Hippo通路及其在眼科領(lǐng)域的研究進(jìn)展

孫啟航，談旭華，羅莉霞

0引言

Hippo通路是一個(gè)進(jìn)化上保守的信號通路，它最初在黑腹果蠅中發(fā)現(xiàn)[1]，調(diào)控許多生物過程，包括調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和分化，控制器官大小和再生。哺乳動物Hippo通路的核心組分包括一個(gè)激酶級聯(lián)——MST1/2、SAV1、MOB1和LATS1/2，以及下游效應(yīng)因子——轉(zhuǎn)錄共激活因子YAP和TAZ[2]。這些Hippo通路的核心組分通過調(diào)控下游靶基因的轉(zhuǎn)錄，參與細(xì)胞增殖、分化、遷移和維持干細(xì)胞活性等生理活動[3-5]。目前的研究發(fā)現(xiàn)，Hippo通路可能與很多眼部組織的發(fā)育再生和眼科疾病存在密切聯(lián)系，本文從Hippo通路的核心組分、生物學(xué)作用及其在眼科領(lǐng)域的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述。

1 Hippo通路的核心組分和調(diào)控機(jī)制

在果蠅體內(nèi)，Hippo通路核心組分包括由蛋白激酶Wart(Wts)、Salvador(Sav)、Hippo(Hpo)和Mob(Mats)[2]形成的激酶級聯(lián)，以及下游效應(yīng)因子Yorkie(Yki)。Hpo在果蠅中發(fā)生突變可導(dǎo)致器官過度生長，形成類似河馬(Hippopotamus)的外觀，故稱為Hippo通路。

從果蠅到哺乳動物，Hippo通路是高度保守的。Wts、Sav、Hpo和Mats在哺乳動物中的同源蛋白分別為LATS1/2、SAV1、MST1/2和MOB1。MST1/2與SAV1形成異二聚體，使SAV1、MOB1和LATS1/2激酶磷酸化[6-8]。LATS1/2直接磷酸化Yki同源蛋白YAP(yes-associated protein)和TAZ(transcriptional activator with PDZ-binding domain)，從而抑制其進(jìn)入細(xì)胞核[9-10]。YAP/TAZ是不含DNA結(jié)合域的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，主要與TEAD(TEA/ATTS domain)家族轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合[11-12]。Hippo通路的活性受到多種信號如機(jī)械應(yīng)力、細(xì)胞間接觸、細(xì)胞極性、代謝狀態(tài)和生長因子的嚴(yán)格調(diào)控，進(jìn)而控制著YAP/TAZ在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)之間的定位變化。Hippo通路關(guān)閉時(shí)(圖1A)，未磷酸化的YAP/TAZ進(jìn)入細(xì)胞核中，與TEADs和其他轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，啟動對細(xì)胞增殖、分化和遷移至關(guān)重要的轉(zhuǎn)錄程序。Hippo通路開啟時(shí)(圖1B)，活化的LATS激酶磷酸化YAP/TAZ，導(dǎo)致其與蛋白14-3-3結(jié)合并停留細(xì)胞質(zhì)中，最終被降解[13-14]。在核內(nèi)沒有YAP/TAZ的情況下，TEAD通過與轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子VGLL4結(jié)合[15-16]，抑制靶基因如結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth factor, CTGF)和Cyr61[17]的表達(dá)，從而限制組織生長和細(xì)胞增殖。

2 Hippo通路的生物學(xué)作用

2.1控制器官大小控制器官大小是Hippo通路最常見的生理功能。在果蠅體內(nèi)，Hippo通路激酶或上游調(diào)節(jié)因子的突變導(dǎo)致眼、翅膀等器官的過度生長[18]。在小鼠體內(nèi)，特異性激活Yap1或敲除Mst1/2、Sav1可導(dǎo)致心臟可逆性增大[19]，并且心肌細(xì)胞的增殖和凋亡對YAP的調(diào)控敏感[20-21]。Hippo通路還可通過響應(yīng)拉伸和壓縮等機(jī)械信號來控制器官大小。在體外培養(yǎng)的哺乳動物細(xì)胞中，當(dāng)細(xì)胞被拉伸時(shí)，YAP和TAZ活性升高，當(dāng)細(xì)胞被壓縮時(shí)活性降低[22]。

