低蛋白質(zhì)飼料中添加血根堿對草魚生長性能、血清生化指標(biāo)和腸道健康的影響

李宜芳 陳 團 胡 毅 石 勇 鐘 蕾

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南省特色水產(chǎn)資源利用工程技術(shù)研究中心，長沙 410128)

蛋白質(zhì)是魚類必需的營養(yǎng)素，也是水產(chǎn)動物生長發(fā)育、組織修復(fù)及維持機體健康等生命活動的主要載體[1]。水產(chǎn)動物對飼料蛋白質(zhì)水平要求高，水產(chǎn)動物飼料配方中蛋白質(zhì)源飼料占比超過70%。如何降低飼料蛋白質(zhì)水平而不影響水產(chǎn)動物的生長是行業(yè)關(guān)注的熱點，提高飼料中蛋白質(zhì)的利用率有助于緩解低蛋白質(zhì)飼料引起的魚類生長性能和免疫功能下降現(xiàn)象[2]。大量研究表明，功能性植物提取物對提高飼料蛋白質(zhì)利用率和魚類免疫力切實可行，已有海帶多糖(laminarin)增強斑點叉尾鮰(Ictaluruspunctatus)免疫功能[3]、穿心蓮內(nèi)酯(andrographolide)提高露斯塔野鯪(Labeorohita)的非特異性免疫能力[4]、黃芪多糖(Astragaluspolysaccharide)提高斑馬魚(Brachydanioreriovar)生長性能[5]以及巖藻多糖(fucoidan)提高動物生長性能及抗氧化能力[6]等相關(guān)研究。

血根堿(sanguinarine)是一種苯菲啶異喹啉類生物堿，是國內(nèi)首個天然植物源性藥物飼料添加劑，不僅具有抗炎[7]、抗菌[8]和抗氧化[9]等作用，還可提高動物對飼料蛋白質(zhì)的利用率[10]，促進機體對氨基酸的吸收[11]。本實驗室前期研究證明，黃鱔(Monopterusalbus)飼料中添加750 μg/kg血根堿，可以緩解由大腸桿菌脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)對魚體造成的免疫應(yīng)激及炎癥反應(yīng)[7]；高棉籽粕-菜籽粕中添加血根堿可促進草魚(Ctenopharyngodonidella)生長，改善腸道組織形態(tài)及微生物群落結(jié)構(gòu)，促進腸道免疫屏障功能。此外，在銀大眼鯧(Monodactylusargenteus)[12]、金魚(Carassiusauratus)[13]、錦鯉(Cryprinuscarpiod)[14]等研究中已證明，血根堿可提高魚體生長性能及免疫應(yīng)答，緩解炎癥反應(yīng)，改善腸道微生物群落結(jié)構(gòu)，具有良好的應(yīng)用前景。然而，血根堿在低蛋白質(zhì)飼料中的應(yīng)用研究還未見報道。

草魚隸屬于鯉科、草魚屬，是典型的草食性魚類[15]?！?021中國漁業(yè)統(tǒng)計年鑒》顯示，草魚產(chǎn)量為557.11萬t，穩(wěn)居淡水養(yǎng)殖魚類第一[16]。草魚魚苗到魚種階段蛋白質(zhì)需求量為30%～35%[17]。蛋白質(zhì)是飼料的主要部分，在養(yǎng)殖成本中，飼料成本占比達50%以上。因此，本研究以草魚為試驗對象，研究低蛋白質(zhì)飼料中添加血根堿對草魚生長性能、血清生化指標(biāo)和腸道健康的調(diào)節(jié)作用，為有效降低養(yǎng)殖成本及血根堿在魚類飼料中的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗飼料

參照草魚商品飼料配方，設(shè)置蛋白質(zhì)水平為30.00%的飼料為正常蛋白質(zhì)組(CON組)；降低正常蛋白質(zhì)組飼料中魚粉和豆粕水平，以蛋白質(zhì)水平為28.00%的飼料為低蛋白質(zhì)組，并在低蛋白質(zhì)飼料中分別添加0(Sa0組)、200(Sa200組)、400(Sa400組)和800 mg/kg(Sa800組)的血根堿(血根堿由湖南某生物資源有限公司提供，純度為0.15%，實際加入的血根堿為0、0.3、0.6和1.2 mg/kg)，共配制5組飼料。飼料原料經(jīng)利達超微粉碎機粉碎后過40目篩，按照配方要求準(zhǔn)確稱量各種原料，混勻后采用雙螺旋壓條機擠壓出粒徑2.0 mm的顆粒飼料，于陰涼處風(fēng)干后，-20 ℃保存?zhèn)溆?。試驗飼料組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 試驗飼料組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

