牛羊芽囊原蟲病研究進(jìn)展

周天政，居融程，黃尚選，覃建基，肖華春，李軍成，李鳳梅，彭健波

(1. 廣西農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)大學(xué)，廣西 南寧 530007；2. 田陽尚選畜牧養(yǎng)殖有限責(zé)任公司，廣西 百色 542899)

芽囊原蟲(Blastocystis)是一種厭氧單核細(xì)胞寄生蟲，曾長期被認(rèn)為是一種無害的酵母，但越來越多的研究表明芽囊原蟲廣泛存在于牛羊腸道內(nèi)，對牛羊健康造成威脅，同時(shí)攜帶可感染人類的亞型基因，具有一定的公共衛(wèi)生風(fēng)險(xiǎn)。本文通過對國內(nèi)外牛羊感染芽囊原蟲的相關(guān)研究報(bào)道進(jìn)行分析，從牛羊感染芽囊原蟲的病原學(xué)、基因型、流行病學(xué)、致病性、診斷與防治等方面進(jìn)行綜述，以期為其他動物甚至人類的芽囊原蟲病的預(yù)防和控制提供參考。

1 病原學(xué)

芽囊原蟲的生物學(xué)分類幾經(jīng)波折，曾先后被認(rèn)為是酵母菌、真菌、鞭毛蟲等。1912年首先由Brumpt進(jìn)行分離，并命名為腸道酵母菌[1]。1967年，Zierdt根據(jù)形態(tài)學(xué)、生理學(xué)特點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)其符合原生生物的特征[2]；1988年，Zierdt發(fā)現(xiàn)該生物有一個(gè)或多個(gè)核、光滑粗糙的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基復(fù)合體和線粒體樣細(xì)胞器；但它不能在真菌培養(yǎng)基上生長，也不能被抗真菌藥物殺死，因此排除真菌的假設(shè)[3]。1996年，Silberman等通過與真核生物譜系的部分同源編碼區(qū)進(jìn)行測序?qū)Ρ?，建議將其歸為不等鞭毛門、芽囊原蟲綱、芽囊原蟲目、芽囊原蟲科、芽囊原蟲屬[4]。1998年，Cavalier-Smith通過分子系統(tǒng)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，芽囊原蟲與鞭毛蟲原單胞菌有系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，兩者存在某些共同的生命周期特征，作為脊椎動物的腸道內(nèi)共生體似乎可以在宿主之間傳播。但與原單胞菌不同的是，囊蟲沒有鞭毛，因此Cavalier-Smith建議把它歸于一個(gè)新創(chuàng)建的類囊蟲亞門[5]。近年來隨著分子生物學(xué)、酶系統(tǒng)等技術(shù)發(fā)展，蟲體新的特征被發(fā)現(xiàn)，使其分類學(xué)逐步確定下來。

芽囊原蟲體積小，但形態(tài)結(jié)構(gòu)多樣化，表現(xiàn)出包括空泡、顆粒、阿米巴、包囊等形態(tài)，不同類型形態(tài)大小有所差異(圖1)?？张菪统是蛐?，其特征是一個(gè)大的空泡，空泡可占細(xì)胞體積的90%，在大小上變化很大，直徑為2～200 μm，平均直徑為4～15 μm。顆粒型被認(rèn)為是由空泡型和其他因素引起的。這些因素包括培養(yǎng)基種類，培養(yǎng)基中的血清濃度以及某些抗菌劑，如抗原蟲藥硝基咪唑類藥物可抑制芽囊原蟲生長從而影響其形態(tài)，而其他驅(qū)蟲藥、抗真菌和抗菌藥物氨芐青霉素、鏈霉素和慶大霉素等不會對芽囊原蟲的形態(tài)產(chǎn)生影響。顆粒型與空泡型有許多相似之處，除了顆粒型在周圍胞質(zhì)或中央液泡內(nèi)存在著大量的顆粒，這些顆粒由形態(tài)差異的包涵體、結(jié)晶和脂滴顆粒等組成。阿米巴型相對較小(直徑為2.6～7.8 μm)，并具有延伸的偽足，曾被認(rèn)為是空泡型和包囊型之間的中間體。包囊型體積小(直徑為3～5 μm)，呈球形到卵形，并由多層囊壁保護(hù)，具有較強(qiáng)的抵抗性，能耐受胃液，可在自然外界環(huán)境中存活，被認(rèn)為是芽囊原蟲在體外傳播的主要類型。在常規(guī)糞便檢查或體外培養(yǎng)中常見空泡型，其次是顆粒型。

