口蹄疫O型、A型二價(jià)3B表位缺失滅活疫苗在奶水牛的免疫效果觀察

趙鐘毅，呂 蕎，閉璟珊，文崇利，朱遠(yuǎn)致，韋正吉，鄒聯(lián)斌 ，鄭 威，蘇姣秀，尹德瑋，鄭 敏，胡傳活

(1. 廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西 南寧 530005；2. 廣西動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，廣西 南寧 530001 ；3. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院水牛研究所，廣西 南寧 530000)

口蹄疫(Foot-and-mouth disease,FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)引起的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病[1]。FMDV是一種單股正鏈RNA病毒，編碼4種結(jié)構(gòu)蛋白(Structural proteins，SPs)VP1、VP2、VP3和VP4,以及10種非結(jié)構(gòu)蛋白(Non-structural proteins，NSPs)L、2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D、3AB和3ABC[2]。傳統(tǒng)滅活疫苗工藝步驟在于對(duì)抗原的純化以及去除包括NSPs在內(nèi)的殘留污染物，但由于抗原純化不徹底，殘留的NSPs等污染物會(huì)導(dǎo)致傳統(tǒng)滅活疫苗在區(qū)分感染動(dòng)物和免疫動(dòng)物時(shí)存在較大的干擾[3]?？谔阋?O型、A型二價(jià)3B表位缺失滅活疫苗(O/rV-1株+A/rV-2株)是近幾年新研發(fā)的一種基因缺失標(biāo)記疫苗。與傳統(tǒng)滅活疫苗相比，該疫苗具有以下特點(diǎn)：一是抗原譜廣，通過對(duì)VP1基因上抗原表位進(jìn)行人工改造，對(duì)我國(guó)目前流行的緬甸98、CATHAY、泛亞和IND2001等譜系O型毒株均能提供較強(qiáng)保護(hù)力；二是通過人工缺失NSP 3B上的優(yōu)勢(shì)抗原表位，免疫動(dòng)物不會(huì)產(chǎn)生該表位的抗體，因此可有效區(qū)分疫苗免疫動(dòng)物和感染動(dòng)物。所以應(yīng)用該基因缺失苗更有利于FMD的凈化和無疫區(qū)的建設(shè)。奶水牛是廣西優(yōu)勢(shì)畜牧產(chǎn)業(yè)，由于其個(gè)體較大，野性較強(qiáng)，傳統(tǒng)上通過采集牛食道-咽分泌液(Oesophagus-pharyngeal，OP)進(jìn)行FMD病原學(xué)檢測(cè)的困難較大，因此臨床實(shí)踐中迫切需要一種更好的FMD監(jiān)測(cè)方法，以及疫苗和鑒別檢測(cè)方法。

本試驗(yàn)旨在評(píng)價(jià)口蹄疫 O型、A型二價(jià)3B表位缺失滅活疫苗對(duì)奶水牛臨床應(yīng)用的安全性和有效性，并考察多次免疫該疫苗的動(dòng)物是否仍能與感染動(dòng)物有效區(qū)分，從而為開展奶牛場(chǎng)、種牛場(chǎng)FMD的凈化以及建立無FMD養(yǎng)殖小區(qū)和FMD無疫區(qū)探索可行的技術(shù)方法。

1 材料與方法

1.1 疫苗 口蹄疫O型、A型二價(jià)3B表位缺失滅活疫苗(O/rV-1株+A/rV-2株)(生產(chǎn)批號(hào)：1909001)和口蹄疫O型、A型二價(jià)滅活疫苗(O/HB/HK/99株+AF/72株)(生產(chǎn)批號(hào)：1911001)，由中牧股份蘭州生物藥廠提供。