續(xù)表1項目 Items組別 GroupsCONSa0Sa200Sa400Sa800粗脂肪 Crude fat56.959.359.359.359.3粗灰分 Ash92.686.386.386.386.3水分 Moisture102.0126.4126.4126.4126.4

1.2 飼養(yǎng)管理

飼養(yǎng)試驗于湖南省婁底市車田江水庫網(wǎng)箱中進行，試驗魚購回后，暫養(yǎng)于5 m×4 m×3 m的網(wǎng)箱中，待其適應(yīng)養(yǎng)殖環(huán)境后，隨機挑選體格健壯、規(guī)格統(tǒng)一的草魚375尾，初始體重為(91.04±0.37) g，置于2 m×2 m×2 m的網(wǎng)箱中，試驗共設(shè)5個組，每組3個重復(fù)，每個重復(fù)25尾魚，試驗持續(xù)8周。使用30.00%正常蛋白質(zhì)水平飼料對試驗魚進行1周左右馴化，待其可以正常攝食后，正式開始試驗。試驗期間，日投喂量以草魚體重的3%～5%為標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)天氣及攝食情況進行調(diào)整。記錄每日水溫、天氣、攝食及死亡情況。試驗期間水體氨氮濃度≤0.20 mg/L，水溫為(27.3±3.6) ℃。

1.3 樣品采集及測定

1.3.1 草魚生長性能測定

養(yǎng)殖試驗結(jié)束時，停食24 h，記錄每個網(wǎng)箱試驗魚的總尾數(shù)和總體重以及投喂飼料量等，計算草魚增重率(weight gain rate,WGR)、成活率(survival rate,SR)、飼料系數(shù)(feed conversion ratio,FCR)、蛋白質(zhì)效率(protein efficiency ratio,PER)和攝食率(feed rate,FR)等生長性能指標(biāo)。每個網(wǎng)箱隨機取5尾魚，測定體長、體重、內(nèi)臟團及肝臟質(zhì)量，計算肥滿度(condition factor,CF)、肝體比(hepatosomatic index,HSI)和臟體比(viscerosomatic index,VSI)。

增重率(%)=100×(Wt-W0)/W0；
成活率(%)=100×(Nt/N0)；
飼料系數(shù)=Wf/(Wt-W0)；
蛋白質(zhì)效率(%)=100×[(Wt-W0)/Fp]；
攝食率(%/d)=100×Wf/[(W1+W2)×d/2]；
肥滿度(g/cm3)=100×W/L3；
肝體比(%)=100×Wh/W；
臟體比(%)=100×Wv/W。

式中：Wt為終末總體重(g)；W0為初始總體重(g)；Nt為終末尾數(shù)；N0為初始尾數(shù)；Wf為攝入飼料量；W1為初始均重；W2為終末均重；d為養(yǎng)殖天數(shù)；Fp為蛋白質(zhì)攝入量；Wh為魚肝臟重(g)；Wv為魚內(nèi)臟重(g)；L為采樣個體體長(cm)；W為采樣個體體重(g)。

1.3.2 草魚血清生化指標(biāo)、腸道消化酶活性及抗氧化能力的測定

養(yǎng)殖試驗結(jié)束后，停食24 h，每個網(wǎng)箱隨機取5尾魚，用1.0 mL無菌注射器尾靜脈取血，置于1.5 mL離心管中，4 ℃靜置過夜，3 000 r/min離心10 min，取上清液混裝于0.5 mL無菌離心管中，-80 ℃保存。每個網(wǎng)箱隨機取3尾草魚，迅速分離腸道組織，用生理鹽水清洗，裝于1.5 mL的無酶離心管中，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

草魚血清葡萄糖(glucose,GLU)、總蛋白(total protein,TP)、總膽固醇(total cholesterol,TCHO)、甘油三酯(triglyceride,TG)、尿素氮(urea nitrogen,UN)含量，腸道胰蛋白酶(trypsin)、脂肪酶(lipase)、淀粉酶(amylase)、鈉鉀ATP酶(Na+-K+-ATPase)、肌酸激酶(creatine kinase,CK)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)活性以及丙二醛(malondiadehyde,MDA)、還原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)含量等指標(biāo)均采用南京建成生物工程研究所的試劑盒測定。

