病原體宏基因檢測在腎臟疾病使用免疫抑制患者中的應(yīng)用

李世軍

腎臟疾病患者因長期使用糖皮質(zhì)激素或免疫抑制劑,處于免疫抑制狀態(tài)。免疫功能受損患者感染發(fā)生率高,病原體多而復(fù)雜,診斷更加困難。因此病原學(xué)的精準(zhǔn)診斷對腎臟疾病免疫抑制伴感染患者精準(zhǔn)診療的價值毋庸置疑。但傳統(tǒng)的病原學(xué)診斷高度依賴于臨床醫(yī)師的經(jīng)驗,根據(jù)患者的臨床表現(xiàn)做出病原體的鑒別診斷,針對可疑的病原體進行檢測,存在檢測周期長、陽性率低、受抗生素使用,特殊病原體難于檢測等因素影響,已經(jīng)不能滿足當(dāng)前臨床需要。 宏基因組二代測序(mNGS)技術(shù)可以快速、無偏倚地同時檢測多種病原體,已廣泛地應(yīng)用于臨床感染性疾病病原檢測,成為助力疑難、危重感染診斷的新方法。

什么是mNGS

mNGS通過對臨床樣本的DNA或RNA進行鳥槍(shotgun)法測序。二代測序(NGS)是一種可同時對數(shù)十萬到數(shù)百萬條DNA分子序列進行讀取的測序技術(shù)。mNGS指對臨床標(biāo)本中的全部生物(人、微生物)基因組進行分析,能夠無偏倚、無偏差地檢測多種病原微生物(病毒、細(xì)菌、真菌及寄生蟲)的一項技術(shù)。

宏基因技術(shù)是把微生物的核酸打斷成核酸片段后進行測序,微生物的序列數(shù)就是檢測到多少個核酸片段屬于該微生物,因此序列數(shù)往往與該病原體的載量正相關(guān)。相對豐度是指該病原體在檢測到的同類微生物中的序列占比,由于細(xì)菌、真菌、病毒和寄生蟲的微生態(tài)特征、臨床意義不同,它們是獨立計算相對豐度的,如某個細(xì)菌的相對豐度是該細(xì)菌在該樣本所有檢出細(xì)菌中所占的百分比。因此相對豐度越高,表示該病原體在標(biāo)本中的占比越高,但不同大類間的微生物相對豐度無法互相比較。基因組覆蓋度是指該微生物核酸序列覆蓋到該微生物整個基因序列的比值,基因組覆蓋度與序列數(shù)有關(guān),序列數(shù)越多,核酸越高,表示該病原體在標(biāo)本中真實存在的可性能越高。相對豐度越高,可信度越高;序列數(shù)越多,檢測結(jié)果越準(zhǔn)確。

mNGS的優(yōu)勢

診斷時間大大縮短免疫抑制患者感染通常病情進展快,機會性感染多,而常規(guī)的微生物培養(yǎng)需要數(shù)日才有結(jié)果,從而延誤診斷。而mNGS最快的24 h內(nèi)即可出結(jié)果,為精準(zhǔn)診斷與治療贏得了時間。

診斷的陽性率提高因為傳統(tǒng)常規(guī)微生物檢測比較容易受到微生物數(shù)量的影響,如抗菌素使用后,細(xì)菌的數(shù)量迅速下降或者死亡。而對于NGS來說,只要有病原體的基因存在,不管是否活菌,都能夠檢測到,大大提高了診斷陽性率。

發(fā)現(xiàn)難以培養(yǎng)的病原微生物mNGS可以檢測到其他傳統(tǒng)手段無法檢出的病原體。常見如肺孢子菌、支原體、衣原體、軍團菌等。肺孢子菌肺炎(PCP)在免疫抑制腎臟病患者合并重癥肺部感染中并不少見,可導(dǎo)致急性呼吸窘迫綜合征,及時診斷和治療是降低病死率的關(guān)鍵。但PCP早期病原學(xué)診斷困難,病原檢出率低,容易延誤診治。我們通過mNGS檢測患者外周血中的病原序列,證實了mNGS可用于PCP的診斷,具有較高的敏感度(94.59%)和特異度(100%),具有無創(chuàng)、簡便、快速的優(yōu)點,大大提高了治療的成功率。

發(fā)現(xiàn)繼往認(rèn)為少見的病原體感染mNGS從基因?qū)用婵梢园l(fā)現(xiàn)更多的繼往認(rèn)為少見的感染。我們近來的臨床工作中先后應(yīng)用mNGS檢測技術(shù)成功診斷馬爾尼菲籃狀菌合并非結(jié)核分枝桿菌、恙蟲病立克次體、鸚鵡熱衣原體及豚鼠耳炎諾卡氏菌等病原體感染,為臨床及時調(diào)整治療提供了極大幫助。

發(fā)現(xiàn)混合感染免疫力功能低下患者易發(fā)生混合感染,而傳統(tǒng)檢測方法很難不出現(xiàn)遺漏。與傳統(tǒng)方法相比,病原mNGS 檢測由于其獨特的機制,具有更廣的微生物檢出譜。我們最近的工作也發(fā)現(xiàn)CKD合并肺孢子菌患者中巨細(xì)胞病毒(CMV)血癥陽性率高達57.7%,其免疫缺陷程度更重,預(yù)后較無CMV血癥者更差。因此,mNGS其對病原微生物幾乎達到“一網(wǎng)打盡”效果,能同時一次性敏感檢出不同類病原體,尤其在細(xì)菌感染合并真菌、病毒、支原體、衣原體或原蟲等感染時更具顯著意義。

如何解讀mNGS報告

mNGS最大優(yōu)勢在于快速精準(zhǔn)、高通量檢測,為早期抗感染治療提供證據(jù)支持,正確的解讀同樣是保證mNGS優(yōu)勢的關(guān)鍵。由于mNGS操作流程復(fù)雜,各個環(huán)節(jié)均易引入污染,干擾檢測結(jié)果,且檢出的病原體無法具體確定是定植菌、背景菌還是致病菌,因此對于測序結(jié)果為陽性的報告應(yīng)根據(jù)患者臨床特點、免疫功能狀態(tài),及輔助檢查結(jié)果系統(tǒng)分析、解讀和驗證。

陽性結(jié)果固然有助于明確感染病原體,陰性結(jié)果亦可用于排除感染性疾病可能。對于在核酸提取過程中破壁困難的微生物,如分枝桿菌屬、諾卡菌屬、真菌(主要包括曲霉菌、毛霉菌、隱球菌屬與雙相真菌)等,即使在檢測報告中讀數(shù)較低,也要考慮其為致病微生物的可能,并采用其他方法驗證。

mNGS作為一種新的檢測手段,拓寬了微生物檢查的途徑和范圍、彌補了常規(guī)檢測手段的一些缺憾。mNGS對腎臟病免疫功能受損不明原因感染,尤其是條件致病病原學(xué)診斷具有更高敏感性,有助于更早識別病原體和指導(dǎo)治療用藥。