1.2 檢測(cè)試劑 口蹄疫O型抗體液相阻斷ELISA檢測(cè)試劑盒(生產(chǎn)批號(hào)：20201106101-1)、口蹄疫A型抗體液相阻斷ELISA檢測(cè)試劑盒(生產(chǎn)批號(hào)：20201111103-2)、口蹄疫3ABC感染抗體檢測(cè)試劑盒(生產(chǎn)批號(hào)：20200804129)，均由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所生產(chǎn)；口蹄疫病毒通用型實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)試劑盒(生產(chǎn)批號(hào)：FMDV20200708P)，購(gòu)自哈爾濱元亨生物藥業(yè)有限公司。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物及分組 由廣西水牛研究所種牛場(chǎng)篩選健康狀況良好，90～100日齡，且尚未接種過任何FMD疫苗的奶水牛犢牛24頭。隨機(jī)分為2個(gè)組，一組為試驗(yàn)組(12頭)，接種表位缺失疫苗，另一組為對(duì)照組(12頭)，接種常規(guī)滅活疫苗。標(biāo)記每頭犢牛并記錄耳號(hào)，確保血清與耳號(hào)能一一對(duì)應(yīng)。試驗(yàn)組和對(duì)照組所有犢牛在同一牛舍內(nèi)按照相同方式飼養(yǎng)。

1.4 免疫程序 為避免母源抗體干擾，根據(jù)前期抗體檢測(cè)結(jié)果，所有犢牛在90～100日齡開展首免；首次免疫(首免)后30 d進(jìn)行二次免疫(二免)，二免180 d后進(jìn)行三次免疫(三免)。按照疫苗說明書，首次免疫和加強(qiáng)免疫的接種劑量均為每頭2 mL，頸部肌內(nèi)注射。

1.5 免疫安全性 所有試驗(yàn)動(dòng)物每次免疫后就地觀察2 h，如無異常癥狀出現(xiàn)則由飼養(yǎng)員繼續(xù)觀察，免疫后48 h內(nèi)回訪1次。對(duì)所見或回訪癥狀及時(shí)記錄，除正常反應(yīng)(免疫后精神沉郁、食欲減退；體溫升高1 ℃以內(nèi)，不給藥2 d內(nèi)恢復(fù)正常)外，出現(xiàn)下列癥狀之一者被視為免疫不良反應(yīng)。應(yīng)激反應(yīng)：有較重的臨床癥狀，需要藥物治療才能恢復(fù)正常。過敏反應(yīng)：免疫后短時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)突然倒地、口吐白沫、呼吸急促等嚴(yán)重且劇烈的反應(yīng)，若治療不及時(shí)可能出現(xiàn)死亡，2 d內(nèi)出現(xiàn)死亡的均歸為過敏反應(yīng)死亡。

1.6 日常管理 按牛場(chǎng)飼養(yǎng)程序正常喂養(yǎng)和管理，定期巡查，注意觀察牛只是否出現(xiàn)流涎，口腔、鼻鏡、舌部、乳房、蹄部是否出現(xiàn)水泡、破潰等疑似FMD癥狀，若有則及時(shí)采樣檢測(cè)。

1.7 樣品采集時(shí)間 分別于首免當(dāng)日，首免后30 d，二免后30、60、90、120、150 d和180 d，三免后30 d和60 d，對(duì)試驗(yàn)組和對(duì)照組全體犢牛進(jìn)行采血，分離血清，-20 ℃凍存，統(tǒng)一進(jìn)行抗體檢測(cè)。分別在首免當(dāng)日、二免后120 d和三免后60 d，對(duì)試驗(yàn)組和對(duì)照組全體犢牛進(jìn)行OP采集，-80 ℃凍存，統(tǒng)一進(jìn)行FMD病原學(xué)檢測(cè)。

1.8 血清抗體檢測(cè) 采用口蹄疫O型、A型抗體液相阻斷ELISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)免疫抗體效價(jià)，F(xiàn)MD O型、A型抗體效價(jià)≥1∶128判定為免疫合格。采用口蹄疫3ABC感染抗體檢測(cè)試劑盒檢測(cè)感染抗體，阻斷率(PI)≥50%判定為FMDV NSP 3ABC抗體陽性。

