基于正交設(shè)計(jì)探究光照、溫度、濕度對(duì)烤煙成熟生理的影響

趙 喆，米 強(qiáng)，盧紹浩，張嘉雯，來(lái) 苗，王 坤，趙銘欽

（1.山東中煙工業(yè)有限責(zé)任公司 濟(jì)南卷煙廠(chǎng)，山東 濟(jì)南 250104；2.浙江中煙工業(yè)有限責(zé)任公司 技術(shù)中心，浙江 杭州 310024；3.上海煙草集團(tuán)有限責(zé)任公司 技術(shù)中心，上海 201315；4.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 煙草學(xué)院，河南 鄭州 450002）

0 引言

隨著全球氣候變暖現(xiàn)象的加劇，不利氣象因素對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的影響日益增大［1］，光照、溫度、濕度作為主要的生態(tài)因子，影響著植物生長(zhǎng)發(fā)育、成熟衰老的過(guò)程。植物光合作用隨光照強(qiáng)度的變化而瞬時(shí)變化［2］，當(dāng)光照強(qiáng)度超過(guò)一定范圍后，光合效率保持在最大值，過(guò)剩的光照強(qiáng)度易對(duì)細(xì)胞造成光損傷［3］。與正常葉片相比，高光照強(qiáng)度下鼠尾草葉片表現(xiàn)出更強(qiáng)的光保護(hù)需求，且其PSⅡ受損，葉片衰老加劇［4］。在連續(xù)光照情況下，隨著光照強(qiáng)度的增加，生菜葉片內(nèi)活性氧（ROS）的產(chǎn)生及脂質(zhì)過(guò)氧化程度也逐漸增加［5］。

同時(shí)，溫度作為最重要的環(huán)境因子之一，可通過(guò)調(diào)控凈同化速率［6］和光合作用［7］影響植株生長(zhǎng)。高溫下植物體內(nèi)葉綠素降解加快，活性氧增多，細(xì)胞易受損傷［8-9］，據(jù)前人研究，溫度大于35 ℃時(shí)超氧化物歧化酶（SOD）活性會(huì)降低［10］；35～40 ℃時(shí)，凈光合速率也會(huì)下降［11］。熱處理提高了大豆體內(nèi)乙烯含量，降低了光合作用速率和蔗糖含量，抑制了關(guān)鍵酶的促抗氧化劑活性，會(huì)導(dǎo)致葉片早衰［12］。同樣，空氣相對(duì)濕度也會(huì)影響植株光合作用及生理特性［13-14］。

目前，有關(guān)光照、溫度對(duì)植物成熟衰老影響的研究較多，但涉及濕度影響的研究較少。因此，本文通過(guò)選取大田植物生長(zhǎng)環(huán)境中最重要的3個(gè)氣象因素，利用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，初步探究不同因子下葉片光合特性、抗氧化系統(tǒng)的動(dòng)態(tài)變化，以期為解析不同濕度條件對(duì)植株成熟的影響提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本試驗(yàn)于2016年在江西省撫州市黎川縣（東經(jīng)116.52°，北緯26.89°）開(kāi)展。供試材料為當(dāng)?shù)刂髟云贩N云煙87。土壤為紅壤土，其理化性狀：pH值7.22，有機(jī)質(zhì)8.72 g/kg，堿解氮51.27 mg/kg，速效磷16.84 g/kg，速效鉀5.14 g/kg。試驗(yàn)地位于平坦開(kāi)闊地塊，通風(fēng)良好，排灌、通電方便。煙苗于3月26日統(tǒng)一移栽，株距0.5 m，行距1.2 m，四周及各處理間設(shè)保護(hù)行，大田管理同當(dāng)?shù)爻Ｒ?guī)水平一致。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

