稻草替代部分全株玉米青貯對(duì)奶牛瘤胃菌群結(jié)構(gòu)的影響及差異表達(dá)基因功能分析

任文義 冶文興 田 梅 楊雙鳴 張力莉 徐曉鋒

(寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，銀川 750021)

瘤胃微生物是反芻動(dòng)物消化系統(tǒng)不可分割的一部分，它們不僅滿足反芻動(dòng)物的大部分營(yíng)養(yǎng)需求，而且負(fù)責(zé)高達(dá)90%的代謝需求[1-2]。因此，深入了解瘤胃微生態(tài)以及復(fù)雜的微生物群落變化對(duì)提高反芻動(dòng)物生產(chǎn)效益十分重要。隨著組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，瘤胃微生物的功能潛力及其與動(dòng)物性能的關(guān)系也得到了研究[3-8]。瘤胃中不同的微生物群落成員能夠進(jìn)行類似的代謝途徑，并在不同的代謝途徑中相互替代，這是瘤胃微生物可塑性的一個(gè)關(guān)鍵特征；然而，這也是在解開單一成員的不同功能特性方面的一個(gè)重大挑戰(zhàn)，因?yàn)榇嬖诖罅康幕祀s效應(yīng)。這就需要新的生物技術(shù)和計(jì)算方法來捕捉和整合不同的相互關(guān)系、動(dòng)態(tài)和路徑。宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)可提供微生物的組成和信息表達(dá)[9]。研究表明，宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)是揭示奶牛瘤胃微生物功能與飼料效率之間關(guān)系的更好方法，可以通過準(zhǔn)確闡明注釋的基因哪些被轉(zhuǎn)錄以及在何種程度上轉(zhuǎn)錄，從而能夠證明細(xì)菌環(huán)境中的潛在功能，發(fā)現(xiàn)更多的纖維降解微生物種類和家族基因[10]。

飼料短缺導(dǎo)致低收入和中等收入國(guó)家的畜牧生產(chǎn)出現(xiàn)巨大的差距，雖然我國(guó)秸稈資源豐富，但是與之不相符的是秸稈資源利用率偏低。研究表明，合適的稻草添加量、飼料配比以及稻草的加工工藝都可以有效增加草食動(dòng)物的經(jīng)濟(jì)效益[11-14]。Xie等[15]研究發(fā)現(xiàn)，低品質(zhì)粗飼料干預(yù)對(duì)瘤胃微生物結(jié)構(gòu)有顯著影響，在用高品質(zhì)粗飼料飼喂反芻動(dòng)物的同時(shí)使用低品質(zhì)粗飼料進(jìn)行反復(fù)干預(yù)可以提高宿主的纖維溶解消化率。He等[16]通過宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)湖羊瘤胃微生物編碼了一系列能夠降解纖維素的新型酶。而利用宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究低品質(zhì)粗飼料對(duì)瘤胃微生物生態(tài)系統(tǒng)影響的甚少。若能了解低品質(zhì)高纖維粗飼料在瘤胃中的降解特性，并揭示其調(diào)控瘤胃微生物生態(tài)系統(tǒng)的分子機(jī)理，對(duì)飼料資源的利用以及促進(jìn)畜牧業(yè)的發(fā)展有著重要的作用。本試驗(yàn)基于宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)研究稻草替代部分比例全株玉米青貯對(duì)奶牛瘤胃微生物組成、差異表達(dá)基因、信號(hào)通路和碳水化合物活性酶(CAZy)的影響，可幫助人們更好地理解不同飼料來源的瘤胃微生物生態(tài)變化和調(diào)節(jié)機(jī)制以及與宿主之間的內(nèi)在聯(lián)系，豐富關(guān)于纖維消化與反芻動(dòng)物瘤胃微生物群落之間的關(guān)系信息，挖掘多種木質(zhì)纖維素降解酶，從而提高瘤胃微生物群落作為一種獨(dú)特資源的利用率，并為實(shí)際生產(chǎn)中稻草資源的利用提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與設(shè)計(jì)

