病原體宏基因檢測在慢性腎臟病合并感染患者中的應用

任紅旗

二代測序(NGS),亦稱為高通量或大規(guī)模并行測序。與傳統(tǒng)的測序方法相比,這些非基于Sanger的新技術具有通量高,測序速度快,運行成本低和準確性高等優(yōu)勢。其核心是邊合成邊測序,其特點是能一次運行幾十萬到幾百萬條DNA分子的序列測定,極大地降低了測序成本、提高了測序效率。在微生物檢測中,NGS可用于宏基因組、全基因組、轉(zhuǎn)錄組、目標基因等測序,是目前病原微生物研究領域應用最為廣泛的測序手段。

宏基因組二代測序(mNGS)技術指采用NGS技術對特定標本中所有核酸序列進行測序。mNGS是一種新的診斷技術,可以快速、準確、無偏倚地檢測受者樣本中的所有病原體,對復雜和罕見病原體的鑒定有很大幫助。隨著技術的不斷進步,mNGS在臨床上逐漸普及,尤其適用于器官移植后、免疫缺陷和長期使用免疫抑制劑患者的嚴重感染。

慢性腎臟病(CKD)合并感染

CKD感染的發(fā)生率及可能機制感染是CKD患者常見并發(fā)癥,不僅是引起疾病進展的重要原因,也是CKD患者住院和死亡的第二位原因,占CKD患者全因死亡的35%。根據(jù)美國腎臟數(shù)據(jù)系統(tǒng),從2001～2010年,血液透析第一年的肺炎入院率平均為26.6次/1 000患者·年。血液透析患者因膿毒癥導致的死亡風險比普通人群高約250倍。

CKD患者先天和適應性免疫系統(tǒng)的正常反應受損,容易導致感染。與普通人群相比,腎功能不全患者會出現(xiàn)明顯的免疫失調(diào),其特點是慢性免疫激活和慢性免疫抑制并存。尿毒癥可能直接或間接影響腸道屏障和腸道微生物的組成,細菌及其產(chǎn)物通過腸道屏障移位,激活先天免疫;此外,氧化應激、炎癥和代謝失調(diào)進一步引起患者免疫功能障礙,從而導致疫苗接種反應差,感染和惡性腫瘤發(fā)病率高。尿毒癥患者免疫功能減退的主要因素包括尿毒癥毒素、營養(yǎng)不良、慢性炎癥、維生素D-甲狀旁腺激素軸的改變及透析相關因素。

CKD感染的病原學特點CKD患者合并感染的病原體除常見的細菌、病毒、支原體及衣原體外,還有一些特殊的病原體。

肺孢子菌肺炎(PCP) 肺孢子菌是呼吸道常見定植微生物,經(jīng)空氣途徑傳播,可發(fā)生人與人傳播。在非人類免疫缺陷病毒(HIV)感染患者中,免疫抑制療法特別是激素聯(lián)合細胞毒藥物是發(fā)生PCP的非常重要的危險因素,此外,腎功能減退也與PCP發(fā)生密切相關,推測這可能是由于腎小球濾過率(GFR)降低,循環(huán)中免疫抑制劑蓄積,導致機體免疫功能進一步減退。

巨細胞病毒(CMV)感染 CMV是免疫功能受損患者最常見的病毒感染,發(fā)生率與免疫抑制治療有關,因此在腎移植患者中更受關注。

奴卡菌感染 奴卡菌屬革蘭陽性放線菌,是一種條件致病菌。細胞介導免疫對于抑制奴卡菌感染至關重要。大劑量激素、免疫抑制劑使用及腎移植等是CKD患者合并奴卡菌感染的危險因素。

結核分枝桿菌(MTB)感染 CKD患者MTB感染有以下特點:潛伏感染,臨床表現(xiàn)不典型、肺外結核的發(fā)病率高,結核中毒癥狀常常被CKD患者非特異癥狀如疲勞、營養(yǎng)不良所掩蓋,病死率高等。

mNGS在CKD感染中的應用

重癥感染CKD患者臨床常見的重癥感染有膿毒癥、中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染、重癥肺炎等。Jiang等報道373例CKD 5期患者中,有333例發(fā)生感染,其中,普通感染307例(82.3%);重癥感染26例(7.0%)。26例重癥感染患者中,血液透析患者占92.3%,且呼吸道感染最常見(占66.8%)。Peng等報道112例住院治療的狼瘡性腎炎患者中28例(25%)合并重癥肺炎,且死亡率較高(53.6%)。陳樂波等報道187例腎病綜合征合并重度感染的患者,包括危重癥感染53例(28.3%)和重癥感染134例(71.7%)。感染類型以肺部感染最多見,共102例(54.55%),其次是皮膚軟組織感染55例(29.41%)。危重癥感染以肺孢子菌、侵襲性曲霉、鮑曼不動桿菌等機會性感染為主,重癥感染患者病原體多數(shù)不明。此外,CKD 5D期患者中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染比較常見,Hsu等報道與對照組比較,透析患者發(fā)生中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的風險增加了3.46倍,死亡風險增加了5.99倍。