1.9 FMD病原學(xué)檢測(cè) 按試劑盒說明書操作，采用熒光RT-PCR方法檢測(cè)OP中FMDV核酸。

1.10 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS 21軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，抗體效價(jià)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。采用GraphPad Prism 8.3對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行圖像處理和差異性比較，P>0.05表示差異不顯著，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 免疫安全性檢驗(yàn) 臨床觀察結(jié)果顯示，2個(gè)組所有犢牛接種疫苗后均無觀察到任何明顯的不良反應(yīng)，動(dòng)物各項(xiàng)指標(biāo)正常，表明2種疫苗均安全可靠。

2.2 抗體檢測(cè) 免疫抗體檢測(cè)結(jié)果如圖1和表1所示，免疫前2個(gè)組的O型和A型平均抗體均在4.0 log2左右，各組間抗體水平差異不顯著(P>0.05)。首次接種疫苗后，2個(gè)組犢牛免疫抗體水平迅速提高；二免后免疫抗體水平進(jìn)一步提高，并在二免后30 d達(dá)到高峰，試驗(yàn)組和對(duì)照組O型抗體平均滴度分別為9.9 log2、8.5 log2，試驗(yàn)組和對(duì)照組A型抗體平均滴度分別為9.0 log2、6.4 log2，此后逐步緩慢降低，但抗體滴度仍能維持較高水平；三免后抗體滴度再次提升，試驗(yàn)組和對(duì)照組A型抗體滴度均在三免后30 d達(dá)到最高峰，平均值分別為9.8 log2和7.0 log2。從抗體合格率看，對(duì)照組首免后30 d的O型和A型免疫抗體合格率分別為33.3%、25.0%，二免后30 d及三免后30 d時(shí)O型和A型免疫抗體合格率均為75.0%、58.3%；試驗(yàn)組首免后30 d的O型和A型免疫抗體合格率分別為50.0%、58.3%，二免后30 d及三免后30 d的O型和A型免疫抗體合格率均達(dá)到100%。從抗體滴度看，在免疫后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)試驗(yàn)組O型抗體平均滴度均顯著(P<0.05)甚至極顯著(P<0.01)高于對(duì)照組；除在首免后30 d以及二免后120 d，對(duì)照組和試驗(yàn)組A型抗體平均滴度差異不顯著(P>0.05)外，在其他時(shí)間點(diǎn)試驗(yàn)組A型抗體平均滴度均顯著(P<0.05)甚至極顯著(P<0.01)高于對(duì)照組。

表1 各組FMD滅活疫苗免疫合格率

圖1 FMD O型、A型對(duì)照組和試驗(yàn)組各時(shí)段的抗體效價(jià)消長(zhǎng)曲線

2.3 3ABC抗體檢測(cè) 分別檢測(cè)首免后30 d、二免后30 d和三免后30 d血清中3ABC抗體，如表2所示，只有對(duì)照組中1頭牛在三免后30 d檢出3ABC抗體陽性，陽性率為8.3%，其他樣品均為陰性。

表2 各組FMD NSP 3ABC抗體檢測(cè)

2.4 病原學(xué)檢測(cè) 整個(gè)試驗(yàn)期間，未觀察到試驗(yàn)組和對(duì)照組牛出現(xiàn)典型的FMD癥狀。同時(shí)，采用熒光RT-PCR方法對(duì)首次免疫當(dāng)日、二免后120 d和三免后60 d采集的OP進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果均為陰性，表明所有試驗(yàn)牛均未感染FMDV。

3 討論

FMD是我國(guó)重點(diǎn)防控的動(dòng)物疫病，其疫苗研究、生產(chǎn)和運(yùn)用受到高度重視，科學(xué)選擇并合理使用疫苗顯得尤為重要。當(dāng)前國(guó)家要求種畜養(yǎng)殖場(chǎng)開展FMD等疫病凈化，鼓勵(lì)有條件的養(yǎng)殖場(chǎng)和地區(qū)創(chuàng)建無疫養(yǎng)殖小區(qū)和無疫區(qū)，因此研制一種安全、高效，并能有效區(qū)分免疫動(dòng)物和感染動(dòng)物的疫苗對(duì)預(yù)防和控制FMD的流行具有十分重要的意義。