依據(jù)前人研究［15-17］，本試驗(yàn)采取正交試驗(yàn)方法。根據(jù)其設(shè)計(jì)原則［18-19］，利用SPSS 21.0軟件進(jìn)行3因素3水平的正交設(shè)計(jì)，具體設(shè)計(jì)如表1所示。選擇不同光照強(qiáng)度（A）水平為50%（A1）、85%（A2）和120%（A3）3種自然光照強(qiáng)度，平均每日午間光照強(qiáng)度約為465.5×100、791.35×100、1117.2×100 lx；溫度（B）水平為（29±1） ℃（B1）、（33±1） ℃（B2）、（37±1） ℃（B3）3種；濕度（C）水平為（64±1）%大氣相對(duì)濕度（RH）（C1）、（73±1）% RH（C2）、（82 ±1）% RH（C3）3種。

表1 三因素三水平正交設(shè)計(jì)表

不同處理通過(guò)大棚溫室精確調(diào)控?zé)熤瓿墒炱诠庹諒?qiáng)度、溫度、濕度3個(gè)指標(biāo)。每個(gè)處理煙株約90株，通過(guò)透明無(wú)滴膜、遮陽(yáng)網(wǎng)及植物燈（棚鮮牌36W）調(diào)控光照強(qiáng)度，并用照度計(jì)（TES-1330A）測(cè)定各處理光照強(qiáng)度；通過(guò)制冷機(jī)（YJL-18）、加濕器（浩奇HQ-2008A6）、除濕器（多樂(lè)信DR-1382L）、風(fēng)機(jī)（貝德?tīng)朏ZY-400）、控溫插座（YWK-F）、控濕插座（W2105）調(diào)控各處理所需溫、濕度條件。

大棚于6月20日（烤煙成熟中后期）搭建完畢并開(kāi)始處理，每隔6 d各處理取樣測(cè)定其生理指標(biāo)，取樣部位為從下至上第15～16葉位，每次處理3個(gè)重復(fù)，共取樣3次。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目與指標(biāo)

光合色素用80%丙酮提取，按照Lichtenthaler等［20］的方法測(cè)定其含量?？寡趸割?lèi)活性根據(jù)Wei等［21］的方法，采用NBT光還原法測(cè)定超氧化物歧化酶（SOD）活性，愈創(chuàng)木酚法測(cè)定過(guò)氧化物酶（POD）活性，紫外吸收法測(cè)定過(guò)氧化氫酶（CAT）活性。移栽后96 d，在上午9:30～10:30利用快速光合測(cè)定儀（ECA-PC0401）測(cè)定葉片光合速率，每個(gè)處理5次重復(fù)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行正交設(shè)計(jì)、方差分析，采用Microsoft Excel 2013軟件制作表格，Origin 8.0軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 光照強(qiáng)度、溫度、濕度3個(gè)因子對(duì)成熟后期葉片光合速率的影響

2.1.1 不同因子水平下烤煙葉片光合速率影響的邊際值分析 光合速率的邊際值為所有處理中某一因子水平下光合速率的平均值，可以表示某因子水平變化對(duì)葉片光合速率的影響效應(yīng)。由各因子光合速率邊際值可知（表2），隨著光照強(qiáng)度的升高，光合速率呈先升高再降低的變化趨勢(shì)，3個(gè)光照強(qiáng)度水平下以85%光照強(qiáng)度時(shí)光合速率最高，85%和120%光照強(qiáng)度對(duì)應(yīng)的光合速率間差異未達(dá)到5%顯著水平。隨著溫度的升高，光合速率呈逐步降低的趨勢(shì)，38 ℃時(shí)對(duì)應(yīng)的光合速率顯著低于29 ℃的。隨著空氣相對(duì)濕度的增加，光合速率呈先升高再降低的變化趨勢(shì)，但差異未達(dá)到5%顯著水平。

表2 不同因子水平下烤煙葉片光合速率的邊際值

2.1.2 生態(tài)因子對(duì)烤煙葉片光合速率影響的主效應(yīng)分析 采用正交試驗(yàn)中常用的極差分析法［15，17］進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。極差越大，即因子的效應(yīng)值越大，表明因子變化對(duì)結(jié)果的影響越大。由表3可以看出，3個(gè)生態(tài)因子對(duì)于光合速率的影響均達(dá)到極顯著水平，且對(duì)光合速率的影響排序?yàn)楣庹諒?qiáng)度＞溫度＞濕度，光照強(qiáng)度為光合速率的主要影響因子。

