乙錠(PI)避光孵育→TBST清洗→抗熒光淬滅封片劑→共聚焦顯微鏡觀察。

1.5 試驗設(shè)計

純化后的乳腺上皮細胞在無糖的DMEM培養(yǎng)體系中培養(yǎng)1 h后棄掉培養(yǎng)液，根據(jù)試驗設(shè)計將細胞按照如下方式進行處理：1)為了研究不同濃度葡萄糖對乳腺上皮細胞炎癥相關(guān)基因表達的影響，將細胞分別用含有0.18、0.50、0.90和4.50 mg/mL葡萄糖的完全培養(yǎng)液[16]繼續(xù)培養(yǎng)24 h；2)為了研究LPS對乳腺上皮細胞炎癥相關(guān)基因表達的影響，將細胞分為2組——對照組和LPS組，對照組細胞分別用含有0.18、0.50、0.90和4.50 mg/mL葡萄糖的完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h，LPS組細胞分別用含有0.18、0.50、0.90和4.50 mg/mL葡萄糖并同時添加1 μg/mL LPS的完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h；3)為了研究不同濃度葡萄糖對LPS刺激乳腺上皮細胞炎癥相關(guān)基因表達的影響，將細胞分別用含有0.18、0.50、0.90和4.50 mg/mL葡萄糖并同時添加1 μg/mL LPS的完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束后收取細胞提取RNA，對相關(guān)基因mRNA的相對表達量進行檢測。

1.6 目的基因mRNA相對表達量的檢測

利用GenBank查詢牛TNF-α、IL-6、LF、TGF-β1、IL-8、誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶(induced nitric oxide synthase,iNOS)和β-肌動蛋白(β-actin)基因，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計和評價引物(表2)，利用BLAST分析引物的專一性。

表2 引物信息

續(xù)表2基因名稱Gene namesGenBank登錄號GenBank accession number引物序列Primer sequences (5′—3′)產(chǎn)物長度Product size/bp白細胞介素-8 IL-8NM_173925.2F:TTCCTCAGTAAAGATGCCAATGR:GACAACCCTACACCAGACCC85β-肌動蛋白β-actinNM_173979F:TGTTAGCTGCGTTACACCCTR:CTGTCACCTTCACCGTTCC163

按照Trizol試劑說明書提取總RNA后進行反轉(zhuǎn)錄，采用20 μL體系，見表3。反應(yīng)條件為37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。

表3 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系

利用實時熒光定量PCR檢測TNF-α、IL-6、LF、TGF-β1、IL-8和iNOSmRNA在不同處理細胞中的相對表達量。采用20 μL反應(yīng)體系(表4)，95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火31 s，40個循環(huán)。每個樣品重復(fù)3次，以β-actin為內(nèi)參基因?qū)δ康幕虮磉_量進行校正。因在各葡萄糖濃度的試驗處理中未設(shè)置空白對照，故采用2-△△Ct計算公式進行各個基因mRNA相對表達量的計算。

表4 實時熒光定量PCR反應(yīng)體系

1.7 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS 23.0軟件的獨立樣本t檢驗法對目的基因的mRNA相對表達量倍數(shù)變化進行差異顯著性分析，采用單因素方差分析(one-way ANOVA)的Duncan氏多重比較法對目的基因的mRNA相對表達量進行差異顯著性分析，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 奶牛乳腺上皮細胞的培養(yǎng)與鑒定

在奶牛乳腺組織進行酶消化處理后將組織液進行培養(yǎng)，得到的是乳腺上皮細胞和成纖維細胞組成的混合培養(yǎng)體系。為了對細胞進一步純化，本試驗根據(jù)乳腺上皮細胞和成纖維細胞對胰蛋白酶敏感性的差異，對混合培養(yǎng)體系中的乳腺上皮細胞進行純化。純化后得到的乳腺上皮細胞體外培養(yǎng)形態(tài)呈現(xiàn)出典型的鵝卵石狀貼壁生長狀態(tài)。為了鑒定所得到的細胞是否為乳腺上皮細胞，本試驗采用細胞免疫熒光染色法對純化后的細胞進行標志性蛋白角蛋白18檢測。結(jié)果(圖1)顯示，培養(yǎng)體系中絕大部分細胞呈現(xiàn)綠色熒光，即角蛋白18表達陽性，說明本試驗體系得到了高純度的乳腺上皮細胞。