2.2調(diào)控胚胎期細(xì)胞分化和器官發(fā)育Hippo通路在胚胎細(xì)胞分化過程中的部分作用已得到證實(shí)。敲除Tead4的小鼠胚胎不能分化出滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞。敲除Lats1/2、Nf2等基因后，所有細(xì)胞無法分化成內(nèi)細(xì)胞團(tuán)來源的組織[23-24]。此外，組織特異性的YAP缺失會導(dǎo)致小鼠心臟、骨骼和腎臟的發(fā)育異常[21,25-26]。人體內(nèi)YAP轉(zhuǎn)錄活性缺失也會導(dǎo)致眼部組織的發(fā)育異常，例如，TEAD1突變可導(dǎo)致Sveinsson脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜萎縮和Aicardi綜合征[27-28]，在視神經(jīng)裂閉合缺陷中也發(fā)現(xiàn)了YAP缺失突變[29]。由此可見，Hippo通路在早期胚胎細(xì)胞分化和器官正常發(fā)育中起關(guān)鍵作用。

2.3維持干細(xì)胞活性和調(diào)控組織再生Hippo通路的效應(yīng)分子YAP/TAZ可調(diào)控不同干細(xì)胞的功能，YAP能促進(jìn)胚胎干細(xì)胞的多能性[30]，TAZ可調(diào)節(jié)間充質(zhì)干細(xì)胞的分化[31-32]。小鼠干細(xì)胞的基因表達(dá)譜顯示，YAP和TEAD在多種組織的干細(xì)胞中富集[33]，如腸、肝、皮膚和神經(jīng)的干細(xì)胞或祖細(xì)胞中均觀察到Y(jié)ap/Taz的高表達(dá)[34-35]。Yap/Taz條件性敲除小鼠的腸道再生能力受阻[36]。肝部分切除術(shù)后數(shù)天內(nèi)，YAP活性被誘導(dǎo)，可能是肝臟完全再生所必需的[37-38]。成人心肌的再生非常有限，然而，YAP特異性激活可使心肌的再生能力得到一定程度的恢復(fù)[39-40]。相反，心臟特異性的YAP缺失會抑制心肌的再生[41]。

2.4在細(xì)胞間黏附和接觸抑制中的作用接觸抑制是貼壁細(xì)胞與相鄰細(xì)胞進(jìn)行物理接觸時(shí)停止增殖的現(xiàn)象。細(xì)胞之間的相互接觸可通過YAP和TAZ來調(diào)控細(xì)胞的增殖和存活[42]。一種可能的機(jī)制是：當(dāng)細(xì)胞接觸時(shí)，黏附連接蛋白如Crumbs、PATJ、PALS和E-鈣黏蛋白可以與YAP和TAZ結(jié)合[43]，將YAP/TAZ隔離在細(xì)胞連接處，阻止它們進(jìn)入細(xì)胞核，還可通過阻止YAP/TAZ去磷酸化[43]，從而抑制細(xì)胞增殖。