飼養(yǎng)試驗(yàn)在寧夏農(nóng)墾賀蘭山奶業(yè)茂盛牧場(chǎng)進(jìn)行。選取8頭健康、體重接近的泌乳后期中國(guó)荷斯坦奶牛，隨機(jī)分為2組，每組4個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)1頭牛。CS組奶牛飼糧中粗飼料由苜蓿、苜蓿青貯與全株玉米青貯組成；RS組奶牛飼糧是由稻草替代CS組飼糧的粗飼料中1/3的全株玉米青貯，其他成分不變。試驗(yàn)期共21 d，其中預(yù)試期14 d，正試期7 d。

1.2 試驗(yàn)飼糧與飼養(yǎng)管理

表1 試驗(yàn)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

產(chǎn)奶凈能為計(jì)算值[17]，其他為實(shí)測(cè)值。

NELwas a calculated value[17], while the others were measured values.

1.3 樣品采集與處理

奶牛瘤胃液的采集方法：使用牛鼻夾固定牛頭，將不銹鋼彈簧蛇管(內(nèi)部乳膠管)從口腔送入瘤胃內(nèi)，牛咀嚼過程中瘤胃液順導(dǎo)管自然流出，對(duì)流出的瘤胃液進(jìn)行收集即可。試驗(yàn)第19天開始采集瘤胃液，每天采集4次，分別為飼喂前和飼喂后2、6和12 h，連續(xù)采樣3 d。將瘤胃液進(jìn)行混合分裝至5 mL凍存管中，快速轉(zhuǎn)移至液氮中冷凍保存，隨后立即轉(zhuǎn)移至-80 ℃超低溫冰箱中保存，以備后續(xù)檢測(cè)。

1.4 測(cè)序及生物信息學(xué)分析

提取樣品總RNA、構(gòu)建文庫及測(cè)序由北京諾禾致源科技股份有限公司完成，測(cè)序平臺(tái)為Illumina NovaSeq 6000測(cè)序平臺(tái)。測(cè)序得到的原始數(shù)據(jù)經(jīng)過質(zhì)控到有效數(shù)據(jù)，然后進(jìn)行物種注釋分析、差異表達(dá)基因分析、功能數(shù)據(jù)庫注釋分析。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

數(shù)據(jù)均先采用Excel 2019進(jìn)行初步整理，然后采用SAS 9.4進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性分析，多重比較采用Duncan氏法進(jìn)行，以P<0.05作為差異顯著性的判斷標(biāo)準(zhǔn)。

以|log2(差異倍數(shù))|>0且P<0.05為標(biāo)準(zhǔn)，使用DEGSeq 1.12和Deseq 1.10.1軟件對(duì)CS組和RS組進(jìn)行差異表達(dá)基因篩選和分析，采用GOSeq 1.10，topGO 2.10軟件對(duì)差異表達(dá)基因集進(jìn)行GO功能富集分析，利用KOBAS v2.0.12軟件篩選KEGG數(shù)據(jù)庫中差異表達(dá)基因富集到的信號(hào)通路，使用CAZy數(shù)據(jù)庫的對(duì)應(yīng)工具HMMSCAN將基因集與CAZy數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)。以P<0.05作為差異顯著性的閾值。

2 結(jié)果與分析

2.1 宏轉(zhuǎn)錄組文本概述

經(jīng)過對(duì)原始reads過濾之后，本試驗(yàn)共獲得8個(gè)生物學(xué)獨(dú)立的宏轉(zhuǎn)錄組測(cè)序文本(表2)，共獲得377 690 128條有效reads。數(shù)據(jù)整體測(cè)序錯(cuò)誤率在0.02%～0.03%，Q20>96%，Q30>91%，說明建庫和測(cè)序質(zhì)量好，滿足后續(xù)分析要求。