1.3.3 草魚腸道組織切片的制作與觀察

養(yǎng)殖試驗結(jié)束后，停食24 h，每個網(wǎng)箱取3尾草魚，解剖分離無內(nèi)容物的后腸，用4%甲醛溶液固定24 h，采用常規(guī)蘇木精-伊紅(HE)染色后在光學(xué)顯微鏡下進行觀察。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2010和SPSS 19.0軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，并采用Duncan氏法進行多重比較，P<0.05表示差異顯著，結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SE)”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 低蛋白質(zhì)飼料中添加血根堿對草魚生長性能的影響

由表2可知，各組草魚終末體重、增重率、飼料系數(shù)、成活率、蛋白質(zhì)效率、攝食率、肝體比和臟體比之間均無顯著差異(P>0.05)；與Sa0組相比，Sa800組草魚肥滿度顯著降低(P<0.05)，其他各組草魚肥滿度之間均無顯著差異(P>0.05)。

表2 低蛋白質(zhì)飼料中添加血根堿對草魚生長性能的影響

2.2 低蛋白質(zhì)飼料中添加血根堿對草魚血清生化指標(biāo)的影響

由表3可知，與CON組相比，Sa0組、Sa200組和Sa400組草魚血清葡萄糖、甘油三酯和總膽固醇含量有所降低(P>0.05)，且3組間上述指標(biāo)無顯著差異(P>0.05)；Sa800組血清葡萄糖、甘油三酯和總膽固醇含量有所提高(P>0.05)。此外，Sa800組草魚血清葡萄糖和甘油三酯含量顯著高于Sa0組、Sa200組和Sa400組(P<0.05)，血清總膽固醇含量顯著高于Sa400組(P<0.05)。各組草魚血清總蛋白和尿素氮含量之間無顯著差異(P>0.05)。

表3 低蛋白質(zhì)飼料中添加血根堿對草魚血清生化指標(biāo)的影響

2.3 低蛋白質(zhì)飼料中添加血根堿對草魚腸道消化酶活性的影響

由表4可知，與CON組相比，Sa0組草魚腸道脂肪酶和淀粉酶活性顯著降低(P<0.05)；Sa200組、Sa400組和Sa800組腸道脂肪酶活性顯著高于Sa0組(P<0.05)，且Sa800組腸道脂肪酶活性顯著高于Sa200組和Sa400組(P<0.05)；Sa800組腸道淀粉酶活性有高于Sa0組、Sa200組和Sa400組的趨勢(P>0.05)；與CON組相比，Sa800組腸道鈉鉀ATP酶活性顯著提高(P<0.05)，且有高于Sa0組、Sa200組和Sa400組的趨勢(P>0.05)；與Sa0組相比，Sa800組腸道肌酸激酶活性顯著提高(P<0.05)，且有高于CON組的趨勢(P>0.05)。

表4 低蛋白質(zhì)飼料中添加血根堿對草魚腸道消化酶活性的影響

2.4 低蛋白質(zhì)飼料中添加血根堿對草魚腸道抗氧化能力的影響

由表5可知，與CON組相比，Sa0組草魚腸道超氧化物歧化酶活性和還原型谷胱甘肽含量顯著降低(P<0.05)，腸道谷胱甘肽過氧化物酶活性有降低趨勢(P>0.05)；與Sa0組相比，Sa200組、Sa400組和Sa800組腸道超氧化物歧化酶活性顯著提高(P<0.05)，且與CON組相比均無顯著差異(P>0.05)，3組之間亦無顯著差異(P>0.05)；與Sa0組相比，Sa200組、Sa400組和Sa800組腸道還原型谷胱甘肽含量和谷胱甘肽過氧化物酶活性顯著提高(P<0.05)，且以Sa800組最高；各組之間腸道丙二醛含量無顯著差異(P>0.05)。