表3 各因子對(duì)光合速率影響的極差 μmol/（m2·s）

2.2 光照強(qiáng)度、溫度、濕度3個(gè)因子對(duì)成熟后期葉片光合色素含量的影響

2.2.1 不同因子水平下烤煙葉片光合色素含量影響的邊際值分析 由圖1A可知，隨著光照強(qiáng)度的增加，3個(gè)時(shí)期葉綠素a（Chl a）含量均呈降低的趨勢(shì)，且以移栽后90 d弱光條件下降幅度最大；隨著溫度的升高，3個(gè)時(shí)期Chl a含量同樣呈下降的趨勢(shì)；從濕度變化可以看出，移栽后90 d在82%濕度條件下Chl a含量最高，移栽后96 d在73%濕度條件下Chl a含量最高，而移栽后102 d則在64%濕度條件下表現(xiàn)最好，但彼此間并無(wú)顯著差異。

由圖1B可知，葉綠素b（Chl b）含量隨著光照強(qiáng)度、溫度的增大而逐漸降低，但隨著濕度的增加呈現(xiàn)逐漸升高的變化趨勢(shì)。葉片衰老期間，葉綠素較易降解，而類(lèi)胡蘿卜素（Carotenoids）較為穩(wěn)定，故衰老期間葉片表現(xiàn)為黃色。

由圖1C可知，3個(gè)時(shí)期中Cars含量隨著光照強(qiáng)度的升高而增大，隨著溫度的升高而減小，其隨濕度的變化情況與Chl a含量隨濕度變化情況類(lèi)似，都是移栽后90 d在82%濕度條件下、移栽后96 d在73%濕度條件下、移栽后102 d在64%濕度條件下Cars含量最高。

由圖1D可知，光照強(qiáng)度與Chl a/b值間存在正相關(guān)關(guān)系，隨著光照強(qiáng)度的增加，成熟后期3個(gè)階段Chl a/b值皆升高。同時(shí)，隨著溫度的升高，Chl a/b值同樣升高。濕度與Chl a/b值變化存在負(fù)相關(guān)關(guān)系：當(dāng)濕度在64%條件下時(shí)，3個(gè)時(shí)期的Chl a/b值皆為最大。Chl a/b值大，表示Chl a降解較Chl b慢，即在相同葉綠素含量時(shí)，64%濕度條件下葉片對(duì)藍(lán)紫光的吸收不如其他濕度條件的。

圖1 不同因子水平下烤煙葉片Chl a、Chl b、Cars、Chl a/b值的邊際值

2.2.2 生態(tài)因子對(duì)烤煙葉片光合色素含量影響的主效應(yīng)分析 由各因子對(duì)光合色素含量影響的極差可以看出（表4），光照強(qiáng)度對(duì)Chl a含量的影響最大，3個(gè)時(shí)期皆達(dá)到極顯著水平；隨著時(shí)間的增加，葉片Chl a含量對(duì)于外界光照強(qiáng)度及溫度的響應(yīng)逐漸變?nèi)?。溫度和濕度條件下，Chl a的極差基本上未達(dá)到顯著水平。對(duì)于Chl b含量來(lái)說(shuō)，光照強(qiáng)度為主要影響因子，溫度為次要影響因子，濕度影響最小。

表4 各因子對(duì)光合色素含量影響的極差

在Cars含量的極差中，光照強(qiáng)度在3個(gè)時(shí)期的極差均最大，3個(gè)時(shí)期均達(dá)到極顯著水平，其影響隨著時(shí)間的推移逐漸減弱。溫度對(duì)Cars含量影響的極差在各個(gè)時(shí)期變化較小。濕度因子在移栽后90 d對(duì)Cars含量影響的極差僅次于光照強(qiáng)度因子，在其他2個(gè)時(shí)期極差減小。