表2 測(cè)序結(jié)果匯總

2.2 物種注釋結(jié)果

由圖1和圖2可知，在門水平上，CS組和RS組瘤胃微生物組成基本相似，CS組和RS組的優(yōu)勢(shì)菌門均為擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)和變形菌門(Proteobacteria)。在屬水平上，飼糧類型對(duì)奶牛瘤胃微生物組成有較大影響，CS組和RS組的優(yōu)勢(shì)菌屬均為普雷沃氏菌屬(Prevotella)、叢枝菌根真菌屬(Rhizophagus)和瘤胃球菌屬(Ruminococcus)。由表3可知，CS組廣古菌門(Euryarchaeota)、瘤胃球菌屬、甲烷短桿菌屬(Methanobrevibacter)、絲狀桿菌屬(Fibrobacter)的相對(duì)豐度顯著低于RS組(P<0.05)。

2.3 差異表達(dá)基因分析和基因組功能注釋

2.3.1 差異表達(dá)基因分析

通常求解超參數(shù)的方法是利用邊緣似然函數(shù)來推導(dǎo)模型的參數(shù),最終采用共軛梯度法獲得邊緣似然最大值來求解超參數(shù)。但是,共軛梯度法存在明顯缺點(diǎn),例如容易陷入局部最優(yōu)解、對(duì)初始值依賴性強(qiáng)等。為了克服共軛梯度法學(xué)習(xí)超參數(shù)的缺點(diǎn),很多學(xué)者利用已有的一些其他優(yōu)化算法來學(xué)習(xí)超參數(shù),如粒子群算法、人工蟻群算法以及遺傳算法等[12-14]。相比之下,遺傳算法具有極強(qiáng)的自組性,對(duì)種群的初始值沒有要求,在多目標(biāo)隱性參數(shù)的優(yōu)化求解上有著良好的應(yīng)用。此外,遺傳算法不需要利用一階導(dǎo)數(shù)的信息,比共軛梯度法更加簡(jiǎn)單,也更容易操作。因此,本小節(jié)利用遺傳算法來優(yōu)化超參數(shù)。具體步驟如下:

對(duì)CS組和RS組的轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)分析，得到差異表達(dá)基因6 638個(gè)，其中上調(diào)表達(dá)的有2 777個(gè)，下調(diào)表達(dá)的有3 861個(gè)(圖3)，前20個(gè)差異表達(dá)基因如表4所示。對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行聚類分析，繪制聚類熱圖(圖3)，從圖中可以看出組內(nèi)基因的表達(dá)量基本趨于一致，說明生物學(xué)重復(fù)性較好且這些基因可能具有共同的代謝途徑及信號(hào)通路。

2.3.2 差異表達(dá)基因GO富集分析

通過GO數(shù)據(jù)庫對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行功能富集分類。由表5可知，差異表達(dá)基因主要富集于生物合成過程(biosynthetic process)、有機(jī)物質(zhì)的生物合成過程(organic substance biosynthetic process)、細(xì)胞生物合成過程(cellular biosynthetic process)和細(xì)胞代謝過程(cellular metabolic process)等。

圖1 門水平上瘤胃微生物組成

圖2 屬水平上瘤胃微生物組成

表3 稻草替代部分全株玉米青貯對(duì)奶牛瘤胃菌群相對(duì)豐度的影響

圖3 差異表達(dá)基因分析

2.3.3 差異表達(dá)基因KEEG代謝通路分析

對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行KEEG代謝通路進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，共富集到236條信號(hào)通路，選取了富集最顯著的前20條信號(hào)通路，以散點(diǎn)圖形式展示(圖4)。顯著富集于前10位的代謝通路如表6所示，涉及到1 149個(gè)差異表達(dá)基因。其中，KEEG通路富集差異表達(dá)基因較多的通路有丙酸代謝(propanoate metabolism)、碳代謝(carbon metabolism)、丙酮酸代謝(pyruvate metabolism)、檸檬酸循環(huán)(citrate cycle)、丁酸代謝(butanoate metabolism)、甲烷代謝(methane metabolism)。