表5 低蛋白飼料中添加血根堿對草魚腸道抗氧化能力的影響

2.5 低蛋白質(zhì)飼料中添加血根堿對草魚腸道組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

由圖1可知，與CON組(圖1-a)相比，Sa0組草魚腸道絨毛稀疏且絨毛出現(xiàn)斷裂損傷(圖1-b)。飼料中添加血根堿后，Sa200組(圖1-c)和Sa400組(圖1-d)腸道絨毛損傷現(xiàn)象得到改善，但排列不整齊；Sa800組(圖1-e)腸道絨毛排列整齊度及密集度均有改善，并且絨毛輪廓清晰?？傮w而言，Sa0組、Sa200組、Sa400組和Sa800腸道肌層厚度均優(yōu)于CON組。

a：CON組 CON group；b：Sa0組 Sa0 group；c：Sa200組 Sa200 group；d：Sa400組 Sa400 group；e：Sa800組 Sa800 group。方框表示腸道絨毛斷裂損傷。The box indicated fractured and damaged of intestinal villus.

3 討 論

3.1 低蛋白質(zhì)飼料中添加血根堿對草魚生長性能和血清生化指標(biāo)的影響

蛋白質(zhì)是細(xì)胞、組織的重要組成部分，能為水產(chǎn)動物提供必需氨基酸和能量，對水產(chǎn)動物的生長和發(fā)育有著重要作用[18]。本研究中，與30.00%蛋白質(zhì)組(CON組)相比，28%低蛋白質(zhì)組(Sa0組)草魚增重率有所降低，這與黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)幼魚[19]、斷奶仔豬[20]等的研究結(jié)果類似，生長性能降低可能是由于飼料中蛋白質(zhì)水平不能滿足動物營養(yǎng)所需，導(dǎo)致動物生長受阻[12]；此外，本試驗差異不顯著的原因可能是養(yǎng)殖周期較短且2個蛋白質(zhì)水平相差較小，未能使草魚生長性能出現(xiàn)顯著性差異。血根堿可作為促生長類飼料添加劑[8]，在草魚[21]、錦鯉[14]等的研究中已證實，其可以促進動物對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，提高動物生長性能及機體免疫力。這與本試驗結(jié)果一致，飼料中添加800 mg/kg血根堿可以提高草魚增重率和蛋白質(zhì)效率。

魚類生理機能及健康狀況可從血清生化和免疫指標(biāo)上反映[22]。其中，血清總蛋白含量反映了機體對蛋白質(zhì)的吸收與代謝情況，血清尿素氮含量反映機體蛋白質(zhì)代謝和氨基酸平衡[23]。本試驗中，低蛋白質(zhì)飼料對草魚血清總蛋白和尿素氮含量無顯著影響，這與車彥卓等[24]的研究結(jié)果類似，說明低蛋白質(zhì)飼料對機體蛋白質(zhì)代謝影響不大，而飼糧中添加800 mg/kg血根堿使草魚血清總蛋白和尿素氮含量升高，可能是因為在血根堿的作用下，機體新陳代謝得到提高，使得血清尿素氮含量較高，但具體原因還有待于進一步研究。血清總膽固醇和甘油三酯是機體重要的脂類物質(zhì)，其含量反映了機體脂質(zhì)代謝狀況[25]。本試驗結(jié)果顯示，低蛋白質(zhì)飼料使草魚血清總膽固醇和甘油三酯含量降低，可能是由于魚粉是一種脂肪含量相對較高的蛋白質(zhì)源，飼料中魚粉水平降低后，機體脂肪代謝水平受到影響，而低蛋白質(zhì)飼料中添加血根堿后，血清總膽固醇和甘油三酯含量升高，可能是血根堿促進了肝臟對脂質(zhì)的吸收，提升了魚體脂肪代謝。血液中的葡萄糖是細(xì)胞代謝活動的能量來源[26]。本試驗中，與30.00%蛋白質(zhì)組相比，低蛋白質(zhì)飼料使草魚血清葡萄糖含量降低，說明低蛋白質(zhì)飼料會降低機體能量代謝水平，而當(dāng)在低蛋白質(zhì)飼料中添加800 mg/kg血根堿時，草魚血清葡萄糖含量顯著提高，這說明血根堿能通過促進魚體對糖的吸收和轉(zhuǎn)運，減少蛋白質(zhì)的消耗，從而發(fā)揮節(jié)約蛋白質(zhì)的作用。以上結(jié)果說明，飼料中添加血根堿提高了草魚對蛋白質(zhì)、脂肪和能量的代謝能力。

