基于HPLC指紋圖譜對(duì)不同基原茵陳的區(qū)分及各品種茵陳質(zhì)量評(píng)價(jià)

周仔莉，賈文江，李 鵬，陳雪琴，蘇陽(yáng)陽(yáng)，郭宏波

（1.商洛市藥品檢驗(yàn)所，陜西 商洛 726000；2.西北農(nóng)林科技大學(xué) 化學(xué)與藥學(xué)院，陜西 楊凌 712100）

2020年版《中國(guó)藥典》收錄茵陳為菊科植物濱蒿Artemisia scopariaWaldst.et Kit.或茵陳蒿Artemisia capillarisThunb.的干燥地上部分，其中，春季采收的習(xí)稱(chēng)“綿茵陳”，秋季釆割的稱(chēng)“花茵陳”。茵陳苦微寒而清利，并兼梳理，入脾、胃與肝、膽經(jīng)，善清利濕熱而退黃，為治濕熱黃疸之要藥，用于治療黃疸尿少、濕溫暑濕、濕瘡瘙癢等癥[1-2]。

茵陳含有有機(jī)酸類(lèi)、香豆素類(lèi)、揮發(fā)油類(lèi)、黃酮類(lèi)、萜類(lèi)等化合物以及豐富的微量元素，具有廣泛的藥理作用[3-5]。茵陳復(fù)方制劑種類(lèi)眾多，僅2020年版《中國(guó)藥典》（一部）就收錄了十余種，如：茵梔黃系列、茵膽平肝膠囊、茵山蓮顆粒、茵芪肝復(fù)顆粒等。因茵陳有2種基原且目前各基原茵陳標(biāo)準(zhǔn)僅用單一成分作為指標(biāo)性成分，缺乏全面的質(zhì)量評(píng)價(jià)和監(jiān)督體系；現(xiàn)有文獻(xiàn)對(duì)茵陳及茵陳標(biāo)準(zhǔn)湯劑水提物[6-8]、醇提物[9-10]、揮發(fā)油[11]有少量研究，但尚無(wú)對(duì)濱蒿和茵陳蒿二者成分及質(zhì)量差異的研究，并且鮮有對(duì)不同基原茵陳藥材使用指導(dǎo)原則的報(bào)道。本研究同時(shí)建立濱蒿和茵陳蒿HPLC指紋圖譜，全面比較濱蒿和茵陳蒿兩種基原茵陳所含化學(xué)物質(zhì)種類(lèi)及含量的差異，為茵陳制劑原料的選擇及茵陳飲片的質(zhì)量控制提供指導(dǎo)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters e2695型高效液相色譜儀（Empower色譜工作站，美國(guó)Waters公司）；Agilent 1260Ⅱ型高效液相色譜儀（DAD檢測(cè)器，美國(guó)安捷倫科技公司）；SQP型電子分析天平（北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司，精度：0.1 mg）；KQ-250DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率：250 W，頻率：40 kHz）；Hitech型純水機(jī)（上海和泰儀器公司）；FW-200D型高速萬(wàn)能粉碎機(jī)（天津鑫博得儀器有限公司）；藥篩（湖南省常德粒度分析儀器廠）等。

1.2 試藥

沒(méi)食子酸（批號(hào)：110831-201906，純度：96.5%）、原兒茶酸（批號(hào)：110809-201906，純度：97.7%）、綠原酸（批號(hào)：110753-202018，純度：96.1%）、香草酸（批號(hào)：110776-201503，純度：99.8%）、咖啡酸（批號(hào)：110885-201703，純度：99.7%）、阿魏酸（批號(hào)：110773-201915，純度：99.4%）、蘆?。ㄅ?hào)：100080-202012，純度：91.6%）、金絲桃苷（批號(hào)：111521-201809，純度：94.9%）、丁香酚（批號(hào)：110725-201917，純度：100%）、3, 5-O-二咖啡?？鼘幩幔ㄅ?hào)：111782-201807，純度：94.3%）、濱蒿內(nèi)酯（批號(hào)：111511-201704，純度：99.9%）、濱蒿對(duì)照藥材（批號(hào)：120950-201608、120950-201007）、茵陳蒿對(duì)照藥材（批號(hào)：121555-201602、121555-201107）均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；甲醇（分析純，天津市天力化學(xué)試劑有限公司）、乙醇（分析純，成都市科隆化學(xué)品有限公司）、色譜乙腈 ［賽默飛世爾科技 （中國(guó)）有限公司］，超純水等。