表4 前20個(gè)差異表達(dá)基因

表5 部分差異表達(dá)基因的GO注釋

續(xù)表5GO編號(hào)GO ID通路注釋Pathway descriptionP值 P-value基因數(shù)Number of genesGO:0009059大分子生物合成過程 Macromolecule biosynthetic process<0.011 279GO:0010467基因表達(dá) Gene expression<0.011 289GO:0009058生物合成過程 Biosynthetic process<0.011 790GO:1901576有機(jī)物質(zhì)的生物合成過程 Organic substance biosynthetic process<0.011 704GO:0044249細(xì)胞生物合成過程 Cellular biosynthetic process<0.011 664GO:0044267細(xì)胞蛋白質(zhì)代謝過程 Cellular protein metabolic process<0.01825GO:0044237細(xì)胞代謝過程 Cellular metabolic process<0.012 362細(xì)胞組成 Cellular componentGO:0005840核糖體 Ribosome<0.01374GO:0030529核糖核蛋白復(fù)合物 Ribonucleoprotein complex<0.01404GO:0043228非膜結(jié)構(gòu)的細(xì)胞器 Non-membrane-bounded organelle<0.01517GO:0043232細(xì)胞內(nèi)非膜結(jié)構(gòu)的細(xì)胞器 Intracellular non-membrane-bounded organelle<0.01517分子功能 Molecular functionGO:0003735核糖體的結(jié)構(gòu)成分 Structural constituent of ribosome<0.01390GO:0005198結(jié)構(gòu)分子活性 Structural molecule activity<0.01540

圖4 差異表達(dá)基因KEEG通路富集分析散點(diǎn)圖(前20個(gè))

表6 差異表達(dá)基因顯著富集的KEEG通路列表

續(xù)表6KEEG編號(hào) KEEG ID通路注釋Pathway descriptionP值P-value基因數(shù)Number of genesko00020檸檬酸循環(huán) Citrate cycle <0.0160ko00720原核生物的碳固定 Carbon fixation pathways in prokaryotes<0.01110ko03020RNA聚合酶 RNA polymerase<0.0182ko00650丁酸代謝 Butanoate metabolism<0.0155ko00260甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝 Glycine, serine and threonine metabolism<0.0162ko00680甲烷代謝 Methane metabolism<0.0169

2.3.4 CAZy功能注釋結(jié)果分析

由圖5可以直觀看出被富集到的基因數(shù)量，其中糖苷水解酶(glycoside hydrolases,GH)是豐度最高的類別，差異表達(dá)基因有28 631個(gè)，其次是碳水化合物結(jié)合模塊(carbohydrate-binding modules,CBM)、糖基轉(zhuǎn)移酶(glycosyl ransferases,GT)、碳水化合物酯酶(carbohydrate sterases,CE)、多糖裂合酶(polysaccharide lyases,PL)、輔助氧化還原酶(auxiliary activities,AA)，差異表達(dá)基因分別有13 457、9 743、3 613、1 738和66個(gè)。此外，富集到纖維素、半纖維素和寡糖降解酶的差異表達(dá)基因的數(shù)量如表7所示。由表7可知，CS組纖維素降解酶GH48和半纖維素降解酶GH8、GH11、GH16富集的差異表達(dá)基因的豐度顯著低于RS組(P<0.05)，寡糖降解酶GH43、GH3、GH2、GH31富集的差異表達(dá)基因的豐度均高于RS組(P>0.05)。