對(duì)于疫苗而言，安全性是首先需要考慮的因素。過去的FMD疫苗在臨床應(yīng)用中免疫副反應(yīng)較多，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致動(dòng)物死亡，使得免疫工作受到很大影響。FMD疫苗副反應(yīng)主要與疫苗中雜蛋白和內(nèi)毒素的含量有關(guān)，疫苗中雜蛋白和內(nèi)毒素的含量越高則越有可能導(dǎo)致注射后局部劇烈腫脹、不易吸收，免疫動(dòng)物體溫持續(xù)升高、食欲減退或停食等副反應(yīng)發(fā)生[4]。近年來，隨著疫苗生產(chǎn)企業(yè)工藝的改進(jìn)，尤其是抗原超濾濃縮技術(shù)的廣泛應(yīng)用[5]，F(xiàn)MD疫苗中雜蛋白和內(nèi)毒素的含量大幅降低，疫苗副反應(yīng)也顯著減少。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，無論是試驗(yàn)組還是對(duì)照組，犢牛在3次接種疫苗中均未出現(xiàn)明顯的不良反應(yīng)，表明2種疫苗的安全性均良好。

免疫抗體檢測(cè)結(jié)果表明，兩組犢牛在接種疫苗后均能產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答，但抗體水平存在差異。在抗體平均滴度方面，試驗(yàn)組在首免后30 d、二免后30 d和三免后30 d時(shí)O型抗體平均滴度分別達(dá)到7.6 log2、9.9 log2、9.8 log2；A型抗體平均滴度分別達(dá)到6.5 log2、9.0 log2、9.8 log2；而對(duì)照組O型抗體平均滴度分別只有5.6 log2、8.5 log2、8.1 log2；A型抗體平均滴度分別只有4.9 log2、6.4 log2、7.0 log2；試驗(yàn)組抗體比對(duì)照組高1.4～2.8個(gè)滴度。統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，在本試驗(yàn)涉及的9個(gè)免疫后時(shí)間點(diǎn)試驗(yàn)組O型抗體平均滴度全部顯著(P<0.05)甚至極顯著(P<0.01)高于對(duì)照組，在7個(gè)免疫后時(shí)間點(diǎn)試驗(yàn)組A型抗體平均滴度顯著(P<0.05)甚至極顯著(P<0.01)高于對(duì)照組。試驗(yàn)組在首免后30 d、二免后30 d和三免后30 d時(shí)O型、A型抗體合格率分別達(dá)到50.0%、58.3%，100%、100%和100%、100%；而對(duì)照組分別僅為33.3%、25.0%，75.0%、58.3%和75.0%、58.3%；試驗(yàn)組抗體合格率比對(duì)照組高25%～41%。從抗體持續(xù)期看，試驗(yàn)組在二免后180 d時(shí)O型、A型抗體平均滴度仍維持在8.8 log2和7.0 log2，抗體合格率仍高達(dá)91.7%和83.3%；而對(duì)照組O型抗體平均滴度在二免后90 d就低于7.0 log2的合格線標(biāo)準(zhǔn)。上述結(jié)果表明，無論從抗體平均滴度、抗體合格率還是抗體持續(xù)期看，試驗(yàn)組均優(yōu)于對(duì)照組。另外，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)首免后30 d時(shí)，盡管試驗(yàn)組抗體水平優(yōu)于對(duì)照組，但2個(gè)組的抗體平均合格率均未達(dá)到70.0%的群體合格標(biāo)準(zhǔn)，表明疫苗尚有改進(jìn)空間，在臨床實(shí)踐中仍有必要進(jìn)行加強(qiáng)免疫以獲得較可靠的免疫保護(hù)效果。