3 Hippo通路在眼部組織的研究進(jìn)展

3.1Hippo通路在晶狀體中的研究

3.1.1維持晶狀體上皮細(xì)胞極性晶狀體的透明性依賴于晶狀體上皮細(xì)胞的有序排列，即頂端朝向晶狀體纖維，基底部朝向前囊膜，稱為晶狀體上皮細(xì)胞的頂端-基底極性。Song等[44]的研究發(fā)現(xiàn)，野生型小鼠晶狀體中，YAP蛋白與極性復(fù)合體蛋白Crb在晶狀體上皮細(xì)胞(lens epithelial cell, LEC)的頂端連接處共定位，在小鼠晶狀體中特異性敲除Yap可導(dǎo)致LEC形態(tài)由正常的立方型變扁平，并且Par和Crb極性復(fù)合體的頂端定位被破壞，上皮細(xì)胞極性紊亂，從而導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)白內(nèi)障。因此，YAP可能通過與極性復(fù)合體Par和Crb相互作用，調(diào)控它們的定位[22,45]，從而維持正常LEC的極性。

3.1.2調(diào)節(jié)晶狀體細(xì)胞增殖和纖維分化正常生理狀態(tài)下，LEC終身保持增殖和分化。LEC在持續(xù)增殖的同時(shí)，逐漸遷移至赤道部的過渡區(qū)并退出細(xì)胞周期，分化為晶狀體纖維(lens fibers, LF)細(xì)胞。Kumar等[46]發(fā)現(xiàn)，晶狀體受到的外力牽拉可作為調(diào)節(jié)Hippo通路的機(jī)械信號，改變YAP在LEC中的定位從而調(diào)節(jié)LEC增殖。YAP的上游負(fù)調(diào)節(jié)因子NF2很可能直接調(diào)節(jié)赤道部的LEC退出細(xì)胞周期[47]，并激活分化為LF細(xì)胞的基因如β-晶狀體蛋白。但是NF2是直接作用于YAP還是通過經(jīng)典的Hippo上游激酶(如MST1/2和LATS1/2)作用仍然未知。Dawes等[48]發(fā)現(xiàn)，在低濃度成纖維細(xì)胞生長因子(fibroblast growth factors, FGF)的刺激下，F(xiàn)GF與受體結(jié)合激活MEK-ERK1/2，促進(jìn)YAP進(jìn)入細(xì)胞核，與TEAD結(jié)合促進(jìn)LEC增殖的基因轉(zhuǎn)錄；而在高濃度FGF刺激下，Hippo信號通路被激活，YAP被MST1/2-LATS1激酶級聯(lián)磷酸化后與14-3-3蛋白結(jié)合，并留在細(xì)胞質(zhì)中，最終導(dǎo)致LEC退出細(xì)胞周期，開始纖維分化。

3.1.3Hippo通路與白內(nèi)障白內(nèi)障即晶狀體混濁，是全球第一位的致盲眼病[49]，其確切的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，近年研究發(fā)現(xiàn)，Hippo通路可能參與白內(nèi)障的發(fā)生發(fā)展。He等[50]觀察到Y(jié)ap敲除小鼠在出生后1.5mo出現(xiàn)核性白內(nèi)障，表現(xiàn)為LEC數(shù)量減少、纖維細(xì)胞脫核異常和Morgagian小球積聚，且晶狀體比野生型小。YAP缺失引起白內(nèi)障的病理過程分為兩個(gè)方面——主要影響和次要影響。主要影響是YAP缺失會下調(diào)與晶狀體增殖和發(fā)育相關(guān)基因如Sox2、Pax6和Dnase2b[51-52]的表達(dá)，導(dǎo)致LEC增殖減少。次要影響是YAP缺失加速晶狀體細(xì)胞衰老并導(dǎo)致晶狀體結(jié)構(gòu)蛋白水平降低以及炎癥因子水平增加，最終促進(jìn)白內(nèi)障的形成。此外，Lu等[53]的研究發(fā)現(xiàn)小鼠中Yap1的雜合缺失可導(dǎo)致成年期白內(nèi)障，大多數(shù)Yap1雜合小鼠在出生后6mo時(shí)出現(xiàn)了白內(nèi)障，且晶狀體存在多種形態(tài)缺陷，包括囊膜破裂、皮質(zhì)內(nèi)空泡和纖維斷裂?？赡艿臋C(jī)制是：Yap1基因的雜合缺失導(dǎo)致其靶基因Crim1無法維持足夠的表達(dá)，使LEC不能持續(xù)增殖，從而造成晶狀體發(fā)育異常和混濁[54]。總而言之，Hippo通路在晶狀體上皮的增殖、分化中具有不可或缺的作用，Hippo通路核心成分有望作為研究晶狀體發(fā)育的重要分子，并且可能有助于某些先天性白內(nèi)障的診斷和預(yù)測。