圖5 碳水化合物活性酶基因注釋結(jié)果

3 討 論

3.1 稻草替代部分全株玉米青貯對(duì)奶牛瘤胃微生物組成和結(jié)構(gòu)的影響

反芻動(dòng)物的飼料利用效率主要取決于瘤胃微生物群將潛在可消化飼料轉(zhuǎn)化為可代謝營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的能力[18]。研究表明，厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門是反芻動(dòng)物瘤胃微生物群中的優(yōu)勢(shì)菌門[19-20]。厚壁菌門和擬桿菌門在DNA和蛋白質(zhì)水平上都是豐度最高的成員，包括纖維素降解菌，如產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌、黃色瘤胃球菌、白色瘤胃球菌，以及幾種高效的半纖維素降解菌，如普雷沃氏菌、丁酸弧菌和假丁酸弧菌[21-25]。大量研究發(fā)現(xiàn)，這些細(xì)菌都屬于核心菌群，幾乎在所有反芻動(dòng)物中存在。在本試驗(yàn)中，CS組和RS組的瘤胃微生物中優(yōu)勢(shì)菌門均為厚壁菌門、擬桿菌門和變形菌門，與以上研究結(jié)果一致。在本研究中，RS組奶牛瘤胃內(nèi)具有降解纖維能力的瘤胃球菌及絲狀桿菌等菌屬的相對(duì)豐度均增加，表明在飼喂不同品質(zhì)粗飼料奶牛瘤胃內(nèi)，具有纖維降解能力的細(xì)菌和真菌菌群的相對(duì)豐度存在差異，且在飼喂稻草的奶牛瘤胃內(nèi)，具有纖維降解能力的細(xì)菌菌屬的相對(duì)豐度較高。研究表明，高纖維低品質(zhì)飼糧促進(jìn)瘤胃中乙酸的生成，從而產(chǎn)生更多的氫，促進(jìn)了甲烷的生成，而利用玉米青貯等高品質(zhì)飼糧則會(huì)降低甲烷排放[26-27]。在本試驗(yàn)中，甲烷短桿菌屬在RS組中的相對(duì)豐度顯著高于CS組，表明甲烷排放與反芻動(dòng)物飼糧質(zhì)量之間存在相關(guān)性，飼喂高纖維低質(zhì)量飼糧之后產(chǎn)生的甲烷更多。

