杜仲黃酮對嘔吐毒素誘導(dǎo)的斷奶仔豬生長抑制、氧化應(yīng)激損傷與炎性損傷的干預(yù)效應(yīng)

袁帶秀 譚碧娥 查安東 廖 鵬*

(1.吉首大學(xué)醫(yī)學(xué)院，吉首 416000；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，長沙 410128；3.中國科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，長沙 410125)

嘔吐毒素，又名脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)，是由禾谷鐮刀菌(F.graminearum)產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物[1-5]。這些鐮刀菌在全世界范圍內(nèi)廣泛的分布，主要污染谷物與飼料，如玉米、小麥和大麥[1,6-7]。人和動(dòng)物攝入被DON污染的食物后，會(huì)產(chǎn)生一系列不良的反應(yīng)，如嘔吐、體重減輕、免疫毒性和血液生化指標(biāo)的變化[8-9]。在細(xì)胞水平的研究表明，DON能誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞中絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)的激活，促進(jìn)炎性細(xì)胞因子釋放，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[10-13]。仔豬動(dòng)物試驗(yàn)研究表明，DON首先攻擊腸道，誘導(dǎo)核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)激活，觸發(fā)胞內(nèi)活性氧與許多免疫相關(guān)炎性因子過量釋放，導(dǎo)致腸黏膜充血、水腫，絨毛萎縮與隱窩細(xì)胞壞死或凋亡，抑制緊密連接蛋白的合成，引起腸道通透性增加，最終導(dǎo)致仔豬生長性能降低與血液生理生化指標(biāo)變化，甚至死亡[14-16]。

目前，通過外源添加酵母細(xì)胞壁、寡糖、益生菌、功能性氨基酸、中藥提取物等均可以在一定程度上緩解DON導(dǎo)致的仔豬生長抑制與生理生化指標(biāo)紊亂[12,16-20]。杜仲是湖南湘西地區(qū)重要的植物資源，含有大量抗氧化活性物質(zhì)，其中黃酮類化合物是其主要的抗氧化成分。研究表明，杜仲黃酮(Eucommiaulmoidesflavones,EUF)能通過調(diào)節(jié)白細(xì)胞介素-2(IL-2)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等細(xì)胞因子的分泌，增強(qiáng)荷瘤小鼠免疫功能，提高機(jī)體抗氧化能力[21]。在敵草快誘導(dǎo)的仔豬氧化應(yīng)激模型中，EUF能顯著提高仔豬生長性能，降低腸道氧化應(yīng)激損傷與炎癥反應(yīng)[22]。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，我們推測EUF能緩解DON導(dǎo)致的仔豬生長性能抑制和生理生化指標(biāo)紊亂。為驗(yàn)證此推測，本試驗(yàn)就EUF對DON誘導(dǎo)的斷奶仔豬生長性能、臟器指數(shù)、血液抗氧化功能與腸道免疫炎性因子釋放的干預(yù)效應(yīng)進(jìn)行研究，以期為指導(dǎo)仔豬健康生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

F.graminearumR6576菌株由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)廖玉才教授研究組提供。杜仲黃酮由吉首大學(xué)醫(yī)學(xué)院提取制備，以蘆丁為校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)，采用紫外分光光度法測定了EUF粉中總黃酮的含量，其含量為83.61%[22]。AgraQuant DON酶聯(lián)免疫吸附檢測(ELISA)試劑盒購自ROMER公司。

1.2 霉變玉米準(zhǔn)備與處理

將保存于PDA斜面中的F.graminearumR6576菌株接種于PDA平板上，25～28 ℃黑暗條件下活化培養(yǎng)5 d，再將菌絲接種于CMC液體培養(yǎng)基中，用接種針將菌絲打碎，持續(xù)光照誘導(dǎo)條件下置于搖床上振蕩培養(yǎng)(28 ℃，200 r/min)5 d，產(chǎn)生分生孢子后，用無菌雙層紗布過濾，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，將分生孢子的濃度調(diào)為5×105個(gè)/mL左右接種于玉米粉中，進(jìn)行14 d的發(fā)酵培養(yǎng)[12]。將霉變玉米與基礎(chǔ)飼糧按照1∶1比例均勻混合。整個(gè)試驗(yàn)周期60 d，共處理飼糧4次，每次每組取樣3份進(jìn)行DON濃度的測定。DON濃度測定方法參考AgraQuant DON酶聯(lián)免疫檢測試劑盒檢測說明書進(jìn)行檢測。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物與飼養(yǎng)管理