3.2Hippo通路在視網(wǎng)膜中的研究

3.2.1調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜發(fā)育在視泡發(fā)育過程中，神經(jīng)視網(wǎng)膜(neural retina, NR)和視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelium, RPE)來自共同的祖細(xì)胞[55-56]。在斑馬魚中[57]，YAP/TAZ-TEAD信號在視杯發(fā)生過程中處于活躍狀態(tài)，而yap-/-突變體表現(xiàn)出RPE缺陷，說明YAP和TAZ可調(diào)節(jié)RPE細(xì)胞命運(yùn)，潛在機(jī)制是YAP/TAZ通過與轉(zhuǎn)錄因子TEAD結(jié)合，從而調(diào)節(jié)RPE細(xì)胞分化。在非洲爪蟾胚胎中，YAP和參與許多發(fā)育過程的蛋白PKNOX1[58]相互作用，控制視網(wǎng)膜干細(xì)胞中S期的進(jìn)程并維持基因組穩(wěn)定。Kim等[59]的研究發(fā)現(xiàn)，YAP可能通過促進(jìn)視網(wǎng)膜祖細(xì)胞從G1期過渡到S期，以及加快S期和G2期的進(jìn)程，從而維持視網(wǎng)膜祖細(xì)胞的增殖活性。

圖1 Hippo通路的核心組分 A：當(dāng)Hippo通路關(guān)閉時(shí)，YAP/TAZ去磷酸化并進(jìn)入細(xì)胞核，在核內(nèi)與TEAD等轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，誘導(dǎo)靶基因轉(zhuǎn)錄；B：當(dāng)Hippo通路開啟時(shí)，活化的LATS激酶使YAP/TAZ磷酸化，與14-3-3結(jié)合，停留在胞質(zhì)中并被降解，此時(shí)TEAD與VGLL4結(jié)合，抑制靶基因轉(zhuǎn)錄。

3.2.2調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞重編程和纖維分化視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞在視網(wǎng)膜損傷時(shí)能夠重新進(jìn)入細(xì)胞周期并產(chǎn)生多能祖細(xì)胞，參與視網(wǎng)膜再生[60]，還可以轉(zhuǎn)化為肌成纖維樣細(xì)胞促進(jìn)視網(wǎng)膜纖維化[61]。Rueda等[62]的研究發(fā)現(xiàn)，YAP可促進(jìn)Müller細(xì)胞表達(dá)cyclin D1，重編程為視網(wǎng)膜祖細(xì)胞，而Hippo通路激活可通過抑制YAP的活性阻止視網(wǎng)膜再生。在糖尿病小鼠模型的研究中發(fā)現(xiàn)[63]，高血糖條件下視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞中的YAP被激活，從而使Müller細(xì)胞發(fā)生纖維分化和收縮，并產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)和釋放促纖維化因子，增加的ECM又反過來激活YAP，形成促進(jìn)視網(wǎng)膜纖維化的循環(huán)，最終導(dǎo)致糖尿病牽拉性視網(wǎng)膜脫離。因此，Hippo通路有助于視網(wǎng)膜再生療法的研究，如何調(diào)控Hippo通路來促進(jìn)視網(wǎng)膜再生并減少視網(wǎng)膜纖維化是一個(gè)值得探討的問題。