表7 奶牛瘤胃微生物差異糖苷水解酶功能基因豐度

3.2 稻草替代部分全株玉米青貯對(duì)奶牛瘤胃微生物差異表達(dá)基因和功能代謝的影響

通過GO功能注釋分析發(fā)現(xiàn)，差異表達(dá)基因主要富集于生物合成過程、有機(jī)物質(zhì)的生物合成過程、細(xì)胞生物合成過程和細(xì)胞代謝過程等GO功能。其中參與細(xì)胞代謝和細(xì)胞合成的差異表達(dá)基因較多，如topB、parC、parE等基因。topB與單鏈DNA緊密結(jié)合，研究表明，topB需要抑制R環(huán)的形成或積累，并且它們對(duì)于防止過度的負(fù)超螺旋及其對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和存活的有害影響至關(guān)重要[28]。parC和parE負(fù)責(zé)編碼拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ，拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ的生理學(xué)作用是通過其解環(huán)鏈體和解DNA結(jié)節(jié)，從而協(xié)助子染色體的分離。但parC和parE在體內(nèi)具有哪些功能，以及缺乏這些重要酶的細(xì)胞如何存活尚不清楚。孫建政[29]研究發(fā)現(xiàn)，在苜蓿青貯中添加松針精油抑制了DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ和拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ的活性，從而抑制了蛋白質(zhì)的表達(dá)及DNA的合成。石超峰等[30]研究發(fā)現(xiàn)，α-松油醇可以抑制大腸桿菌的DNA復(fù)制，可能是因?yàn)槭艿紻NA拓?fù)洚悩?gòu)酶活性的影響。Dai等[31]研究發(fā)現(xiàn)，低品質(zhì)粗飼料可以通過降低能量供應(yīng)、降低核糖體活性和增強(qiáng)蛋白質(zhì)降解能力阻礙乳腺細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育。在本試驗(yàn)中，parC、parE基因顯著富集，并且在KEGG代謝通路分析中，差異表達(dá)基因顯著富集到核糖體，而核糖體是蛋白質(zhì)合成的主要場(chǎng)所。這表明不同品質(zhì)粗飼料可能影響瘤胃中微生物DNA的合成和蛋白質(zhì)的表達(dá)，從而影響細(xì)胞合成和細(xì)胞代謝，但具體的作用機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。通過KEGG代謝通路分析，差異表達(dá)基因主要富集于檸檬酸代謝、丙酮酸代謝、甲烷代謝和揮發(fā)性脂肪酸代謝。其中差異表達(dá)基因中IDH1基因參與檸檬酸循環(huán)途徑。異檸檬酸脫氫酶1(IDH1)通過持續(xù)產(chǎn)生α-酮戊二酸促進(jìn)瘤胃上皮細(xì)胞中的檸檬酸循環(huán)通量，α-酮戊二酸在進(jìn)入線粒體后被代謝[32]。ATP由酮體和檸檬酸循環(huán)產(chǎn)生，為瘤胃上皮細(xì)胞的增殖和分化等生理活動(dòng)提供能量。IDH1異構(gòu)體催化異檸檬酸轉(zhuǎn)化為α-酮戊二酸，其可被谷氨酸脫氫酶胺化形成谷氨酸[33-34]。谷氨酸是體內(nèi)氨的主要轉(zhuǎn)運(yùn)載體，將氨轉(zhuǎn)運(yùn)至肝臟進(jìn)行解毒[35-36]。瘤胃上皮增加對(duì)氨的吸收，以便與谷氨酸和丙酮酸結(jié)合形成無毒的谷氨酰胺，然后轉(zhuǎn)移到肝臟，從而進(jìn)入尿素循環(huán)。同時(shí)，瘤胃上皮對(duì)甘氨酸、纈氨酸、絲氨酸和蛋氨酸的吸收在瘤胃上皮黏膜側(cè)的總氨基酸濃度較低時(shí)較高[37]。IDH1基因影響檸檬酸循環(huán)，檸檬酸循環(huán)可以響應(yīng)機(jī)體的能量狀態(tài)，積極地參與機(jī)體的代謝協(xié)調(diào)，這可能是影響KEGG代謝通路中的檸檬酸代謝、丙酮酸代謝與氨基酸代謝途徑的主要原因。研究發(fā)現(xiàn)nrdD基因主要參與厭氧代謝，在大腸桿菌中，有氧和厭氧生長(zhǎng)過程中2種獨(dú)立的酶催化核糖核苷酸的還原，好氧酶由nrdAB基因編碼，厭氧酶由nrdDG基因編碼[38-39]。厭氧真菌和厭氧細(xì)菌廣泛存在于反芻動(dòng)物瘤胃中，參與飼料中纖維物質(zhì)的消化過程。在本試驗(yàn)中，CS組nrdD基因表達(dá)下調(diào)，表明厭氧代謝在RS組中發(fā)揮了很大作用，可能是增加了厭氧微生物通過高活性纖維降解酶來分解纖維較高的稻草獲得碳水化合物的過程。隨后大部分碳水化合物通過多種下游途徑發(fā)酵，導(dǎo)致有機(jī)酸、短鏈脂肪酸以及各種代謝物和氣體(如CO2和H2)的產(chǎn)生[40-42]。其中一些排泄的代謝物，如乳酸、琥珀酸、H2和CO2，進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為丙酸、丁酸、乙酸和甲烷等[43-44]。丙酸、丁酸和乙酸等揮發(fā)性脂肪酸是厭氧消化過程的中間產(chǎn)物，而揮發(fā)性脂肪酸代謝中的許多產(chǎn)物又是能量產(chǎn)生的底物，包括還原型黃素腺嘌呤二核苷酸(FADH2)、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)和乙酰輔酶A，它們是檸檬酸循環(huán)的輔酶或底物。研究發(fā)現(xiàn)，檸檬酸和α-酮戊二酸可以通過厭氧真菌發(fā)酵產(chǎn)生，而檸檬酸和α-酮戊二酸都是檸檬酸循環(huán)中的關(guān)鍵物質(zhì)。Cheng等[45]研究發(fā)現(xiàn)，厭氧真菌和相關(guān)產(chǎn)甲烷菌共培養(yǎng)產(chǎn)生檸檬酸，且厭氧真菌代謝被相關(guān)產(chǎn)甲烷菌所改變。因此，在本試驗(yàn)中，稻草替代部分全株玉米青貯后奶牛瘤胃厭氧代謝可能和甲烷短桿菌共同作用影響各種代謝途徑。