本研究分別從不同產(chǎn)地收集了16批次茵陳藥材，樣品經(jīng)西北農(nóng)林科技大學(xué)郭宏波教授鑒定為濱蒿Artemisia scopariaWaldst.et Kit.或茵陳蒿Artemisia capillarisThunb.的干燥地上部分，藥材信息詳見(jiàn)表1。

表1 茵陳樣品信息Tab. 1 Information of Artemisia Scoparia Herba

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Welch Ultimate xB C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相：乙腈（A）-5 mL/L磷酸水溶液（B），梯度洗脫：0 ～ 30 min，10%→15%A；30 ～ 45 min，15%→30%A；45 ～ 60 min，30%→10%A；60 ～65 min，10%A；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：220 nm和360 nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣體積：20 μL。

2.2 供試品溶液制備

精密稱(chēng)取各批次茵陳樣品及對(duì)照藥材0.5 g置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，稱(chēng)定初始重量，室溫超聲提取30 min（功率：250 W，頻率：40 kHz），冷卻后用70%甲醇補(bǔ)足失重，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.3 對(duì)照品溶液制備

分別精密稱(chēng)取各對(duì)照品適量，加甲醇制成含沒(méi)食子酸、原兒茶酸、綠原酸、香草酸、咖啡酸、阿魏酸、蘆丁、金絲桃苷、丁香酚、3, 5-O-二咖啡?？鼘幩?、濱蒿內(nèi)酯質(zhì)量濃度分別為0.80、2.19、254.67、2.04、112.16、3.25、12.05、19.36、600.00、188.60、10.49 μg/mL混合對(duì)照品溶液。

2.4 HPLC指紋圖譜的建立及相似度評(píng)價(jià)

2.4.1 精密度試驗(yàn) 精密吸取濱蒿對(duì)照藥材溶液，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，以5號(hào)峰（綠原酸）為參照峰，計(jì)算各共有峰相對(duì)峰面積RSD在0.27% ～ 1.91%，表明該方法精密性良好。

2.4.2 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱(chēng)取濱蒿對(duì)照藥材（批號(hào)：120950-201608）6份，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以5號(hào)峰（綠原酸）為參照峰，計(jì)算各共有峰相對(duì)峰面積RSD在0.66% ～ 2.51%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取濱蒿對(duì)照藥材溶液，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件，分別在0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣測(cè)定，以5號(hào)峰（綠原酸）為參照峰，計(jì)算各共有峰相對(duì)峰面積的RSD在0.35% ～ 2.18%，表明該溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.4 濱蒿及茵陳蒿指紋圖譜相似度評(píng)價(jià) 按照“2.1”項(xiàng)下的色譜條件及“2.2”項(xiàng)下供試品制備方法，測(cè)定4批次對(duì)照藥材及16批次茵陳的指紋圖譜。分別將4批次對(duì)照藥材及16批次樣品在不同波長(zhǎng)（220 nm和360 nm）測(cè)定的HPLC指紋圖譜導(dǎo)入“中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）”，以S1為參考，設(shè)定時(shí)間窗寬度為0.01，利用平均數(shù)法，選擇多點(diǎn)校正、自由匹配，建立2種基原茵陳對(duì)照指紋圖譜（見(jiàn)圖1）及16批次茵陳藥材的HPLC指紋圖譜疊加圖（見(jiàn)圖2A、2B），通過(guò)指紋圖譜比較，根據(jù)濱蒿對(duì)照藥材和茵陳蒿對(duì)照藥材圖譜標(biāo)定共有峰23個(gè)，已知化合物11個(gè)，即峰1、3、5、7、8、13、16、17、19、21、22分別為沒(méi)食子酸、原兒茶酸、綠原酸、香草酸、咖啡酸、蘆丁、金絲桃苷、阿魏酸、丁香酚、3,5-O-二咖啡?？鼘幩帷I蒿內(nèi)酯；根據(jù)已有相關(guān)研究[12-13]推測(cè)出峰2、4、6、9、10、18、20、23分別為1-咖啡?？鼘幩?、新綠原酸、隱綠原酸、對(duì)羥基苯乙酮、1,3-二咖啡?？鼘幩帷愰纹ぼ?、3,4-二咖啡酰奎寧酸、4,5-O-二咖啡酰奎寧酸，尚有4個(gè)未知化合物有待進(jìn)一步研究，初步推斷峰11、12為濱蒿特有峰，由圖譜可得出不同基原茵陳差異較大，且在220 nm更適合于茵陳各類(lèi)有機(jī)酸的檢出，在360 nm處特異峰（峰11、峰12）更加明顯，構(gòu)建的指紋圖譜可以很好地區(qū)分2種基原的茵陳，根據(jù)圖譜可判定樣品S1、S5、S7、S8、S14、S16為濱蒿，S2、S3、S4、S6、S9、S10、S11、S12、S13、S15為茵陳蒿。

