石山口水庫水體微生物多樣性研究

林偉，趙良杰，楊治國

（信陽農(nóng)林學(xué)院水產(chǎn)學(xué)院，河南 信陽 464000）

石山口水庫坐落于河南省信陽市東南地區(qū)，水庫最大容量為3.7×109m3，流域面積約306 km2，是以灌溉為主，保證防洪、結(jié)合發(fā)電、以及養(yǎng)殖的丘陵型水庫。水源以靈山?jīng)_河道水為主，年平均徑流量1.392×109m3，年輸出水量0.8×109m3，年平均降水量約為1 120 mm。水庫岸線曲折，支流眾多，沿庫有6 個(gè)鄉(xiāng)、36 個(gè)行政村的農(nóng)田、山林。庫區(qū)周圍土地利用以茶園、林地、耕地、居民用地為主[1]。石山口水庫水體平均深度在9.3 m 左右，利于濾食性魚類花鰱（Aristichthys nobilis）、白 鰱（Hypophthalmichthys molitrix）生長。石山口水庫被私人承包多年，以前有肥水養(yǎng)魚的情況，水體富營養(yǎng)化比較嚴(yán)重。近年來，城市化和工業(yè)化的飛速發(fā)展，人類活動(dòng)、農(nóng)業(yè)、重工業(yè)等產(chǎn)生的垃圾，使得各地的河流、水庫等均受到了不同程度的污染，有機(jī)物富集并滋生大量微生物。微生物是湖泊水生態(tài)系統(tǒng)中的初級(jí)生產(chǎn)者，一般個(gè)體小、數(shù)量多、繁殖速度快、分布范圍廣等，在水體有機(jī)質(zhì)的分解、污染物降解、生態(tài)系統(tǒng)修復(fù)方面均具有重要的作用。微生物對(duì)水體環(huán)境因素的變化極其敏感，所以微生物的群落組成與多樣性常常被用來反映水環(huán)境的變化。因此微生物數(shù)量、組成、多樣性等指標(biāo)常被用作評(píng)價(jià)水質(zhì)的重要生物指標(biāo)。

微生物可以作為環(huán)境現(xiàn)狀指示生物，還可以反過來影響外界水環(huán)境，修復(fù)河流水體生態(tài)，因此，研究微生物群落結(jié)構(gòu)特征具有重要意義[2]。研究微生物多樣性的傳統(tǒng)方法主要是分離培養(yǎng)方法。該方法研究時(shí)間長，很多微生物沒有有效的培養(yǎng)方法，無法進(jìn)行系統(tǒng)研究。宏基因組測序技術(shù)已極為成熟，可以快速分析樣品中所有微生物的種類及豐度。采用宏基因組方法研究石山口水庫水體微生物多樣性，為確定石山口水庫水質(zhì)的優(yōu)劣，對(duì)水體的治理和漁業(yè)養(yǎng)殖模式提供了一系列的數(shù)據(jù)支撐和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)域與樣品采集

根據(jù)《水質(zhì)采樣方案設(shè)計(jì)技術(shù)規(guī)定》的斷面設(shè)置原則，在石山口水庫的上、中、下游選取流急、適中和緩慢處設(shè)三個(gè)采樣區(qū)，7 個(gè)樣品點(diǎn)（圖1）；在水庫兩支流處分別設(shè)置1#和2#兩個(gè)采樣點(diǎn)，壩前設(shè)置3#采樣點(diǎn)。2017 年5 月中旬采樣，1#、2#采樣點(diǎn)深度均為0 m、3 m，分別記作ssk1.0 m、ssk1.3 m、ssk2.0 m、ssk2.3 m，3#采樣點(diǎn)深度分別為0 m、4 m 和8 m，分別記作ssk3.0 m、ssk3.4 m、ssk3.8 m，共計(jì)7 個(gè)水樣。