3.3 稻草替代部分全株玉米青貯對(duì)奶牛瘤胃微生物CAZy的影響

瘤胃微生物主要是利用其CAZy來降解各種飼料，而主要負(fù)責(zé)水解碳水化合物糖苷鍵的GH家族是植物多糖中最豐富和最多樣的酶家族。在本試驗(yàn)中，編碼半纖維素降解酶的主要基因豐度高于編碼纖維素降解酶，這可能是由于半纖維素側(cè)鏈的多樣性需要多種水解酶來降解。其他CAZy家族，包括CBM、GT和PL，都參與了纖維素、木聚糖和果膠的水解[46]。在目前的研究中，CBM沒有表現(xiàn)出自身的酶活性，但有助于CAZy與多糖結(jié)合，從而增強(qiáng)其活性[47]。研究表明，普雷沃氏菌與參與低聚糖和半纖維素降解的GH家族密切相關(guān)[48]。瘤胃球菌和纖維桿菌與大多數(shù)參與纖維素降解的GH家族相關(guān)，如GH5、GH9、GH45和GH48[49]。在本試驗(yàn)中，主要的纖維降解瘤胃微生物，如擬桿菌、瘤胃球菌、絲狀桿菌等，對(duì)GH家族均有貢獻(xiàn)。Deusch等[50]研究表明，在飼喂以玉米青貯為基礎(chǔ)的飼糧時(shí)，大多數(shù)表達(dá)的GH屬于GH57和GH2。Zhang等[51]研究發(fā)現(xiàn)，高精料飼糧顯著減少與半纖維素酶GH10、GH11、GH54和纖維素酶GH1、GH44、GH45相關(guān)的CAZy的豐度，并增加了1種寡糖降解酶GH32的豐度。本試驗(yàn)結(jié)果與以上研究結(jié)果一致。在CS組中，參與纖維素GH48和半纖維素GH8、GH11、GH16的GH家族差異表達(dá)基因豐度顯著低于RS組，參與寡糖降解的GH家族基因豐度均高于RS組。上述結(jié)果表明，不同飼糧組成對(duì)瘤胃微生物CAZy功能基因組成有明顯影響，稻草替代部分全株玉米青貯提高了與纖維素和半纖維素降解相關(guān)的GH家族基因的豐度，而降低了與寡糖降解相關(guān)的GH家族基因的豐度。

4 結(jié) 論

在本試驗(yàn)條件下，稻草替代部分全株玉米青貯改變了奶牛瘤胃微生物群落組成，具有降解纖維能力的瘤胃球菌屬、絲狀桿菌屬以及與甲烷排放有關(guān)的甲烷短桿菌屬的相對(duì)豐度均得到提高；差異表達(dá)基因主要富集在檸檬酸代謝、丙酮酸代謝、甲烷代謝和揮發(fā)性脂肪酸代謝等途徑；在CAZy變化上，稻草替代部分全株玉米青貯提高了奶牛瘤胃微生物中參與纖維素和半纖維素降解的GH家族基因的豐度，降低了參與寡糖降解的GH家族基因的豐度。