Chl a/b值對(duì)于3個(gè)因子的響應(yīng)中，移栽后90 d，溫度對(duì)其影響的極差最大；其他2個(gè)時(shí)期，光照強(qiáng)度對(duì)Chl a/b值影響的極差最大，移栽后102 d時(shí)達(dá)到極顯著水平，濕度影響次之，溫度影響最弱。

2.3 光照強(qiáng)度、溫度、濕度3個(gè)因子對(duì)成熟后期葉片抗氧化酶類(lèi)活性的影響

2.3.1 不同因子水平下葉片抗氧化酶類(lèi)活性影響的邊際值分析 由圖2A可知，SOD活性分別隨著光照強(qiáng)度、溫度、濕度的增加而顯著降低。POD活性隨著光照強(qiáng)度和溫度的升高而增強(qiáng)，尤以不同光照強(qiáng)度下最為顯著；不同濕度水平下，在64%RH時(shí)3個(gè)時(shí)期的POD活性均為最高，之后隨著濕度的增加而顯著降低（圖2B）。CAT活性在不同因子水平下變化不一：隨著光照強(qiáng)度的增加，整體呈上升趨勢(shì)；隨著溫度的變化則呈先升高后下降的趨勢(shì)；而隨著濕度的增加，CAT活性呈逐漸降低的變化趨勢(shì)。

圖2 不同生態(tài)因子對(duì)烤煙葉片SOD、POD、CAT活性的邊際值

2.3.2 生態(tài)因子對(duì)葉片抗氧化酶類(lèi)活性影響的主效應(yīng)分析 極差的變化可以反映各因子影響力的變化。由表5可知，在光照強(qiáng)度、溫度、濕度3個(gè)因素中，光照強(qiáng)度對(duì)SOD、POD、CAT活性影響最大，是抗氧化酶類(lèi)活性的主要影響因子，溫度對(duì)抗氧化酶活性影響次于光照強(qiáng)度，濕度影響最小。在不同時(shí)期，SOD、POD活性對(duì)光照強(qiáng)度的響應(yīng)逐漸減弱，CAT活性對(duì)光照強(qiáng)度的響應(yīng)逐漸增強(qiáng)，移栽后102 d時(shí)濕度對(duì)CAT活性的影響逐漸增強(qiáng)。

表5 各因子對(duì)抗氧化酶類(lèi)活性影響的極差

3 討論

光合作用是植株體內(nèi)物質(zhì)形成的基礎(chǔ)［22-23］，作為一個(gè)復(fù)雜的生理過(guò)程，植物光合作用受外界環(huán)境因子調(diào)節(jié)，對(duì)環(huán)境變化極其敏感［24］。本研究表明，光照強(qiáng)度是影響葉片光合速率的關(guān)鍵因子，溫度為次要因子，濕度對(duì)光合速率的影響最小。隨著光照強(qiáng)度的增加，光合速率呈先升高再降低的變化趨勢(shì)，表明高光照強(qiáng)度使葉片出現(xiàn)了光抑制現(xiàn)象；隨著溫度的升高，光合速率呈逐步降低的趨勢(shì)，光合作用減弱；隨著濕度的增加，光合速率呈先升高再降低的變化趨勢(shì)；這與Xu［3］、Elias［25］等的研究結(jié)果一致。

光合色素包括葉綠素和類(lèi)胡蘿卜素2類(lèi)，葉綠素負(fù)責(zé)光能的吸收、傳遞和轉(zhuǎn)化，類(lèi)胡蘿卜素則負(fù)責(zé)捕獲光能及光破壞防御［26］。在成熟后期不同階段，Chl a含量與光照強(qiáng)度、溫度呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，但其最適濕度則隨著時(shí)間的推移而逐漸變小。Chl b的含量，在成熟后期不同階段，隨光照強(qiáng)度的升高而顯著降低，但對(duì)于溫度和濕度變化的響應(yīng)并不靈敏。