圖1 混合對(duì)照品及2種基原茵陳對(duì)照指紋圖譜（360 nm）Fig. 1 Chromatograms of mixed reference substances and fingerprints of 2 origins of Artemisia Scoparia Herba（360 nm）

圖2 茵陳樣品HPLC指紋圖譜Fig. 2 Overlay of HPLC fingerprints of Artemisia Scoparia Herba samples

分別以共有模式峰和濱蒿對(duì)照藥材圖譜作為參照?qǐng)D譜，得到16批次茵陳藥材樣品與共有模式色譜峰和濱蒿對(duì)照藥材圖譜相似度分別為 0.694 ～ 0.951、0.872 ～ 0.989，見(jiàn)表2。

表2 相似度分析結(jié)果Tab. 2 Similarity evaluation results of 20 batches of Artemisia Scoparia Herba

2.4.5 基于化學(xué)模式對(duì)茵陳藥材的分析 應(yīng)用SPSS 21.0軟件，以指紋圖譜23個(gè)共有峰的峰面積為變量，對(duì)16批次茵陳樣品進(jìn)行聚類(lèi)分析[14-15]，結(jié)果見(jiàn)圖3。當(dāng)判別距離大于10時(shí)，樣品可以分為3類(lèi)，S1、S5、S14分為一類(lèi)，S3、S7、S8、S16歸為一類(lèi)，S2、S4、S6、S9、S10、S11、S12、S13、S15歸為一類(lèi)，與相似度評(píng)價(jià)結(jié)論基本一致。

圖3 16批茵陳樣品聚類(lèi)分析樹(shù)狀圖Fig. 3 Dendrogram of cluster analysis of 16 batches of Artemisia Scoparia Herba samples

為了進(jìn)一步分析茵陳樣品間及不同基原茵陳的差異，將指紋圖譜得到的23個(gè)共有峰峰面積數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA 14.1軟件，基于PCA分析，進(jìn)一步進(jìn)行OPLS-DA判別分析，得分圖見(jiàn)圖4，可得知16批茵陳樣品可大致分為兩組，即S1、S5、S7、S8、S14、S16歸 為 一 類(lèi)，S2、S3、S4、S6、S9、S10、S11、S12、S13、S15歸為一類(lèi)，正交偏最小二乘判別分析與聚類(lèi)分析結(jié)果一致。

圖4 16批茵陳樣品 OPLS-DA 散點(diǎn)圖Fig. 4 Scatter diagram of OPLS-DA of 16 batches of Artemisia Scoparia Herba samples