2.2 葡萄糖對乳腺上皮細胞中IL-8、iNOS、TNF-α、LF、TGF-β1和IL-6基因表達的影響

為了研究葡萄糖對乳腺上皮細胞中IL-8、iNOS、TNF-α、LF、TGF-β1和IL-6基因表達的影響，本試驗對培養(yǎng)在不同葡萄糖濃度(0.18、0.50、0.90和4.50 g/L)條件下的乳腺上皮細胞中上述基因的mRNA相對表達量進行了分析。結(jié)果顯示，不同葡萄糖濃度并未對IL-8、iNOS和LF的mRNA相對表達量產(chǎn)生顯著影響(P>0.05)(圖2-A、圖2-B、圖2-C)；IL-6的mRNA相對表達量在前2個較低葡萄糖濃度(0.18和0.50 g/L)之間和后2個較高葡萄糖濃度(0.90和4.50 g/L)之間均未出現(xiàn)顯著差異(P>0.05)，但2個較低葡萄糖濃度條件下IL-6的mRNA相對表達量均顯著高于2個較高葡萄糖濃度條件下(P<0.05)(圖2-D)。類似這種低濃度葡萄糖提高基因表達的情況也出現(xiàn)在了TGF-β1和TNF-α基因的表達中。TGF-β1基因在前2個較低葡萄糖濃度(0.18和0.50 g/L)條件下的mRNA相對表達量均顯著高于高葡萄糖濃度(4.50 g/L)條件下(P<0.05)，而葡萄糖濃度為0.90 g/LTGF-β1的mRNA相對表達量與其他葡萄糖濃度間均無顯著差異(P>0.05)(圖2-E)。對于TNF-α基因(圖2-F)，其mRNA相對表達量隨著葡萄糖濃度的降低出現(xiàn)了波動變化，葡萄糖濃度為0.18 g/L時雖然與0.90 g/L時差異不顯著(P>0.05)，但卻比0.50和4.50 g/L時顯著升高(P<0.05)，而0.50、0.90、4.50 g/L之間差異均不顯著(P>0.05)。

A～F分別為IL-8、iNOS、LF、IL-6、TGF-β1、TNF-α的mRNA相對表達量。A to F were mRNA relative expression levels of IL-8, iNOS, LF, IL-6, TGF-β1 and TNF-α, respectively.

2.3 LPS對乳腺上皮細胞中IL-8、iNOS、TNF-α、LF、TGF-β1和IL-6基因表達的影響

為了分析LPS對乳腺上皮細胞中IL-8、iNOS、TNF-α、LF、TGF-β1和IL-6基因表達的影響，將對照組(0 μg/mL LPS)中各基因的mRNA相對表達量作為1，計算出LPS組(1 μg/mL LPS)中各基因mRNA相對表達量相對于各自對照組的倍數(shù)。結(jié)果顯示，添加LPS極顯著下調(diào)了TGF-β1基因在0.90和4.50 g/L葡萄糖濃度下的mRNA相對表達量(P<0.01)，而其在0.18和0.50 g/L葡萄糖濃度下的mRNA相對表達量與對照組相比雖然有所下降但是差異不顯著(P>0.05)(圖3-A)。與此相比，添加LPS刺激了其余5個基因的表達，其中IL-6、TNF-α和IL-8的mRNA相對表達量在各個葡萄糖濃度下被LPS刺激后都表現(xiàn)出極顯著上調(diào)(P<0.01)(圖3-A、圖3-B、圖3-C)；LF和iNOS的mRNA相對表達量僅在0.18和0.50 g/L葡萄糖濃度下出現(xiàn)極顯著上調(diào)(P<0.01)，后者在4.50 g/L葡萄糖濃度下出現(xiàn)顯著上調(diào)(P<0.05)，而LPS對二者在其他葡萄糖濃度下的mRNA相對表達量無顯著影響(P>0.05)(圖2-A)。從以上結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)LPS對上述基因的表達具有顯著的刺激作用，而這個刺激作用的效果在一定程度上受到了葡萄糖濃度變化的影響，因此有必要進一步分析葡萄糖濃度在LPS刺激這些基因表達過程中的影響。

數(shù)據(jù)柱無標記表示與對照組差異不顯著(P>0.05)，標記“*”和“**”分別表示與對照組差異顯著(P<0.05)和極顯著(P<0.01)。Data columns without marker represents no significant difference (P>0.05) compared with control group, while with “*” and “**” represent significant (P<0.05) and extremely significant difference (P<0.01) compared with control group, respectively.