圖1 芽囊原蟲模式圖

芽囊原蟲具有二元分裂生殖、出芽生殖、裂殖生殖等多種繁殖方式，其中二元分裂生殖最為常見[6]。已有學(xué)者根據(jù)其不同類型的分化特點(diǎn)對它的生命周期進(jìn)行了探索[7]。體外試驗(yàn)結(jié)果表明，芽囊原蟲包囊型在培養(yǎng)基中24 h內(nèi)可發(fā)展成空泡型或顆粒型：在1 h時(shí)，包囊壁明顯增厚；在3 h時(shí)，包囊內(nèi)出現(xiàn)有多個(gè)小液泡，其中包含許多內(nèi)容物，聚集在細(xì)胞質(zhì)中；在6 h左右時(shí)，包囊壁被一層厚厚的包膜取代；在9 h時(shí)，胞體由最初的5 μm擴(kuò)大到7～9 μm，同時(shí)包囊內(nèi)的多個(gè)小空泡在細(xì)胞中央?yún)^(qū)域聚集，最終合并形成中央空泡，這樣空泡內(nèi)包涵體沉積到中央液泡中，形成顆粒型；在12 h時(shí)，蟲體仍被包囊壁包圍，但在內(nèi)部可觀察到二元分裂形成的多個(gè)子細(xì)胞，以及明顯的空泡和顆粒狀；在24 h時(shí)，細(xì)胞表面及包囊壁脫落，完成細(xì)胞分化[8]。一般認(rèn)為臨床上芽囊原蟲以經(jīng)口或糞—口傳播為主，牛羊等動物經(jīng)口攝入包囊型蟲體后，蟲體在大腸中被激活，并發(fā)展成空泡型，最終沉積在糞便排出，但詳細(xì)過程仍需要動物試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。

2 基因型

芽囊原蟲遺傳基因具有多樣性，主要表現(xiàn)為其小亞基核糖體RNA基因(Small subunit rRNA gene,SSU rRNA)的核苷酸多態(tài)性，2013年報(bào)道了17個(gè)經(jīng)典亞型(ST1～ST17)，隨后新的亞型不斷被發(fā)現(xiàn)，目前文獻(xiàn)中已有ST32的相關(guān)報(bào)道。不同的基因亞型表現(xiàn)出不同的宿主特異性、地區(qū)差異性。宿主特異性方面，人芽囊原蟲相關(guān)研究較多，目前已確認(rèn)能感染人的基因亞型主要有10種，分別為ST1～ST9和ST12，我國人群芽囊原蟲基因亞型以ST1～ST3為主，各省市的感染率中以貴州(5.69%)、廣西(4.52%)較高[9]。而牛羊等反芻動物感染芽囊原蟲的基因亞型主要有ST1、ST3、ST4、ST5、ST6、ST10、ST14共7種，在我國云南[10-11]、河南[9，12]、陜西[9，13]、青海[9]、吉林[9]等地的牛羊檢出人獸共患的基因型有ST1、ST3、ST4和ST5，表明牛羊等反芻動物可攜帶危害人類的基因型，需要警惕公共衛(wèi)生風(fēng)險(xiǎn)。在地區(qū)差異性方面，中國、英國、意大利、伊朗、馬來西亞等國家和地區(qū)牛羊感染芽囊原蟲主要基因型有ST10、ST14，其中優(yōu)勢基因亞型均為ST10，但也有個(gè)別地區(qū)或國家有所不同，如美國優(yōu)勢基因亞型為ST5，而哥倫比亞優(yōu)勢基因亞型為ST1。我國不同省份檢出的基因型也有會有差異，如云南牛中檢出ST1、ST5、ST10、ST14這4種基因型[9]，而河南奶牛則可檢出ST1、ST2、ST4、ST5、ST10、ST14這6種基因型[12]。不同年齡階段的易感亞型不同，梁霞霞等[10]發(fā)現(xiàn)成年牛ST10的感染率(80.32%)高于犢牛(74.47%)。而王莎莎[13]研究發(fā)現(xiàn)，秦川牛和奶牛感染芽囊原蟲主要分布于斷奶前犢牛。

3 流行病學(xué)

牛羊芽囊原蟲在美國、英國、意大利、印度尼西亞等多個(gè)國家以及我國的陜西、河南、云南、廣東等地均有報(bào)道。從世界范圍來看，經(jīng)濟(jì)發(fā)達(dá)、衛(wèi)生狀況較為良好的地區(qū)呈現(xiàn)較低的感染率，相反的則有較高的感染率，如意大利為17.82%[14]，印度尼西亞為100%[15]。這些差異性可能與“糞—口”傳播方式有關(guān)，糞便排放及管理不良可成為重要的感染來源。從我國不同區(qū)域來看，發(fā)病率呈現(xiàn)南北方低而西北西南地區(qū)高的趨勢。東北地區(qū)(黑龍江)芽囊原蟲感染率為10%左右[16-17]；而西北地區(qū)(青海、陜西)則為25%左右[13,18]；西南地區(qū)(云南)為27.62%[10]；中原地區(qū)(河南)為19.2%[12]；南方地區(qū)(廣東)為1.88%[19]。