選擇初始體重(6.50±0.28) kg的健康三元雜交(杜×長×大)斷奶仔豬24頭，隨機(jī)分為3組，每組8頭，每頭為1個(gè)重復(fù)。3個(gè)組分別為對照組(Control組，基礎(chǔ)飼糧)、DON組(飼糧中含1.5 mg/kg DON)、DON+EUF組(飼糧中含1.5 mg/kg DON和100 mg/kg EUF)。DON和EUF的劑量參考文獻(xiàn)[22-23]。試驗(yàn)仔豬全部單欄飼養(yǎng)，自由采食與飲水，預(yù)試期7 d，正試期21 d。試驗(yàn)期間每天準(zhǔn)確記錄每頭豬的實(shí)際采食量，觀察豬群整體健康狀況?；A(chǔ)飼糧參考NRC(2012)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行配制，其組成及營養(yǎng)水平見表1。

1.4 樣本采集

在試驗(yàn)第21天晨飼前每組隨機(jī)選取6頭仔豬進(jìn)行前腔靜脈采血。使用醫(yī)用真空促凝一次性采血管采集血液10 mL，室溫靜置2 h后以3 000 r/min離心10 min制備血清，分裝于1.5 mL滅菌離心管中，用于后續(xù)血清生化指標(biāo)、細(xì)胞因子含量和抗氧化指標(biāo)的檢測。采血后電擊致死，剖開腹腔，分離心臟、肝臟、脾臟和腎臟等主要臟器，剝離器官表面黏附的脂肪，用0.9%生理鹽水洗凈器官表面血漬并用濾紙吸干表面水分，最后用電子分析天平進(jìn)行準(zhǔn)確稱量。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

續(xù)表1項(xiàng)目 Items含量 Content營養(yǎng)水平 Nutrient levels2)消化能 DE/(MJ/kg)14.60粗蛋白質(zhì) CP20.27鈣 Ca 0.69總磷 TP0.57

1.5 指標(biāo)測定及方法

1.5.1 生長性能與臟器指數(shù)

在試驗(yàn)第1天和第21天對所有試驗(yàn)斷奶仔豬進(jìn)行空腹稱重，記錄為初始體重和終末體重，并計(jì)算得出平均日增重(ADG)。記錄21 d全程試驗(yàn)期間的采食量，計(jì)算平均日采食量(ADFI)。根據(jù)ADG和ADFI計(jì)算料重比(F/G)。各臟器相對指數(shù)按照如下公式計(jì)算：

臟器相對指數(shù)(%)=(臟器絕對重量/體重)×100。

1.5.2 血清生化指標(biāo)測定

用Beckman公司的CX4型全自動(dòng)血液生化分析儀進(jìn)行血清白蛋白(ALB)含量與堿性磷酸酶(ALP)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)活性測定。

1.5.3 血清抗氧化指標(biāo)測定

血清超氧化物歧化酶(SOD)活性采用黃嘌呤氧化酶法測定，丙二醛(MDA)含量采用比色法測定，谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性采用化學(xué)比色法測定，總抗氧化能力(T-AOC)采用鐵還原/抗氧化反應(yīng)法測定，活性氧(ROS)含量采用化學(xué)熒光法測定。所有試劑盒均購自于南京建成生物工程研究所，具體測定方法均按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.5.4 血清細(xì)胞因子含量測定

采用ELISA法測定血清白細(xì)胞介素-6(IL-6)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)含量。所有試劑盒均購自于南京建成生物工程研究所，具體測定方法均按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

先用Excel 2013對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行初步處理，再采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)和Duncan氏法多重比較。結(jié)果以平均值和均值標(biāo)準(zhǔn)誤(SEM)表示，P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 添加EUF對飼喂DON污染飼糧斷奶仔豬生長性能和臟器相對指數(shù)的影響

由表2可知，與Control組相比，DON組的終末體重、ADG和ADFI顯著降低(P<0.05)，F(xiàn)/G顯著增加(P<0.05)，DON+EUF組的終末體重、ADG、ADFI和F/G與對照組均無顯著差異(P>0.05)。

表2 添加EUF對飼喂DON污染飼糧斷奶仔豬生長性能的影響

由圖1可知，與Control組相比，DON組的肝臟和脾臟相對指數(shù)顯著升高(P<0.05)，其余臟器相對指數(shù)無顯著變化(P>0.05)。DON+EUF組的肝臟相對指數(shù)雖較DON組顯著降低(P<0.05)，但仍顯著高于Control組(P<0.05)。

數(shù)據(jù)柱形標(biāo)注不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，無字母標(biāo)注表示差異不顯著。Value columns with different small letters mean significant difference (P<0.05), while with no letter mean no significant difference (P>0.05).