2.4 葡萄糖對LPS刺激下的乳腺上皮細胞中IL-8、iNOS、TNF-α、LF、TGF-β1和IL-6基因表達的影響

如圖4所示，在LPS(1 μg/mL)刺激下，乳腺上皮細胞中各基因的mRNA相對表達量均隨著培養(yǎng)液中葡萄糖濃度的改變而發(fā)生了顯著的變化。葡萄糖濃度的升高對經(jīng)LPS刺激后IL-8和IL-6基因的表達具有提升的作用。對于IL-8基因(圖4-A)，在葡萄糖濃度為0.18 g/L時mRNA相對表達量最低，在葡萄糖濃度為0.50 g/L時與0.18 g/L時相比有所提升但差異不顯著(P>0.05)，而在葡萄糖增濃度加至0.90 g/L時與0.18 g/L時相比顯著提高(P<0.05)，但沒有顯著高于0.50 g/L時(P>0.05)；當(dāng)葡萄糖濃度提升至最高濃度4.50 g/L時，IL-8的mRNA相對表達量被進一步提高，顯著高于0.18和0.50 g/L時(P<0.05)，但與0.90 g/L時差異不顯著(P>0.05)。對于IL-6基因(圖4-D)，其經(jīng)LPS刺激后的mRNA相對表達量雖然在葡萄糖濃度從0.18 g/L提高到0.50 g/L時出現(xiàn)了顯著下降(P<0.05)的現(xiàn)象，但隨著葡萄糖濃度繼續(xù)增加至0.90和4.50 g/L時，其mRNA相對表達量呈現(xiàn)逐漸升高趨勢，且后3個濃度之間差異顯著(P<0.05)。

對于經(jīng)LPS刺激后的iNOS、TNF-α、LF和TGF-β1基因而言，它們的表達出現(xiàn)了與IL-8和IL-6基因相反的變化趨勢，即葡萄糖濃度的升高促使這些基因的表達下降。LF和TGF-β1的mRNA相對表達量隨著葡萄糖濃度的增加而逐漸下降，并且每個濃度之間均存在顯著差異(P<0.05)(圖4-C和圖4-E)。iNOS的mRNA相對表達量雖然在前2個較低葡萄糖濃度之間差異不顯著(P>0.05)，但當(dāng)葡萄糖濃度增加至0.90和4.50 g/L時其mRNA相對表達量均出現(xiàn)了顯著降低(P<0.05)，而后2個較高葡萄糖濃度之間的差異不顯著(P>0.05)(圖4-B)。TNF-α的mRNA相對表達量變化與iNOS相似，唯一不同的是TNF-α的mRNA相對表達量在最高濃度4.50 g/L時顯著低于0.90 g/L時(P<0.05)(圖4-F)。

A～F分別為IL-8、iNOS、LF、IL-6、TGF-β1、TNF-α的mRNA相對表達量。A to F were mRNA relative expression levels of IL-8, iNOS, LF, IL-6, TGF-β1 and TNF-α, respectively.

3 討 論

乳腺炎作為奶牛養(yǎng)殖過程中投入成本最高和最為流行的疾病，一直受到奶牛生產(chǎn)管理和科研人員的高度重視。在乳腺感染的初始階段很多先天性免疫因子和細胞因子參與其中，對快速清除病原菌和啟動免疫反應(yīng)發(fā)揮了不可替代的作用。在奶牛的多個生理階段當(dāng)中，產(chǎn)犢后的泌乳初期是乳腺炎的高發(fā)時期，此時期的奶牛經(jīng)常處于能量負平衡狀態(tài)。血液中葡萄糖濃度的下降既是造成能量負平衡的原因之一，又是該時期主要的生理現(xiàn)象，其對泌乳初期奶牛乳腺免疫反應(yīng)能力的影響及其與乳腺炎發(fā)病的關(guān)系值得研究和關(guān)注。目前已知有幾種類型的微生物與乳腺炎發(fā)生有關(guān)，主要包括細菌、真菌和酵母菌。大腸桿菌是導(dǎo)致奶牛乳腺感染最常見的革蘭氏陰性菌[1]。LPS是革蘭氏陰性菌外膜的主要成分，被認為是激發(fā)先天性免疫反應(yīng)的強烈刺激因素[2]。鑒于此，本文探究了不同濃度葡萄糖對LPS模擬的炎癥模型中乳腺上皮細胞炎癥相關(guān)基因表達的影響。