圖1 石山口水庫采樣點(diǎn)分布Fig.1 Distribution of water sampling sites in Shishankou

1.2 方法

通過Illumina 平臺(tái)對(duì)樣品進(jìn)行高通量測序，實(shí)驗(yàn)流程分為：基因組DNA 的抽提、PCR 擴(kuò)增、熒光定量、構(gòu)建Miseq 文庫和Miseq 測序[3]。

1.2.1 基因組DNA 的抽提

采用Power Soil DNA Kit（Mo Bio Laboratories，Carlsbad，California，美國）提取樣品中的總DNA。量取一定量的水體樣品，按照說明書進(jìn)行DNA 提取，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測提取到的總DNA，并核對(duì)基因組DNA 的濃度與完整性[4]。

1.2.2 PCR 產(chǎn)物擴(kuò)增

以提取水樣的總DNA 為模板，采用細(xì)菌通用引物：正向27F:（5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3'）和反向引物1492R:（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'），擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA 序列。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳分析，然后用離心柱型瓊脂糖凝膠回收試劑盒純化PCR 產(chǎn)物[5]。

1.2.3 熒光定量標(biāo)記

參照電泳初步定量結(jié)果，將PCR 產(chǎn)物通過熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性探針進(jìn)行檢測定量，之后每個(gè)樣品按照特定的測序量要求進(jìn)行相應(yīng)比例的混合。

1.2.4 構(gòu)建Miseq 文庫

對(duì)上面經(jīng)過熒光定量標(biāo)記過的樣品處理，使樣品之間連接成“Y”字形接頭；然后通過磁珠篩選，去除接頭自連片段；先對(duì)篩選后的樣品進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，然后進(jìn)行Miseq 文庫模板的富集；最終由于氫氧化鈉變性，產(chǎn)生單鏈DNA 片段[6]。

1.2.5 Miseq 測序

取一段16S rRNA 基因片段為引物，用PCR 儀對(duì)采取的基因片段進(jìn)行擴(kuò)增[7]。

按照每個(gè)樣品的特定測序量要求，檢測定量擴(kuò)增基因，然后根據(jù)特定比例混合，對(duì)原始序列初步處理，進(jìn)行OTU 聚類（97%相似性可認(rèn)定為同一個(gè)種，初步認(rèn)為一個(gè)OTU 都是屬于一個(gè)種的微生物），選取高質(zhì)量的序列進(jìn)行分析[8]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

將上面分析出來的數(shù)據(jù)繪制成Excel 表格，之后分別計(jì)算出相應(yīng)的Chao 指數(shù)、ACE 指數(shù)、Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)。在以上基礎(chǔ)上運(yùn)用IBM SPSS Statistics 22 軟件對(duì)這些數(shù)據(jù)進(jìn)行物種組成的聚類分析和主成分分析（PCA）等統(tǒng)計(jì)比較分析[9]。

（1）ACE 指數(shù)：用來估計(jì)群落中含有的OTU 數(shù)目的指數(shù)。

（2）Chao 指數(shù)：在生態(tài)學(xué)中一般用來評(píng)估物種的總數(shù)。

（3）Shannon 指數(shù)：即香農(nóng)指數(shù)，一般用來表示樣本的微生物多樣性。

H'=-ΣPi1nPi，式中:Pi為物種i 的個(gè)體數(shù)占總個(gè)體數(shù)的比例，i=1,2,...,S。

（4）Simpson 指數(shù)：即辛普森指數(shù)，一般用來表示樣本的微生物多樣性和均勻度。

D=1-ΣPi2，式中:Pi為物種i 的個(gè)體數(shù)占總個(gè)體數(shù)的比例，i=1,2,...,S。

2 結(jié)果與分析

2.1 微生物群落多樣性指數(shù)分析

利用Illumina 公司線上分析平臺(tái)分析3 個(gè)采樣點(diǎn)水樣中的微生物多樣性指數(shù)，包括：分類單元數(shù)、Chao 指數(shù)、ACE 指數(shù)、香農(nóng)指數(shù)（Shannon index）和辛普森指數(shù)（Simpson index）等[10]（表1，圖2～圖4）。水體中分類單元數(shù)介于547～666 之間，Chao 指數(shù)介于615.4789～731.6557，ACE指數(shù)介于614.5390～726.0438，說明樣品豐度較大。香農(nóng)指數(shù)介于5.018～5.167 之間，說明樣品的多樣性較高，物種豐富。辛普森指數(shù)介于0.0119～0.0191 之間，說明樣品的均勻度較差。