3ABC、2B等是FMDV增殖過程中產(chǎn)生的主要NSPs[6]，接種疫苗可誘導(dǎo)動(dòng)物產(chǎn)生針對(duì)SPs的抗體，F(xiàn)MD感染動(dòng)物會(huì)產(chǎn)生針對(duì)SPs和NSPs的抗體[7]，而FMD疫苗生產(chǎn)過程中上述NSPs被去除，因此疫苗免疫動(dòng)物理論上不會(huì)產(chǎn)生NSPs抗體。近年來，F(xiàn)MD NSPs抗體水平是開展FMD監(jiān)測(cè)凈化工作的關(guān)鍵性指標(biāo)。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)規(guī)定無FMD和免疫無疫國(guó)家和地區(qū)，必須證明動(dòng)物群體沒有NSPs抗體[8-9]。目前，檢測(cè)NSPs抗體也成為國(guó)內(nèi)眾多養(yǎng)殖場(chǎng)戶和動(dòng)物疫控機(jī)構(gòu)開展FMD監(jiān)測(cè)的重要手段。但是近年來發(fā)現(xiàn)由于工藝和成本因素限制，疫苗中始終會(huì)存在痕量NSPs，雖然新型的病毒樣顆粒亞單位疫苗[10]以及基于多表位的重組疫苗[11]均不含NSPs成分，但目前這些新式疫苗仍無法取代滅活疫苗所產(chǎn)生的免疫效果。在這種情況下，種畜、乳畜等飼養(yǎng)周期較長(zhǎng)，疫苗殘留的NSPs在反復(fù)接種后可能在一些牲畜體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生NSPs抗體[12]，從而對(duì)監(jiān)測(cè)凈化工作造成干擾。為了區(qū)分感染動(dòng)物和免疫動(dòng)物，將接種疫苗的動(dòng)物中檢測(cè)到的NSPs抗體稱為假陽性[13]。本試驗(yàn)所用的標(biāo)記疫苗是一種人工缺失NSP 3B優(yōu)勢(shì)表位的基因缺失苗，并有配套血清學(xué)檢測(cè)相適配。該疫苗優(yōu)勢(shì)在于不需要從疫苗抗原中去除NSPs。因此能降低疫苗生產(chǎn)成本，還可以提高疫苗免疫效力，克服傳統(tǒng)疫苗的不足[14]，使用后免疫動(dòng)物不會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，充分滿足區(qū)分免疫動(dòng)物和感染動(dòng)物的需要。從本試驗(yàn)結(jié)果看，常規(guī)疫苗在3次免疫后，8.3%的犢牛出現(xiàn)NSPs抗體。雖然該常規(guī)滅活疫苗達(dá)到了OIE對(duì)疫苗抗原純凈度檢驗(yàn)(1/8以下陽性率)的要求，但仍可能會(huì)對(duì)監(jiān)測(cè)評(píng)估產(chǎn)生不利影響。而口蹄疫O型、A型二價(jià)3B表位缺失滅活疫苗免疫動(dòng)物后3ABC抗體檢測(cè)均為陰性，進(jìn)一步證明該標(biāo)記疫苗配合相應(yīng)鑒別診斷試劑盒，能滿足區(qū)分感染動(dòng)物和免疫動(dòng)物的需要，從而大大簡(jiǎn)化了FMD監(jiān)測(cè)凈化工作。

本試驗(yàn)在奶水牛中對(duì)2種不同F(xiàn)MD滅活疫苗的安全性，以及誘導(dǎo)的免疫抗體和NSPs抗體水平進(jìn)行評(píng)估比較，證明與常規(guī)滅活疫苗相比，本試驗(yàn)使用的口蹄疫O型、A型二價(jià)3B表位缺失滅活疫苗具有相同的安全性和更好的免疫保護(hù)效果，能誘導(dǎo)更高的抗體效價(jià)和更長(zhǎng)的免疫持續(xù)期，并能滿足區(qū)分感染動(dòng)物和免疫動(dòng)物的需要。本試驗(yàn)結(jié)果為進(jìn)一步完善FMD監(jiān)測(cè)和防控提供科學(xué)依據(jù)。