3.1 低葡萄糖濃度對乳腺上皮細胞募集中性粒細胞能力的影響

有研究表明，當(dāng)機體受到微生物感染時，感染部位的巨噬細胞分泌的IL-8介導(dǎo)中性粒細胞募集，并誘導(dǎo)中性粒細胞氧化爆發(fā)以消除炎癥刺激并提高對細菌的清除率。當(dāng)IL-8接觸中性粒細胞后，使中性粒細胞形態(tài)改變并游走至反應(yīng)部位并釋放大量可引發(fā)局部炎癥反應(yīng)活性產(chǎn)物，以發(fā)揮殺菌的作用[6,17]。本試驗結(jié)果顯示，在未受LPS刺激時，葡萄糖并未對IL-8基因的表達產(chǎn)生顯著影響，與柴斌[18]在大鼠的腎小球系膜細胞中的試驗結(jié)果相似。本研究結(jié)果還顯示，當(dāng)受到LPS刺激時，葡萄糖濃度的降低會減弱LPS對該基因表達的刺激作用。該研究結(jié)果表明，當(dāng)奶牛處于能量負平衡期間，此時若受到細菌感染，乳腺中IL-8基因的表達將受到不利影響，可能會減弱其對中性粒細胞的募集作用。

研究表明LPS能誘導(dǎo)中性粒細胞產(chǎn)生IL-6，而IL-6是炎癥起始過程中的重要細胞介質(zhì)，能募集到更多的中性粒細胞，并可觸發(fā)嗜中性粒細胞的殺菌作用[19]。鮑運平等[20]的研究結(jié)果顯示，使用氨基葡萄糖治療后的關(guān)節(jié)炎患者的關(guān)節(jié)液中IL-6的表達量出現(xiàn)了降低現(xiàn)象。本研究發(fā)現(xiàn)，IL-6基因在低葡萄糖濃度條件下有較高的表達，而經(jīng)過LPS處理后在低葡萄糖濃度條件下該基因的表達出現(xiàn)下調(diào)趨勢。由此可見，能量負平衡期間的低血糖環(huán)境不利于機體產(chǎn)生更多的IL-6以應(yīng)對病原菌的入侵。

3.2 低葡萄糖濃度對乳腺上皮細胞免疫抑制作用的影響

TNF-α被認為是一種細胞因子，主要由淋巴細胞和巨噬細胞等產(chǎn)生[21]。TNF-α具有多種免疫功能，除了抗菌活性和抗炎作用之外，還可以調(diào)節(jié)一些生理功能，如發(fā)熱、能量代謝等活動[21]。諸多因素如細胞因子和LPS等誘導(dǎo)TNF-α產(chǎn)生后，與其他細胞因子[如白細胞介素-2(IL-2)]相結(jié)合介導(dǎo)免疫炎癥反應(yīng)，如乳房炎[22]。孫光野等[9]的研究結(jié)果也同樣顯示，在處于能量負平衡的奶牛血液中TNF-α的水平高于健康奶牛，并且高水平的TNF-α被認為是能量負平衡期間免疫抑制的指標之一。本研究結(jié)果顯示，在未受LPS刺激時，低葡萄糖濃度時TNF-α的mRNA相對表達量高于其他濃度時；在受到LPS刺激后，TNF-α的mRNA相對表達量在各個葡萄糖濃度下均被顯著升高，尤其以低葡萄糖濃度下升高的最為明顯。由此可見，TNF-α的適當(dāng)增加有助于淋巴細胞向感染部位聚集，實現(xiàn)對病原微生物的清除[9]，然而在能量負平衡情況下受到病原菌感染所引起的TNF-α急劇增加可能會引發(fā)免疫抑制作用，從而降低奶牛免疫細胞的功能，增加炎癥發(fā)生的幾率。

轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-beta,TGF-β)超家族負責(zé)調(diào)節(jié)細胞生長分化，參與炎癥、免疫等生理或病理過程，具有廣泛的生物學(xué)活性。TGF-β超家族的成員TGF-β1是一種免疫抑制劑，在免疫反應(yīng)中主要功能為阻礙T、B淋巴細胞的增殖[23]。研究發(fā)現(xiàn),TGF-β1在體內(nèi)也可作為炎性因子參與炎癥的發(fā)生過程[24]。本研究結(jié)果顯示，葡萄糖濃度降低能促進TGF-β1基因的表達，低濃度葡萄糖可以加劇LPS對奶牛乳腺上皮細胞中TGF-β1基因表達的促進作用。由此可以推測，當(dāng)奶牛處于能量負平衡時，由于血糖濃度較低，有助于TGF-β1表達量的升高，容易造成機體免疫抑制，可能會增加患乳腺炎的風(fēng)險。

3.3 低葡萄糖濃度對乳腺上皮細胞抗菌能力的影響

iNOS在正常生理條件下幾乎不表達，但在許多細胞培養(yǎng)研究和動物炎癥模型中，其可以由LPS刺激而被快速短暫地誘導(dǎo)[25-27]。核因子-κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)是介導(dǎo)細胞信號傳遞的重要轉(zhuǎn)錄因子，參與炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)等多種生理過程[28]。iNOS與NF-κB特異性結(jié)合后，能產(chǎn)生大量一氧化氮(NO)。生理性的NO可以使NF-κB水平上升，發(fā)揮抗凋亡的作用。而高水平致病性的NO可抑制NF-κB的抗凋亡活性，損傷細胞功能。大量的NO入血后，會損傷血紅蛋白對氧的運輸、能量代謝等能力，促進炎癥反應(yīng)。在本研究中，未受LPS刺激的乳腺上皮細胞表現(xiàn)為葡萄糖濃度的改變不會顯著影響iNOS基因在細胞內(nèi)的表達。在LPS刺激下，低葡萄糖濃度條件下iNOS基因呈現(xiàn)較高的表達水平。由此可以推測，當(dāng)奶牛處于能量負平衡狀態(tài)時，適量的生理性的NO對奶牛有保護作用，但發(fā)生炎癥后，iNOS的高表達產(chǎn)生了過量致病性的NO，這會對奶牛乳腺上皮細胞和乳腺組織造成不利影響。

LF是一種由上皮細胞、巨噬細胞和中性粒細胞產(chǎn)生的抗菌肽，LF受體與LPS結(jié)合可以發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。LF通過與游離鐵離子結(jié)合，從而阻止利用這些離子作為代謝輔助因子的細菌生長[29]，同時，LF能抑制多種細菌入侵宿主，以避免致病菌通過侵入細胞內(nèi)逃避宿主免疫系統(tǒng)對它們的清除[7]。本研究結(jié)果表明，在未加入LPS的對照組中，葡萄糖濃度的變化不會影響LF的表達。但在加入LPS后，低葡萄糖濃度能增強LPS對LF基因表達的刺激作用。這可能說明，當(dāng)奶牛血糖濃度降低時，奶牛乳腺上皮細胞在受到細菌感染時可以大量合成LF參與免疫反應(yīng)，以清除病原微生物。

綜上所述，當(dāng)處于低葡萄糖濃度條件時，乳腺上皮細胞的抗菌和抗炎能力受到不利影響。此時如果受到感染，iNOS的高表達使細胞產(chǎn)生大量的NO對自身造成一定損害；TGF-β1和TNF-α的高表達促進了免疫抑制作用，降低了乳腺的免疫反應(yīng)能力；而IL-8和IL-6表達水平的下降，降低了對中性粒細胞的募集作用，減弱了乳腺對病原體的清除能力；盡管LF的表達量有所提高，但很難改變低葡萄糖濃度對乳腺整體免疫功能的負面影響。

4 結(jié) 論

在乳腺上皮細胞發(fā)生感染時，盡管低濃度葡萄糖通過促進LF基因的表達保護乳腺組織，但是低濃度葡萄糖仍然通過降低IL-8和IL-6基因的表達減弱二者對中性粒細胞的募集作用，同時通過提高TNF-α、TGF-β1和iNOS基因的表達加重免疫抑制和細胞損傷，對乳腺的免疫功能造成不利影響。因此，奶牛能量負平衡期間的低葡萄糖濃度可能是造成乳腺炎發(fā)病率升高的重要原因之一。