表1 石山口水庫水中微生物多樣性指數(shù)分析Tab.1 Analysis of microbial diversity indices in water in Shishankou Reservoir

圖2 石山口水庫微生物分類單元數(shù)、Chao 指數(shù)、ACE 指數(shù)分析Fig.2 Analysis of the number of microbial taxa,Chao index and ACE index in Shishankou Reservoir

圖3 石山口水庫微生物Shannon 指數(shù)分析Fig.3 Analysis of microbial Shannon index of in Shishankou Reservoir

圖4 石山口水庫微生物Simpson 指數(shù)分析Fig.4 Analysis of microbial Simpson index in Shishankou Reservoir

2.2 微生物群落組成

由圖5 可知，石山口水庫水中有50%～70%左右未被鑒定出來的微生物種群，在已知的微生物種群中優(yōu)勢種有：念珠菌（Candidatus-Pelagibacter,12.10%～17.50%）、硫單胞菌屬（Thiomonas,0.69%～1.21%）、軍團(tuán)桿菌屬（Legionella,0.55%～0.87%）、擬桿菌門（Terrimonas,0.42%～0.93%）、桿菌（Paucimonas,0.50%～0.83%）、多核桿菌屬（Polynucleobacter,0.35%～0.61%）、發(fā)光桿菌屬（Ilumatobacter 0.25%～0.51%）、甲基單胞菌屬（Methylocystis,0.21%～0.35%）、黃桿菌屬（Flavobacterium,0.13%～0.24%）、分枝桿菌屬（Sediminibacterium,0.08%～0.16%）、微小桿菌屬（Exiguobacterium,0.00%～0.62%）等。

圖5 石山口水庫水體中主要優(yōu)勢菌門群落結(jié)構(gòu)組成Fig.5 The main bacterial dominant community structure composition in waters of Shishankou Reservoir at phylum level

2.3 微生物群落的空間分布

聚類樹狀圖（圖6）直接顯示了石山口水庫水體7 個(gè)樣品間微生物群落多樣性的相似性。1#采樣點(diǎn)的0 m 處與其他采樣點(diǎn)差異較大。2#采樣點(diǎn)的0 m、3 m 處歸聚為一類，說明這兩處采樣點(diǎn)微生物群落組成結(jié)構(gòu)較為相似。3#采樣點(diǎn)的0 m、4 m 處歸聚為一類，說明這兩處微生物群落組成結(jié)構(gòu)較為相似。1#采樣點(diǎn)的3 m 處與3#采樣點(diǎn)的8 m 處歸聚為一類，微生物群落組成結(jié)構(gòu)較為相似?？傊?，石山口水庫不同層次水體的微生物群落結(jié)構(gòu)組成差異較小。

圖6 石山口水庫微生物聚類樹狀圖Fig.6 Microbial clustering dendrogram in Shishankou Reservoir

圖7 為石山口水庫水體微生物PCA 分析，圖中的點(diǎn)代表各樣品，樣品間相似度越低在空間距離上越遠(yuǎn)，反之，樣品間的相似度越高，在圖上的距離越近。由圖7 可知，1#采樣點(diǎn)兩處距離較大，即相似度較低。2#、3#采樣點(diǎn)的0 m、4 m 處距離較近，即這幾處的相似度較高。而3#采樣點(diǎn)的8 m 處與其他幾處距離都較遠(yuǎn)，則證明此處與其他幾處相似度極低，微生物群落結(jié)構(gòu)差異較大。

