同時檢測H5和N8亞型AIV雙重納米PCR方法的建立和應(yīng)用

李 丹，李 孟，謝芝勛，羅思思，張民秀，謝麗基，黃嬌玲，華 俊，粟永春，阮志華

（1.廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所/廣西獸醫(yī)生物技術(shù)重點實驗室，廣西 南寧 530001；2.廣西金陵農(nóng)牧集團有限公司，廣西 南寧 530049）

禽流感（Avian influenza，AI）是一種由禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）引起的禽類傳染性病毒?。?］。AIV具有亞型多、傳染性強和分布廣且具有一定的宿主特異性且變異快的特點［2-5］。依據(jù)AIV對雞致病力的不同，AIV可分為高致病性禽流感病毒（HPAIV）和低致病性禽流感病毒（LPAIV），HPAIV引起的禽類感染死亡率極高，給養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失［6-8］。能引起HPAI發(fā)生的主要是H5和H7亞型AIV，其中影響最大的是H5亞型HPAIV。目前，H5亞型AIV已在60多個國家的家禽和野鳥中被檢測出，包括H5N1、H5N2、H5N3、H5N5、H5N6和H5N8等組合，而且該亞型組合的病毒還在不斷地進化和變異［9-10］。近年來，H5N8亞型AIV作為其中一個重要亞型組合，逐漸引起了人們的關(guān)注。1983年H5N8疫情首次在冰島發(fā)生過流行，中國于2010年首次在家禽中檢測出H5N8亞型AIV［11］。2014年初在韓國和日本的家禽中發(fā)現(xiàn)該亞型AIV，并傳播至歐洲和北美洲［12-13］。2020年以來，世界動物衛(wèi)生組織（OIE）通報發(fā)現(xiàn)，沙特阿拉伯和匈牙利等國家的家禽中再次暴發(fā)了H5N8亞型AI，并蔓延至其他國家［14-15］。2020年12月，國際上首次報告俄羅斯養(yǎng)殖場工作人員感染H5N8亞型AIV的病例［16］。H5N8禽流感病毒在亞歐大陸和非洲大流行，已成為影響全球家禽養(yǎng)殖、野生動物安全的一個重要因素。同時，新發(fā)生的H5N8禽流感病毒可造成人感染，已成為值得關(guān)注的公共衛(wèi)生問題，須引起高度重視。因此，建立能迅速、有效地鑒別H5和N8亞型禽流感病毒的檢測方法，對禽流感的防控及保障人類公共衛(wèi)生安全具有十分重要的意義。

目前，病毒分離鑒定是診斷AIV感染的“黃金標準”，由于AIV亞型眾多且新的變異株不斷出現(xiàn)，采用傳統(tǒng)方法對其進行分型和診斷，不僅存在著操作方法復雜，而且檢測周期長、容易受抗體等因素影響，使得檢測結(jié)果不能準確和及時地判斷［17-18］。AIV分子生物學檢測技術(shù)主要包括RT-PCR和熒光定量PCR等方法，納米PCR技術(shù)是近年來新興起的一種將納米技術(shù)與分子生物學技術(shù)相結(jié)合的核酸檢測技術(shù)，該技術(shù)在改善PCR反應(yīng)特異性和敏感性等諸多方面具有一定的優(yōu)勢，可以有效地提高PCR檢測結(jié)果的準確性和可靠性［19-21］。隨著科學技術(shù)日新月異地發(fā)展，人們不斷地改良和優(yōu)化納米PCR檢測方法并擴展至其他應(yīng)用領(lǐng)域。目前，納米PCR技術(shù)在動物疫病檢測領(lǐng)域已經(jīng)有一些報道［22-25］，而雙重納米PCR（nano-dPCR）技術(shù)的反應(yīng)體系能同時擴增H5和N8基因并用于檢測和鑒別H5N8亞型AIV的核酸檢測技術(shù)尚未見相關(guān)報道。本研究旨在建立一種同時檢測H5和N8亞型AIV的雙重納米PCR方法，以期為監(jiān)測H5亞型和N8亞型AIV的流行情況及其鑒別診斷提供新的技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑和儀器 納米PCR試劑盒（NPK02）購自上海滬崢生物科技有限公司；DNA/RNA共提試劑盒、小量質(zhì)粒提取試劑盒、凝膠回收試劑盒、感受態(tài)細胞、PCR產(chǎn)物快速連接載體和DNA Marker均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；購自寶生物（北京）有限公司的試劑有M-MLV、隨機引物、dNTP、RNA抑制劑。其他試劑均購自商業(yè)公司。PCR儀購自美國Bio-Rad Laboratories公司，超微量分光光度計購自美國Thermo公司，實驗所用SPF雞胚購自北京勃林格殷格翰維通生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 毒株 毒株（H1N2、H3N2、H4N2、H6N8、H6N1、H9N2、NDV、IBV、ARV、ILTV和ChPV）均由廣西獸醫(yī)生物技術(shù)重點實驗室保存；H7N2、H13N6、H14N5、H16N3和H15N9亞 型AIV的cDNA模板由美國賓夕法尼亞州立大學惠贈；H5N1和H5N2亞型AIV的cDNA模板由美國康涅狄格州立大學惠贈；其他AIV（H2N3、H8N4、H10N3、H12N5和H11N3）毒株或cDNA模板均由香港大學惠贈。