2.2 添加EUF對飼喂DON污染飼糧斷奶仔豬血清生化指標(biāo)的影響

由表3可知，與Control組相比，DON組的血清ALP、ALT和AST活性顯著提高(P<0.05)；DON+EUF組的血清AST活性顯著提高(P<0.05)，血清ALP和ALT活性無顯著變化(P<0.05)。此外，DON+EUF組的血清ALP活性顯著低于DON組(P<0.05)。

表3 添加EUF對飼喂DON污染飼糧斷奶仔豬血清生化指標(biāo)的影響

2.3 添加EUF對飼喂DON污染飼糧斷奶仔豬血清抗氧化指標(biāo)的影響

由表4可知，與Control組相比，DON組血清SOD、GSH-Px活性和T-AOC顯著降低(P<0.05)，而血清MDA和ROS含量顯著提高(P<0.05)；與DON組相比，DON+EUF組血清SOD、GSH-Px活性和T-AOC顯著提高(P<0.05)，血清MDA和ROS含量顯著降低(P<0.05)。

2.4 添加EUF對飼喂DON污染飼糧斷奶仔豬血清細(xì)胞因子分泌的影響

由表5可知，與Control組相比，DON組血清中IL-6、IL-1β和TNF-α含量顯著提高(P<0.05)；與DON組相比，DON+EUF組血清中IL-6、IL-1β和TNF-α含量顯著降低(P<0.05)。

表4 添加EUF對飼喂DON污染飼糧斷奶仔豬血清抗氧化指標(biāo)的影響

表5 添加EUF對飼喂DON污染飼糧斷奶仔豬血清細(xì)胞因子含量的影響

3 討 論

3.1 EUF對飼喂DON污染飼糧斷奶仔豬生長性能和臟器相對指數(shù)的影響

傳統(tǒng)中藥在替抗與緩解DON導(dǎo)致的生長抑制方面扮演著重要的角色[15-16,22]。EUF是從杜仲中提取的黃酮類化合物，在替抗和促進(jìn)動(dòng)物生長中表現(xiàn)出一定的優(yōu)勢。研究表明，0.01%EUF作為抗生素生長促進(jìn)劑的潛在替代品，可以改善斷奶仔豬的生長性能和腸道形態(tài)，減少大腸菌群的定植和腹瀉指數(shù)[24]；同時(shí)，100 mg/kg EUF能顯著提高敵草快誘導(dǎo)的仔豬生長性能降低[22]。鐮刀菌毒素污染飼糧會(huì)導(dǎo)致斷奶仔豬肝臟和脾臟的損傷[25]。同時(shí)，跟EUF類似的黃酮類中藥黃芩苷、黃芩苷鋅絡(luò)合物和黃芩苷銅絡(luò)合物在緩解DON導(dǎo)致的生長抑制和臟器損傷方面也表現(xiàn)出一定的積極作用[26-29]。本研究中DON造成斷奶仔豬終末體重、ADG和ADFI顯著降低，且肝臟和脾臟相對指數(shù)顯著提高，而添加EUF能夠在一定程度上緩解DON誘導(dǎo)的斷奶仔豬生長性能的降低與臟器相對指數(shù)的升高。盡管本研究表明EUF在緩解DON誘導(dǎo)的仔豬生長性能降低方面具有一定的效果，但是由于本試驗(yàn)的樣本量還是太小，在未來的研究中應(yīng)該進(jìn)行大規(guī)模飼養(yǎng)試驗(yàn)，以驗(yàn)證EUF作為斷奶仔豬生長促進(jìn)劑的潛力。

3.2 EUF對飼喂DON污染飼糧斷奶仔豬血清生化指標(biāo)的影響

血液生理生化指標(biāo)與代謝、營養(yǎng)及健康狀況有著密切的聯(lián)系，是反映動(dòng)物機(jī)體生理機(jī)能的重要指標(biāo)，也是臨床醫(yī)療和科學(xué)研究的重要依據(jù)。機(jī)體血清ALP、AST和ALT活性在一定程度上可以反映肝臟功能情況。有研究表明，DON能夠增加仔豬血清ALP的活性，從而加重DON誘導(dǎo)的全身毒性，導(dǎo)致肝臟代謝產(chǎn)物的異常排泄[30]。據(jù)報(bào)道，血清AST和ALT活性是肝臟損傷的敏感指標(biāo)，其活性增加臨床上反映了受損肝細(xì)胞的滲漏[11]。研究表明，飼糧中添加0.01%EUF能夠顯著改善抗生素導(dǎo)致的斷奶仔豬血清ALP、ALT和AST活性變化，促進(jìn)仔豬健康生長[24]。與前人的研究結(jié)果一致，本研究中DON能導(dǎo)致肝臟功能變化，使肝細(xì)胞向血液中釋放更多的ALP、ALT和AST，而DON+EUF組血清ALP和AST活性顯著低于DON組，表明飼糧添加EUF能夠改善DON導(dǎo)致的肝臟功能變化，減少肝細(xì)胞分泌ALP和AST，有利于緩解斷奶仔豬肝臟功能。與Control組相比，DON組的血清AST和ALT活性顯著升高，表明這種損傷機(jī)制是在攝入DON后觸發(fā)的，其結(jié)果與肝臟相對指數(shù)的變化是一致的。