脅迫條件下，植物能夠通過(guò)葉黃素循環(huán)進(jìn)行熱耗散，減輕光氧化的傷害［27-28］。本研究中，高光照強(qiáng)度下Cars含量顯著增加，有利于植株消耗過(guò)剩的光能，保護(hù)葉片不受強(qiáng)光損傷；但高溫條件下Cars含量則較低。對(duì)于濕度來(lái)講，隨著葉片衰老程度的加劇，其最適濕度條件由82%、73%最終變?yōu)?4%。可以推斷，烤煙成熟后期高溫、高濕條件可能會(huì)阻礙類(lèi)胡蘿卜素的產(chǎn)生，影響葉黃素的循環(huán)，不利于葉片通過(guò)葉黃素循環(huán)耗散過(guò)剩光能。

光照強(qiáng)度減弱，Chl a/b值減弱，有利于捕獲漫射中占優(yōu)勢(shì)的藍(lán)紫光，在一定程度上提高了光能的利用率，是植物對(duì)于弱光的適應(yīng)反應(yīng)；同時(shí)葉綠體對(duì)2，6-二氯酚靛酚的還原能力增加，葉綠體光合磷酸化活性提高［29］。當(dāng)植物的光合機(jī)構(gòu)接受的光能超過(guò)所能利用的限度時(shí)，則會(huì)發(fā)生光抑制，產(chǎn)生過(guò)剩激發(fā)能［30］。烤煙成熟后期，當(dāng)外界濕度大時(shí)，Chl a/b值較低，若此時(shí)強(qiáng)光照射，植物會(huì)捕獲更多的藍(lán)紫光，使得光抑制現(xiàn)象嚴(yán)重加劇，造成光損傷及光合機(jī)構(gòu)的破壞。僅從Chl a/b角度上考慮，高光照強(qiáng)度和低濕度條件較為相配。綜合邊際值結(jié)果可知，煙株成熟后期光照強(qiáng)度對(duì)光合色素含量影響最大，溫度和濕度條件是次要因子，光合色素含量受三者共同調(diào)控。

強(qiáng)光下，過(guò)剩的光能通過(guò)電子傳遞鏈與分子氧結(jié)合形成超氧陰離子自由基［31］?？寡趸到y(tǒng)中，SOD將超氧陰離子自由基轉(zhuǎn)化為H2O2，過(guò)剩的H2O2則被POD和CAT清除，以抵御細(xì)胞氧化損傷［32-33］。本研究表明，烤煙成熟后期SOD活性受光照強(qiáng)度、溫度、濕度3個(gè)因子共同調(diào)控，且隨三者的增大而降低。即植株在高光、高溫、高濕條件下，葉片對(duì)超氧陰離子自由基清除能力下降，根據(jù)自由基傷害假說(shuō)［34］可知，膜脂過(guò)氧化作用加劇，葉片易受損傷，導(dǎo)致葉片提前衰老。POD和CAT活性則主要受光照強(qiáng)度影響。值得注意的是，高光照強(qiáng)度、高溫條件下使得POD活性升高，而高濕條件下則使得POD活性降低，即高光照強(qiáng)度、高溫條件時(shí)，葉片清除過(guò)氧化物能力增強(qiáng)，但高濕條件時(shí)則阻礙了這一清除過(guò)程。

本研究結(jié)果表明，光照強(qiáng)度、溫度、濕度作為主要的3個(gè)生態(tài)因子，協(xié)同調(diào)控著烤煙的成熟衰老。光照強(qiáng)度是影響成熟期烤煙光合作用及抗氧化活性的主要因子，溫度和濕度這2個(gè)因子影響力稍弱。成熟后期不同階段，各生態(tài)因子對(duì)烤煙的影響規(guī)律基本一致。其中光照強(qiáng)度和溫度因子表現(xiàn)為相同的影響趨勢(shì)，濕度因子在部分光合及抗氧化指標(biāo)中表現(xiàn)出與光照強(qiáng)度、溫度因子不同的影響趨勢(shì)。