3.2 低蛋白質(zhì)飼料中添加血根堿對草魚腸道消化酶活性和組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

腸道是魚類進行消化吸收的主要場所，腸道消化酶能將飼料中的大分子營養(yǎng)物質(zhì)降解為氨基酸、葡萄糖等小分子營養(yǎng)物質(zhì)供魚體吸收，腸道組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的完整性以及消化酶活性對魚體消化功能有著重要作用[25]。本試驗結(jié)果顯示，低蛋白質(zhì)飼料使草魚胰蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶及肌酸激酶活性均有所降低，可能的原因是消化酶由消化腺所分泌[27]，當(dāng)飼料中蛋白質(zhì)水平降低后，能被消化吸收的營養(yǎng)物質(zhì)減少，導(dǎo)致消化酶的分泌量及活性下降；而在低蛋白質(zhì)飼料中添加血根堿后，草魚腸道消化酶活性有所升高，這與腸道組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的結(jié)果相對應(yīng)，草魚腸道絨毛排列整齊度、密集度及絨毛寬度在800 mg/kg血根堿添加組均有改善，且腸道絨毛無斷裂損傷現(xiàn)象。這與Liu等[21]的研究結(jié)果類似，說明血根堿可以通過提高草魚腸道消化酶活性，改善腸道組織形態(tài)結(jié)構(gòu)，增大消化吸收面積，加強魚體對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，這也與生長性能的結(jié)果一致。

3.3 低蛋白質(zhì)飼料中添加血根堿對草魚腸道抗氧化能力的影響

魚類免疫系統(tǒng)平衡可由體內(nèi)多種抗氧化酶維持，當(dāng)機體內(nèi)氧自由基過多時，抗氧化酶活性升高，使氧化應(yīng)激水平降低，從而維持機體健康[28]。超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶是機體內(nèi)重要的抗氧化酶[29]；丙二醛主要是活性氧對多不飽和脂質(zhì)降解的過氧化產(chǎn)物，其含量越高，機體內(nèi)氧化應(yīng)激水平越高[19]。有研究表明，飼料中蛋白質(zhì)水平較低時會使鯉(Cyprinuscarpio)及鳙(Aristichthysnobilis)肝臟超氧化物歧化酶和過氧化氫酶活性降低，肝臟總抗氧化能力下降[30-31]。本試驗結(jié)果顯示，低蛋白質(zhì)飼料使草魚腸道超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶活性降低；楊賀舒等[19]在黃顙魚中也得到類似結(jié)果，說明低蛋白質(zhì)飼料會破壞魚體氧化還原平衡，使抗氧化酶活性降低。血根堿是一種免疫增強劑，其可以提高動物抗氧化能力，有研究已證實，血根堿可提高蛋雞抗氧化能力及免疫功能[32]；錦鯉飼料中添加血根堿可提高魚體生長性能及免疫應(yīng)答，改善腸道健康[14]。本試驗結(jié)果顯示，低蛋白質(zhì)飼料中添加血根堿后，草魚腸道抗氧化酶活性有所升高，且在添加800 mg/kg血根堿時，草魚腸道超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶活性均顯著高于未添加低蛋白質(zhì)組，腸道丙二醛含量則保持較低水平；同時，該組草魚腸道絨毛無斷裂損傷現(xiàn)象，絨毛排列整齊度、密集度及絨毛寬度均有改善。這說明血根堿可提高魚體抗氧化能力，改善腸道組織形態(tài)結(jié)構(gòu)，維持機體健康。推測可能是因為血根堿能夠抑制佛波醇肉豆蔻酸酯誘導(dǎo)的氧化裂解和還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶復(fù)合物活性[33]，及時清除機體內(nèi)的氧自由基，降低機體氧化應(yīng)激水平，改善腸道組織結(jié)構(gòu)，完善機體防御體系及提升機體免疫力，但具體作用機制有待進一步研究。

4 結(jié) 論

低蛋白質(zhì)飼料有使草魚生長性能下降的趨勢，而在低蛋白質(zhì)飼料中添加血根堿后能夠促進草魚脂肪代謝及對糖類的吸收，提高腸道消化酶活性和抗氧化能力，改善腸道組織形態(tài)結(jié)構(gòu)，且以800 mg/kg添加水平效果較佳。