圖7 石山口水庫微生物PCA 分析Fig.7 Microbial PCA analysis in Shishankou Reservoir

3 討論

3.1 石山口水庫不同方位微生物群落結(jié)構(gòu)特征

本研究中，3#采樣點(diǎn)8 m 處的Shannon 指數(shù)高于其他幾個(gè)采樣點(diǎn)，表明3#采樣點(diǎn)8 m 處的微生物群落結(jié)構(gòu)與其他幾個(gè)采樣點(diǎn)差異較大。這可能是水體深度較大，滿足厭氧微生物類群的生存環(huán)境條件。石山口水庫平均水深為9.3 m，而3#采樣點(diǎn)的8 m 處距離水庫底部較近，有機(jī)物沉積在水體底部，致有機(jī)物含量較高，故而3#采樣點(diǎn)8 m 處的微生物多樣性相比于其他采樣點(diǎn)更加豐富。石山口水庫水體中主要優(yōu)勢菌群落結(jié)構(gòu)組成表明，微生物群落結(jié)構(gòu)組成大都相似。因此石山口水庫壩前水體與其他支流處微生物物種組成相似。主成分分析圖表明，除了3#采樣點(diǎn)水體深度較大，與其他樣品距離較大，差異較大，其他采樣點(diǎn)距離都較近，微生物群落結(jié)構(gòu)大都也一樣。

3.2 不同微生物群落結(jié)構(gòu)對(duì)漁業(yè)養(yǎng)殖模式的影響

本研究中，大部分優(yōu)勢菌種常見于一些富營養(yǎng)化水體中，說明石山口水庫有富營養(yǎng)化趨勢。水體中微生物群落結(jié)構(gòu)組成和多樣性并不只與水體營養(yǎng)狀況有關(guān)，水中浮游藻類增多，也會(huì)極大影響濾食性魚類捕食作用。實(shí)踐表明：在水中適當(dāng)增加鰱的數(shù)量，降低鳙的數(shù)量會(huì)有利影響水質(zhì)，使水體浮游動(dòng)物數(shù)量增加，浮游植物數(shù)量減少，有效控制水體富營養(yǎng)化，阻止其進(jìn)一步惡化。

私人承包使石山口水庫投放魚體質(zhì)量為1.5～2.0 kg 的大規(guī)格鰱鳙。魚規(guī)格越大、越成熟，漁業(yè)模式就越穩(wěn)定，水質(zhì)狀況會(huì)隨著漁業(yè)狀況而變化，水質(zhì)又會(huì)影響細(xì)菌狀況。用水體各理化指標(biāo)檢測評(píng)價(jià)以及水中生物指標(biāo)檢測評(píng)價(jià)相結(jié)合的方法發(fā)現(xiàn)，水體富營養(yǎng)化會(huì)嚴(yán)重破壞水體微生物群落結(jié)構(gòu)，擾亂微生物群落生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性。

石山口水庫屬于淮河流域，而南灣水庫位于淮河支流浉河上，故而其漁業(yè)模式相近。李林春[12]在研究南灣水庫時(shí)通過調(diào)節(jié)鰱鳙的放養(yǎng)比例發(fā)現(xiàn)，適當(dāng)增加鰱鳙比例雖然不能完全改變水庫的富營養(yǎng)化狀態(tài)，但卻可以使水質(zhì)得到一定的改善。所以通過調(diào)整漁業(yè)養(yǎng)殖模式可以在一定程度上改善水體的營養(yǎng)狀況。

目前，生態(tài)修復(fù)水體富營養(yǎng)化的對(duì)策很多，但都很難起到可觀的成效，所以就極其缺乏一種效果好、價(jià)格低廉、又能全面推廣的生態(tài)治理方法。研究表明，發(fā)展一種健康生態(tài)養(yǎng)殖模式，應(yīng)適當(dāng)增加鰱鳙放養(yǎng)比例，控制兇猛肉食性魚類，是一種保護(hù)水質(zhì)，實(shí)現(xiàn)水庫漁業(yè)高效可持續(xù)發(fā)展的一種有效途徑[13]。