3.2.3參與視網(wǎng)膜微血管生成信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄因子激活因子3(STAT3)是一種轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、凋亡[64]并促進(jìn)缺血視網(wǎng)膜中的新生血管形成[65]。YAP與STAT3相互作用以促進(jìn)STAT3的磷酸化激活、核易位和血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)轉(zhuǎn)錄，從而上調(diào)人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和血管形成[66]。此外，STAT3通過降低緊密連接蛋白ZO-1和Occludin[67]的表達(dá)增加小鼠視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮通透性，從而促進(jìn)糖尿病視網(wǎng)膜病變的進(jìn)展。STAT3與YAP的相互作用為視網(wǎng)膜新生血管形成提供了新的治療靶點(diǎn)。

3.3Hippo通路在角膜中的研究

3.3.1調(diào)節(jié)角膜上皮細(xì)胞增殖角膜上皮在受到損傷后，通過局部角膜上皮細(xì)胞的增殖和遷移來覆蓋缺損并重建屏障功能，從而修復(fù)損傷。YAP的上游調(diào)節(jié)劑溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid, LPA)被證明可通過表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)通路調(diào)節(jié)角膜上皮細(xì)胞增殖，并通過PI3K/AKT途徑促進(jìn)角膜傷口愈合[68]。此外，Lee等[69]的研究表明，應(yīng)激反應(yīng)蛋白Sesn2的缺乏會增加角膜上皮細(xì)胞中活性氧的產(chǎn)生并激活YAP，從而促進(jìn)角膜上皮細(xì)胞增殖。因此，對角膜上皮細(xì)胞中的YAP活性進(jìn)行調(diào)節(jié)有助于促進(jìn)損傷修復(fù)，而LPA和Sesn2可作為潛在的治療靶點(diǎn)。

3.3.2調(diào)節(jié)角膜緣干細(xì)胞增殖角膜緣干細(xì)胞(limbal stem cells, LSCs)有助于維持角膜上皮的穩(wěn)態(tài)[70-71]，是角膜上皮再生的來源，當(dāng)角膜損傷后增殖活躍以加速修復(fù)損傷[71-72]。Hippo通路的效應(yīng)分子YAP在調(diào)控LSCs增殖分化中具有重要作用。在直徑大于4mm的傷口中，YAP激活介導(dǎo)LSCs的活化和增殖，隨后遷移以封閉缺損的上皮[73]。Gouveia等[74]提出，角膜傷口愈合過程中基質(zhì)變硬，誘導(dǎo)YAP激活以抑制ABCG2的表達(dá)[75]，從而促進(jìn)LSCs分化[76-77]。因此，調(diào)控YAP的活性可促進(jìn)LSCs介導(dǎo)的角膜上皮修復(fù)。Hou等[78]的研究證明Agrin可以抑制YAP1的磷酸化并調(diào)節(jié)下游cyclin D1的表達(dá)，從而促進(jìn)LSCs的增殖。

3.3.3Hippo通路與角膜疾病除了調(diào)控角膜上皮細(xì)胞和LSCs的增殖分化外，Hippo通路在某些角膜疾病中也發(fā)揮著重要作用。轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果顯示，在圓錐角膜中，Hippo通路(FAT4、LATS2、TEAD2、TEAD4)的mRNA表達(dá)水平與非圓錐角膜相比顯著下調(diào)[79]。Zhang等[80]發(fā)現(xiàn)，在小鼠角膜真菌感染期間，差異基因在Wnt、cGMP-PKG和Hippo通路顯著富集。以上研究結(jié)果提示Hippo通路可能在圓錐角膜和真菌性角膜炎的發(fā)病機(jī)制中起重要作用，靶向調(diào)控該通路和關(guān)鍵因子可能有助于這些疾病的防治。

綜上，Hippo通路有望成為角膜修復(fù)和再生療法的重要靶點(diǎn)，Hippo通路中的某些分子可能成為角膜感染性疾病或遺傳性疾病診斷和預(yù)后的分子靶標(biāo)。