1.2 方法

1.2.1 引物的設(shè)計與合成 運用DNAStar軟件，將GenBank中下載的N8亞型AIVNA和H5亞 型AIVHA基因的核苷酸序列進行比對，分別對2種目的基因進行特異性保守區(qū)域的篩選，采用Primer 6.0和Oligo 6.0軟件設(shè)計特異性引物，并通過NCBI BLAST在線驗證其特異性，篩選出分別針對2種目的基因的2對特異性引物。設(shè)計出的引物序列見表1。上述引物均由華大基因廣州分公司合成。

表1 H5和N8亞型AIV HA和NA基因的引物序列

1.2.2 病毒RNA/DNA的提取與RNA的反轉(zhuǎn)錄 參照試劑盒使用說明書，運用DNA/RNA抽提試劑盒對實驗中所用到的AIV、NDV、IBV、ARV和ILTV的DNA/RNA進行抽提，并用DEPC水溶解抽提后的DNA/RNA。參照反轉(zhuǎn)錄酶說明書，對RNA病毒的抽提產(chǎn)物進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，所有DNA和cDNA產(chǎn)物均置于-30 ℃冰箱中保存。

1.2.3 雙重納米PCR反應(yīng)體系及其條件的優(yōu)化 nanodPCR方法的PCR反應(yīng)體系為25 μL：2×Nano-QPCR buffer 12.5 μL，Taq DNA polymerase（5 U/μL）0.5 μL，作為模板N8亞型AIV和H5亞型AIV的cDNA各加入1 μL；再分10個梯度各加入0.1～1.0μL對引物H5-F、H5-R、N8-F和N8-R（25 pmol/μL）進行引物濃度的優(yōu)化；最后，用超純水將反應(yīng)總體積補足至25 μL。為最終確定最佳的反應(yīng)體系及條件，根據(jù)實驗結(jié)果對退火溫度和時間進行優(yōu)化。

1.2.4 特異性實驗 為驗證所建立的nano-dPCR檢測方法的特異性，按照優(yōu)化后的條件，用該法對H1N2、H2N3、H3N2、H4N2、H5N1、H5N2、H6N8、H6N1、H7N2、H8N4、H9N2、H10N3、H11N3、H12N5、H13N6、H14N5、H15N9、H16N3、NDV、IBV、ILTV和ARV進行特異性擴增，檢驗其特異性。對擴增出的目的片段進行純化和回收，PCR產(chǎn)物快速連接至載體上，并轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細胞中進行克隆，挑選陽性單克隆菌送賽默飛廣州分公司進行測序和驗證。

1.2.5 標準品的制備 分別以N8亞型AIV與H5亞型AIV的cDNA為模板，用特定的引物對N8亞型AIVNA和H5亞型AIVHA基因的全長片段進行PCR擴增，得到其N8亞型AIVNA和H5亞型AIVHA基因的全長目的片段，再分別將2個基因片段連接到PCR產(chǎn)物快速連接載體中，并轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細胞中進行克隆，挑選陽性單克隆菌送華大基因廣州分公司進行測序驗證。將含有N8亞型AIVNA和H5亞型AIVHA基因片段的2種重組質(zhì)粒分別命名為N8-T和H5-T。分別提取N8-T和H5-T的質(zhì)粒，并用微量核酸檢測儀對其進行核酸濃度的測定，根據(jù)分子質(zhì)量和核酸濃度計算對應(yīng)的拷貝數(shù)，將N8-T和H5-T等拷貝數(shù)混合，并稀釋10倍，以得到N8-T和H5-T質(zhì)粒DNA濃度均為5× 100～5×109拷貝/μL的標準品。