對于重癥感染的診斷,mNGS 具有較高的臨床應用價值,能夠快速、精準地找到病原體。Chen等對20例重癥肺炎患者行mNGS檢測,17例(85%)檢出病原體,其中10例為細菌感染,5例為病毒感染,2例為真菌感染,而傳統(tǒng)方法病原學檢出率僅為50%。Zhang 等在135例細菌性腦膜炎患者中,應用mNGS 診斷肺炎鏈球菌腦膜炎的敏感性和特異性分別為73.1% 和88.1%。

復發(fā)性尿路感染尿路感染是CKD患者常見的并發(fā)癥,可加速CKD進展,增加患者病死率。常見因素包括激素和免疫抑制劑使用、泌尿系結石、多囊腎、糖尿病、神經(jīng)源性膀胱及導尿管的使用等。與非糖尿病患者相比,糖尿病患者發(fā)生尿感的相對危險性明顯增加,急性腎盂腎炎發(fā)生率增加10倍。糖尿病患者不僅尿路感染發(fā)生率高,且因尿路感染產(chǎn)生的并發(fā)癥(如氣腫性膀胱炎、膿腫形成、腎乳頭壞死等)發(fā)生率也增高,危害極大。

復雜性尿路感染,傳統(tǒng)的尿培養(yǎng)及血培養(yǎng),病原學檢出率比較低。傳統(tǒng)尿培養(yǎng)和血清學檢測致病微生物陰性的樣本,采用mNGS,可以明顯提高陽性檢出率。Ishihara等研究10例急性復雜性尿路感染患者,盡管接受治療仍有急性膀胱炎癥狀,但尿培養(yǎng)結果陰性,采用mNGS后病原學的陽性檢出率明顯提高。McDonald等報道m(xù)NGS有助于提高神經(jīng)源性膀胱合并無癥狀尿路感染患者病原學的檢出率。疑似非典型細菌或厭氧菌感染的復發(fā)性尿路感染的患者,細菌載量低或傳統(tǒng)方法無法診斷的耐藥性感染,mNGS明顯提高病原學檢測陽性率。 此外,Liu等報道1例CKD合并尿路感染患者,病原學不明,經(jīng)用mNGS檢測成功診斷恙蟲導致的尿路感染。

免疫缺陷患者感染的診斷CKD患者由于長期使用糖皮質(zhì)激素,免疫抑制劑及腎功能損害,常易發(fā)生免疫功能缺陷。體內(nèi)中性粒細胞、單核細胞/巨噬細胞抗菌能力下降,樹突狀細胞對T細胞依賴性免疫應答減少,效應和調(diào)節(jié)T細胞功能下降,B細胞凋亡增加等,易發(fā)生感染,包括一些特殊且少見的病原體,如肺孢子菌、奴卡菌、鸚鵡熱衣原體及結核分支桿菌。然而,由于這些病原學常規(guī)檢測陽性率較低,臨床上易誤診或漏診。而mNGS檢測顯示出良好的診斷潛力,不受免疫抑制程度的影響,并且能指導抗感染藥物治療。

李世軍等觀察CKD接受免疫抑制治療后合并彌漫性肺部感染、臨床擬診為PJP患者37例,采用mNGS檢測外周血樣本37份,其中35份檢出耶氏肺孢子菌序列,敏感度94.59%,特異度100%;31例患者為混合型感染,27例檢出病毒序列(19例為巨細胞病毒),8例合并細菌感染。因而,mNGS較PCP 的其他病原學診斷方法更具優(yōu)勢,對免疫抑制合并肺部感染患者的診斷有重要的指導意義。Zhang等用mNGS檢測腎移植合并疑似PCP肺部感染的患者,13/14例患者外周血PCP陽性,其中11例PJP陽性患者經(jīng)PCR證實。

小結:感染是CKD患者常見并發(fā)癥,及時診斷,及時救治,可降低患者的死亡率。mNGS能無偏倚性檢測各種病原體,彌補了傳統(tǒng)病原學檢測方法的不足,在CKD合并感染性疾病的診斷中顯示出巨大的臨床應用價值。然而,mNGS 應用于臨床檢測,需注意缺乏標準化的數(shù)據(jù)處理和數(shù)據(jù)分析,無法直接檢測RNA病毒,結核分枝桿菌、軍團菌等檢測率低,假陽性及假陰性結果等問題。