3.4Hippo通路在小梁網(wǎng)中的研究既往研究證明，YAP和TAZ在青光眼中隨著小梁網(wǎng)(trabecular meshwork, TM)的彈性硬度的增加而上調(diào)[81]。最近的研究發(fā)現(xiàn)，在人類小梁網(wǎng)(hTM)細(xì)胞中，LPA及其受體可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞收縮張力來刺激YAP/TAZ的轉(zhuǎn)錄活性，并增加CTGF的表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致ECM的產(chǎn)生增加[82]，也可通過IL-6反式信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與YAP、TAZ和STAT3通路相互作用[83]，引起ECM異常重塑從而導(dǎo)致眼內(nèi)壓升高[84-85]。而交聯(lián)的ECM又會使β-連環(huán)蛋白和YAP/TAZ功能失調(diào)導(dǎo)致TM變硬[86]。因此，抑制YAP活性可改善hTM細(xì)胞中LPA和/或IL-6反式信號轉(zhuǎn)導(dǎo)介導(dǎo)的高眼壓。miR-137可通過直接靶向Src來阻斷YAP/TAZ的激活，促進(jìn)細(xì)胞生長并抑制hTM細(xì)胞中的ECM蛋白表達(dá)[87]，因此可能被用作治療青光眼的新靶點(diǎn)。

3.5Hippo通路在葡萄膜中的研究研究表明，YAP/TEAD可通過結(jié)合CD44啟動子激活CD44基因轉(zhuǎn)錄，或者通過激活靶基因轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶2[88]，促進(jìn)脈絡(luò)膜新生血管(choroidal neovascularization, CNV)形成[89]。用YAP-siRNA處理顯著降低了小鼠模型中激光誘導(dǎo)的CNV的程度[90]，表明YAP可能是治療CNV的重要分子靶標(biāo)。超過80%的葡萄膜黑色素瘤(uveal melanoma, UM)攜帶GNAQ或GNA11的激活突變[91-92]，其編碼蛋白Gq/11可能通過激活YAP促進(jìn)葡萄膜黑色素瘤的發(fā)生[93]，在GNAQ和GNA11突變的脈絡(luò)膜痣中也觀察到下游YAP激活[94]。而YAP抑制劑維替泊芬能選擇性抑制Gq/11突變的葡萄膜黑色素瘤發(fā)生，因此有望成為治療葡萄膜黑色素瘤的分子靶向藥物。

4討論與展望

綜上所述，Hippo通路在眼組織中主要通過激酶級聯(lián)傳遞信號，作用于效應(yīng)分子YAP/TAZ，從而調(diào)控細(xì)胞增殖與分化，在角膜、晶狀體、視網(wǎng)膜等組織的發(fā)育、再生中具有重要作用，Hippo通路的異常激活或失活可引起白內(nèi)障、青光眼、角膜和視網(wǎng)膜病變等，但具體致病機(jī)制尚不清楚。Hippo通路如何受到眼內(nèi)特有環(huán)境如房水、玻璃體中的因子的調(diào)控？Hippo通路如何與其他信號通路相互作用，調(diào)控眼部組織的生理功能？YAP與何種下游分子相互作用，從而調(diào)控眼部組織特異的基因表達(dá)？以上問題有待進(jìn)一步的研究。闡明Hippo通路在眼部組織中的作用機(jī)制，不僅能夠完善現(xiàn)有研究的理論體系，而且有望在眼科臨床中應(yīng)用，例如，Hippo通路中的基因可為某些遺傳性眼部疾病診斷提供預(yù)測，Hippo通路激酶(如LATS、MST)和效應(yīng)分子(YAP/TAZ)可作為某些眼部腫瘤的治療靶點(diǎn)，或成為監(jiān)測某些眼部疾病預(yù)后的指標(biāo)。因此，Hippo通路在眼科疾病的防治中具有廣闊的應(yīng)用前景。