1.2.6 敏感性實驗 為檢測該方法的敏感性，運用所建立的H5和N8亞型禽流感病毒雙重普通PCR（dPCR）和nano-dPCR的檢測方法，同時對N8-T和H5-T質(zhì)粒濃度為5×100～5×109拷貝/μL的樣品進行特異性擴增，并比較這2種方法的敏感性。

1.2.7 臨床樣品檢測 對活禽市場采集的130份家禽咽喉及泄殖腔拭子樣品運用建立的nano-dPCR檢測方法進行檢測和鑒定，同時將樣品處理后接種SPF雞胚進行病毒分離鑒定，將病毒分離鑒定結(jié)果與nano-dPCR檢測結(jié)果進行比較；然后將陽性樣品進行HA和NA基因全長擴增，并將HA和NA基因全長克隆送測序公司進行測序和分析，以驗證nano-dPCR檢測結(jié)果的準確性和可靠性。

2 結(jié)果與分析

2.1 雙重納米PCR方法的建立

通過nano-dPCR方法分別對H5亞型AIV和N8亞型AIV的目的基因進行擴增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，可分別獲得207和428 bp的特異性目的片段（圖1），與預期片段大小相符。

圖1 H5和N8亞型AIV目的基因nano-dPCR擴增圖譜

2.2 H5亞型和N8亞型AIV nano-dPCR檢測方法的最佳退火溫度和最佳反應(yīng)條件的確定

H5亞型和N8亞型AIV nano-dPCR經(jīng)退火溫度（46～53 ℃）優(yōu)化，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖2。由圖2可知，49～50 ℃下nano-dPCR擴增效果均表現(xiàn)為良好，最終選擇50 ℃為nano-dPCR檢測方法的最佳退火溫度。nano-dPCR方法的PCR最佳反應(yīng)體系為25 μL：2×Nano-QPCR buffer 12.5 μL，Taq DNA polymerase（5 U/μL）0.5 μL，作為模板N8亞型AIV和H5亞 型AIV cDNA各 加 入1 μL，引 物H5-F和H5-R（25 pmol/μL）0.8 μL、引物N8-F和N8-R（25 pmol/μL）1.2 μL，加ddH2O補足25 μL。最終優(yōu)化的反應(yīng)條件為：94 ℃、3 min；進入94 ℃、20 s，50 ℃、30 s，72 ℃、30 s，共30個循環(huán)；然后，再72 ℃延伸5 min，最后，4 ℃結(jié)束反應(yīng)。

圖2 nano-dPCR退火溫度優(yōu)化結(jié)果

2.3 特異性實驗

在H5、N8亞型AIV擴增結(jié)果中出現(xiàn)2條特異性條帶，分別為207和428 bp；在H5N2亞型AIV即H5Ny（y≠8）亞型AIV擴增結(jié)果中僅出現(xiàn)1條特異性條帶，片段大小為207 bp；在H6N8亞型AIV即HxN8（x≠5）亞型AIV擴增中僅出1條特異性條帶，片段大小為428 bp。對其他亞型AIV以及常見的禽病病原體的擴增中均未出現(xiàn)條帶（圖3），由此表明nano-dPCR檢測方法的特異性良好。

圖3 特異性擴增實驗結(jié)果

2.4 敏感性實驗

以初始濃度均為5×109拷貝/μL的H5-T和N8-T，經(jīng)過ddH2O 10倍系列的稀釋，取每個稀釋度的重組質(zhì)粒模板進行nano-dPCR和dPCR檢測。敏感性實驗結(jié)果表明：nano-dPCR可檢測H5亞型AIVHA和N8亞型AIVNA基因的最低拷貝數(shù)均為5×102拷貝/μL；而使用dPCR方法檢測的最低拷貝數(shù)均為5×104拷貝/μL（圖4）。nano-dPCR檢測方法的敏感性比dPCR檢測方法高100倍。