在其他影響因素中，發(fā)育階段、性別、季節(jié)是主要因素。發(fā)育階段方面，牛芽囊原蟲的感染率隨著年齡的增長呈現(xiàn)先增長再降低的趨勢[19]。犢牛斷奶后感染率(38.6%)明顯高于斷奶前的感染率(13.0%)[13]，而犢牛的感染率(47.00%)顯著高于成年牛(20.96%)[20]；從具體月齡來看，Zhu等[16]發(fā)現(xiàn)3～12月齡(36.1%)牛的感染率明顯高于3月齡以內(nèi)牛(18.8%)；Lee等[21]也發(fā)現(xiàn)3～12月齡牛的感染率(20.8%)顯著高于成年牛(7.2%)及3月齡以下的犢牛(4.0%)。斷奶應(yīng)激造成的免疫力低下可能是牛芽囊原蟲感染率升高的重要因素。而羊芽囊原蟲的感染率也有類似的變化趨勢。黑山羊以1～2歲的感染率最高(50.9%)，1歲以下及2歲以上黑山羊的感染率均呈下降趨勢[11]。而奶山羊、絨山羊則在7～11 月齡時(shí)感染率達(dá)到最高(66.5%)[22]。性別方面，牛羊芽囊原蟲病中雄性比雌性更易感。梁霞霞等[10]調(diào)查發(fā)現(xiàn)，云南省云嶺牛雄性的感染率(37.66%)顯著高于雌性的感染率(25.16%)。而謝世臣[11]研究發(fā)現(xiàn)，山羊也有相同的趨勢，雄性感染率(45.0%)顯著高于雌性(32.9%)；上述研究結(jié)果提示芽囊原蟲的感染可能受到激素的影響，但不同性別在各年齡階段中的差異性仍需要研究證實(shí)。季節(jié)方面，夏季芽囊原蟲的檢出率高于其他季節(jié)[17，18，23]，高溫高濕季節(jié)可能適合芽囊原蟲的生長繁殖；但莊爾俊等[24]發(fā)現(xiàn)，云南獨(dú)龍牛在冬季的感染率最高，提示芽囊原蟲流行病學(xué)受多種因素的影響，需要更多臨床試驗(yàn)進(jìn)行證實(shí)。芽囊原蟲的感染還可能與動物品種、糞便形態(tài)及腸道pH等因素有關(guān)。

4 致病性

目前，芽囊原蟲的致病性仍存在一定的爭議，可能與感染的基因型、動物種類等相關(guān)。芽囊原蟲的致病性在人體得到體現(xiàn)，流行病學(xué)調(diào)查顯示，免疫功能低下的人更容易被芽囊原蟲感染。而芽囊原蟲的阿米巴型因能排泄蛋白酶，被認(rèn)為最具危害性，其主要在有癥狀患者的糞便標(biāo)本中被發(fā)現(xiàn)[25]。體外及動物模型研究表明芽囊原蟲因蛋白酶、水解酶等活性，具有潛在的致病性。其中半胱氨酸蛋白酶作為毒力因子可引起細(xì)胞骨架的變化促進(jìn)細(xì)胞凋亡，造成腸道通透性增加；誘導(dǎo)黏膜細(xì)胞產(chǎn)生白細(xì)胞介素-8，造成患者及動物液體流失和腸道炎癥；半胱氨酸蛋白酶還可裂解IgA，從而影響免疫系統(tǒng)[25]。另外質(zhì)譜分析鑒定了芽囊原蟲分泌產(chǎn)物中的20種半胱氨酸蛋白酶、1種絲氨酸蛋白酶和1種天冬氨酸蛋白酶，這些蛋白酶在破壞腸道功能中有重要作用[26]。水解酶能破壞宿主組織，影響宿主腸道微生物群，使人出現(xiàn)腹瀉、腹痛和嘔吐等胃腸道反應(yīng)、蕁麻疹等皮膚癥狀[27]。在大鼠等動物建立的芽囊原蟲感染模型也發(fā)現(xiàn)回腸和盲腸部位有充血、水腫、細(xì)胞黏膜脫落及炎癥細(xì)胞浸潤固有層等病理變化[21]。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)芽囊原蟲的致病性存在種屬差異性，基因型上也會有差別。如ST4和ST7亞型的半胱氨酸蛋白酶活性存在顯著差異，與ST4亞型相比，ST7亞型更能誘導(dǎo)腸道上皮通透性增加[28]。但目前沒有牛羊感染芽囊原蟲病后相關(guān)癥狀或病變的報(bào)道，因此牛羊芽囊原蟲病的影響更多體現(xiàn)在公共衛(wèi)生方面，澳大利亞的研究顯示ST5亞型在養(yǎng)殖場工人中普遍存在[29]，提醒牛羊飼養(yǎng)人員面臨較高的感染風(fēng)險(xiǎn)。