3.3 EUF對飼喂DON污染飼糧斷奶仔豬血清抗氧化指標(biāo)的影響

黃酮類化合物的抗氧化機(jī)制是通過抑制氧化酶活性、上調(diào)或下調(diào)抗氧化保護(hù)屏障以及清除細(xì)胞內(nèi)的ROS來實(shí)現(xiàn)的[22,26]。DON可以刺激細(xì)胞或動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生ROS，并抑制抗氧化酶(如SOD和GSH-Px)的活性[11-12,17]。在正常情況下，抗氧化酶在體內(nèi)處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)[26]。有許多類型的抗氧化酶，包括SOD、GSH-Px和CAT，通過這些酶，SOD將超氧自由基轉(zhuǎn)化為過氧化氫(H2O2)，H2O2通過GSH-Px和CAT轉(zhuǎn)化為水[27]。氧化應(yīng)激源于抗氧化酶不能清除自由基，導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)自由基失去平衡。黃酮類化合物抗氧化能力的機(jī)制包括通過抑制參與其產(chǎn)生的酶、清除ROS、上調(diào)或保護(hù)抗氧化防御來抑制ROS的形成[22]。DON可刺激細(xì)胞產(chǎn)生ROS，抑制SOD和GSH-Px等抗氧化酶的活性[6,15-17,26]。研究表明，外源性添加EUF、白藜蘆醇、表沒食子兒茶素沒食子酸酯等多種抗氧化中藥成分，重建機(jī)體組織的氧化還原平衡，是緩解DON所致腸道氧化應(yīng)激損傷的有效途徑之一[22,26,28-29]。與前人的研究結(jié)果一致，本研究中DON能顯著降低仔豬血清SOD和GSH-Px活性，而DON+EUF組顯著降低了仔豬血清MDA和ROS含量，表明外源添加EUF能通過增加血液中抗氧化酶活性來中和DON導(dǎo)致的ROS失衡，從而顯著降低DON誘導(dǎo)的機(jī)體氧化應(yīng)激，促進(jìn)仔豬體內(nèi)氧化還原平衡。

3.4 EUF對飼喂DON污染飼糧斷奶仔豬血清細(xì)胞因子含量的影響

炎性因子分泌水平的高低是反映機(jī)體炎癥損傷程度的生理指標(biāo)之一[25-26]。氧化應(yīng)激和炎癥之間的關(guān)系已經(jīng)被以前許多的研究所證明[8,14-15,17,22,29-30]。研究表明，DON能誘導(dǎo)NF-κB的激活，觸發(fā)炎癥反應(yīng)，選擇性的誘導(dǎo)一系列細(xì)胞因子、趨化因子以及其他免疫相關(guān)炎性因子mRNA的上調(diào)[11-12,16-17,26]。NF-κB信號(hào)通路在機(jī)體抗氧化應(yīng)激和抗炎中起著重要作用，相關(guān)研究也證實(shí)了兩者之間的相關(guān)性[30-35]。同時(shí)也有研究表明，外源添加EUF、精氨酸、黃芩苷、鹽酸小檗堿等能緩解DON導(dǎo)致的炎性因子分泌增加，包含顯著降低小腸和血清中白細(xì)胞介素-8(IL-8)、IL-1β、IL-6和IFN-γ的蛋白質(zhì)和基因表達(dá)水平，最終提高動(dòng)物腸道或機(jī)體的健康水平[12,16,22,26,29]。有研究表明，腸道和血清中過量的抗氧化酶可能與相應(yīng)部位的促炎和抗炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生有關(guān)[18,22]。有證據(jù)表明，自由基可能作為二級(jí)信使刺激促炎細(xì)胞因子分泌[17]。當(dāng)然，不同的動(dòng)物模型、不同的中藥提取物和不同的喂養(yǎng)時(shí)間導(dǎo)致細(xì)胞因子的基因和蛋白質(zhì)表達(dá)水平不一致[15]。與前人的研究結(jié)果一致，本研究中DON組仔豬血清中IL-6、IL-1β和TNF-α含量較Control組顯著提高，而DON+EUF組血清中IL-6、IL-1β和TNF-α含量則較DON組顯著降低，表明外源添加EUF能顯著降低了DON誘導(dǎo)的炎性因子分泌，減輕了仔豬機(jī)體炎性損傷。

4 結(jié) 論

飼糧中添加1.5 mg/kg DON能導(dǎo)致斷奶仔豬生長抑制，肝臟和脾臟病變，出現(xiàn)氧化應(yīng)激和炎性損傷，而添加EUF能緩解DON誘導(dǎo)的斷奶仔豬的生長抑制與肝臟、脾臟增生以及抗氧化能和抗炎能力的降低，對緩解DON誘導(dǎo)的毒害作用具有一定的效果。