圖4 H5和N8亞型AIV nano-dPCR和dPCR敏感性實驗結(jié)果

2.5 臨床樣品檢測

運用該方法對廣西獸醫(yī)生物技術(shù)重點實驗室從南寧活禽市場采集的130份雞口腔及泄殖腔棉拭子品進行檢測。樣品nano-dPCR檢測的結(jié)果顯示：6份樣品能擴增出478 bp的目的條帶，為H5NxAIV，陽性率為2.31%；15份樣品能擴增出428 bp的目的條帶，為HyN8 AIV，陽性率為11.54%；所有樣品同時接種SPF雞胚進行病毒分離，病毒分離結(jié)果與nano-dPCR方法檢測結(jié)果完全一致。nanodPCR獲得的產(chǎn)物測序結(jié)果顯示，nano-dPCR獲得的207、428 bp特異片段分別與H5亞型AIVHA、N8亞型AIVNA基因序列的符合率均為100%。

3 討論

近年來，由于不同組合H5亞型AIV感染引發(fā)的高致病性禽流感疫情持續(xù)出現(xiàn)，已經(jīng)威脅家禽養(yǎng)殖業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展，并引發(fā)嚴重的公共衛(wèi)生危機［26-27］。另外，某些N8亞型AIV（例如H10N8、H3N8和H5N8等）還能直接感染人類，對人類公共衛(wèi)生安全構(gòu)成了嚴重的威脅［28-29］。由于不同亞型禽流感病毒感染家禽后的臨床癥狀、剖檢病變極其相似，肉眼和常規(guī)的方法難以對其進行快速、準確的鑒別診斷。普通PCR在臨床檢測上比較常用，雖然實時熒光定量PCR檢測的敏感性比普通PCR高，但需要昂貴的精密儀器且操作程序復雜。納米技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用到生命科學的各個領(lǐng)域，隨著對納米材料在PCR反應(yīng)過程中作用機制的深入研究，更多研究團隊開發(fā)了檢測不同動物疫病的納米PCR技術(shù)［30］。目前，納米PCR已成功應(yīng)用于感染豬、牛、雞、犬和貓等多種動物病原的臨床檢測中［31-32］，上述研究所建立的納米PCR檢測方法靈敏度均比普通PCR檢測方法的高，且特異性更好。

前期納米PCR的研究多集中在對單一病原檢測方法的研究。近年來，多重納米PCR逐漸成為研究熱點。在多重PCR反應(yīng)體系中，引物的設(shè)計至關(guān)重要，它是決定多重PCR反應(yīng)成功與否的關(guān)鍵。本研究在引物設(shè)計時，充分平衡各種影響多重PCR的因素，同時將擴增H5亞型AIVHA和N8亞型AIVNA基因的引物，進行多個引物組合的比對和篩選優(yōu)化，并依據(jù)長期的實踐經(jīng)驗，選擇最佳的引物對組合進行nano-dPCR擴增，為nano-dPCR方法的成功建立奠定了基礎(chǔ)。退火溫度優(yōu)化實驗的結(jié)果表明：nano-dPCR產(chǎn)物在49～50 ℃的低退火溫度條件下均能得到很好的擴增，在增加PCR產(chǎn)物量的同時，避免了引物間的非特異性擴增。本實驗對所獲得的特異性PCR產(chǎn)物進行了測序和比對分析，結(jié)果表明：nano-dPCR擴增獲得了預期片段大小一致的特異條帶，且測序結(jié)果與所設(shè)計基因片段高度一致。敏感性實驗對比的結(jié)果表明，nano-dPCR的最低核酸檢測量比普通dPCR最低核酸檢測量高100倍，與其他研究者的結(jié)果基本一致［33］，表明本研究建立的nano-dPCR反應(yīng)具有良好的敏感性。

應(yīng)用本實驗所建立的nano-dPCR對臨床樣品進行檢測，N8亞型AIV的感染率為11.54%，H5亞型AIV感染率為2.31%。由檢測結(jié)果可知，N8亞型AIV在雞群中存在普遍感染，N8亞型AIV的陽性率遠高于H5亞型AIV的陽性率。此外，在本次檢測中未出現(xiàn)了H5亞型AIV和N8亞型AIV的混合感染現(xiàn)象，這提示在禽流感防控的過程中，應(yīng)該對H5亞型AIV和N8亞型AIV給予關(guān)注。

4 結(jié)論

本研究成功地建立了能同時檢測H5亞型和N8亞型的雙重納米PCR檢測方法，該方法具有比普通PCR方法靈敏性更高，又比實時熒光定量PCR方法更簡便的特點，更有利于在基層推廣應(yīng)用，為H5亞型和N8亞型AIV的臨床檢測及防控提供了新的技術(shù)支撐。