5 診斷與防治

牛羊芽囊原蟲病的診斷方式一般有臨床診斷和實(shí)驗(yàn)室診斷2種。芽囊原蟲寄生于人體的回盲部，平時(shí)并無明顯癥狀，但當(dāng)人體免疫功能低下時(shí)蟲體大量繁殖，可出現(xiàn)腹痛、腹瀉、胃腸脹氣等消化道癥狀；而目前牛羊感染癥狀的報(bào)道很少，因此難以從臨床癥狀進(jìn)行診斷，其診斷方式以實(shí)驗(yàn)室診斷為主，主要有顯微鏡檢查、實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)、血清學(xué)檢查、分子生物學(xué)等。(1)顯微鏡檢查法，該方法操作簡單，但因芽囊原蟲形態(tài)較小且具有多樣性，加上糞便樣品中常含有大量脂質(zhì)內(nèi)含物和糖原沉積，造成芽囊原蟲在顯微鏡觀察中容易與脂質(zhì)體等其他物質(zhì)混淆，影響病原鑒定，該方法目前在臨床中應(yīng)用少。(2)實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)法，通過培養(yǎng)菌株而確診，但其對培養(yǎng)條件有嚴(yán)格要求且培養(yǎng)時(shí)間較長，檢測效率并不高。(3)血清學(xué)檢查法，該方法具有較高特異性，但因芽囊原蟲引起免疫應(yīng)答的抗體效價(jià)不高，且不能區(qū)分感染的亞型，這也限制該方法的應(yīng)用。(4)分子生物學(xué)法，該方法是當(dāng)前診斷芽囊原蟲的主要方法，主要有PCR、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)等。其中基于 SSU rRNA基因檢測和分析的PCR 檢測是一種快捷、高效和敏感的檢測方法，目前已廣泛應(yīng)用于芽囊原蟲的檢測。SSU rRNA 基因序列可以作為芽囊原蟲不同亞型基因序列的標(biāo)記，有利于對芽囊原蟲亞型進(jìn)行統(tǒng)一命名。而LAMP是Notomi等[30]在2000年建立的，具有對實(shí)驗(yàn)設(shè)施要求不高、檢測靈敏度和特異性高等優(yōu)勢，更適合在偏遠(yuǎn)地區(qū)使用。我國王品雪等[31]優(yōu)化LAMP的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，用于檢測牦牛芽囊原蟲，發(fā)現(xiàn)LAMP有較高特異性，且敏感性和重復(fù)性優(yōu)于PCR。

診斷技術(shù)的發(fā)展為疾病開展針對性預(yù)防和治療打下基礎(chǔ)，鑒于芽囊原蟲的糞—口傳播方式，做好牛羊糞便管理和環(huán)境衛(wèi)生工作將是預(yù)防芽囊原蟲病的重要方式。平時(shí)飼養(yǎng)管理中應(yīng)及時(shí)處理欄舍的糞便，通過堆積發(fā)酵等措施殺滅蟲體，同時(shí)保持欄舍干燥通風(fēng)，創(chuàng)造不利于蟲體存活的環(huán)境，定期進(jìn)行欄舍及周邊環(huán)境消毒，殺滅其中的蟲體。牛羊感染芽囊原蟲后能提供治療的藥物不多，甲硝唑是治療人芽囊原蟲的首選藥物，但該藥已禁用于食品動物。一些化學(xué)藥品如復(fù)方新諾明、巴龍霉素等及中藥提取物如石榴根皮(100 μg/mL)[32]、青蒿乙醇提取物(2 000 μg/mL)[33]體外均可抑殺芽囊原蟲，在治療牛羊芽囊原蟲病時(shí)可供參考。

6 展望

牛羊芽囊原蟲的感染情況在世界多個(gè)國家均有研究報(bào)道，表明它是感染牛羊的重要寄生蟲之一。牛羊芽囊原蟲感染呈現(xiàn)出地區(qū)、年齡、性別、品種等方面的差異性，以及牛羊所攜帶的ST1、ST3基因亞型與我國人群常見的感染亞型重疊，提示需要防范芽囊原蟲可能造成的公共衛(wèi)生安全風(fēng)險(xiǎn)。截至目前為止，有關(guān)牛羊芽囊原蟲的生活史、致病性、臨床表現(xiàn)等方面，特別是牛羊的優(yōu)勢基因亞型ST10的致病特點(diǎn)需要深入開展研究，為后續(xù)牛羊芽囊原蟲病的防控提供理論依據(jù)。