提取共有峰峰面積作為變量的權(quán)重值（VIP）進(jìn)行分析，以VIP＞1作為對(duì)整體模型的貢獻(xiàn)度高于平均水平值為標(biāo)準(zhǔn)，篩選出了5個(gè)對(duì)樣本分類(lèi)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異標(biāo)志物，即綠原酸、3,5-O-二咖啡?？鼘幩?、4,5-O-二咖啡?？鼘幩?、新綠原酸、金絲桃苷，VIP值分別為3.05、2.38、1.39、1.35、1.08（見(jiàn)圖5），這些化學(xué)成分對(duì)不同基原樣品分類(lèi)具有顯著影響，是區(qū)分濱蒿和茵陳蒿的主要標(biāo)志性成分。

圖5 茵陳樣品各成分VIP圖Fig. 5 VIP diagram of components in Artemisia Scoparia Herba samples

2.5 不同基原茵陳含量分析

2.5.1 線(xiàn)性關(guān)系考察 分別精密吸取“2.3”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液0.5、1、2、5、15、20μL，注入色譜儀中，按照擬定色譜條件進(jìn)行分析。以對(duì)照品 質(zhì) 量 濃 度（μg/mL）（X1，X2，X3，X4，X5，X6，X7，X8，X9，X10，X11）對(duì) 峰 面 積（Y1，Y2，Y3，Y4，Y5，Y6，Y7，Y8，Y9，Y10，Y11）進(jìn)行線(xiàn)性回歸，結(jié)果見(jiàn)表3。說(shuō)明11個(gè)組分在擬定色譜條件下，具有較好的線(xiàn)性關(guān)系及檢測(cè)靈敏度。

表3 成分線(xiàn)性關(guān)系Tab. 3 Linear relashionship of components

2.5.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取混合對(duì)照品溶液10μL，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，結(jié)果沒(méi)食子酸、原兒茶酸、綠原酸、香草酸、咖啡酸、蘆丁、金絲桃苷、阿魏酸、丁香酚、3, 5-O-二咖啡酰奎寧酸、濱蒿內(nèi)酯峰面積的RSD均小于1.5%，表明該方法精密度良好。

2.5.3 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱(chēng)取濱蒿對(duì)照藥材（批號(hào)：120950-201608）6份，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果沒(méi)食子酸、原兒茶酸、綠原酸、香草酸、咖啡酸、蘆丁、金絲桃苷、阿魏酸、丁香酚、3,5-O-二咖啡酰奎寧酸、濱蒿內(nèi)酯峰面積的RSD均小于1.5%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一濱蒿對(duì)照藥材溶液（批號(hào)：120950-201608），按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件，分別在0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果沒(méi)食子酸、原兒茶酸、綠原酸、香草酸、咖啡酸、蘆丁、金絲桃苷、阿魏酸、丁香酚、3, 5-O-二咖啡酰奎寧酸、濱蒿內(nèi)酯峰面積的RSD均小于1.5%，表明該溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.5 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的S6樣品6份 ，精密稱(chēng)取0.5 g，分別加入沒(méi)食子酸、原兒茶酸、綠原酸、香草酸、咖啡酸、蘆丁、金絲桃苷、阿魏酸、丁香酚、3,5-O-二咖啡?？鼘幩?、濱蒿內(nèi)酯對(duì)照品適量，按照“2.2”項(xiàng)下的方法平行制備6份供試品溶液，分別進(jìn)樣，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 茵陳11個(gè)共有成分加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n = 6）Tab. 4 The recoveries of 11 common components in Artemisia Scoparia Herba（n = 6）

2.5.6 樣品測(cè)定 分別取16批次樣品，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖，采用外標(biāo)法分別對(duì)樣品中的11種共有成分含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 茵陳11個(gè)共有成分含量測(cè)定結(jié)果（n = 3）Tab. 5 Result of determination of 11 components in Artemisia Scoparia Herba（n = 3）

3 討論

3.1 提取溶劑及提取方法的選擇

本研究采用DAD檢測(cè)器對(duì)樣品進(jìn)行全波長(zhǎng)210 ～800 nm掃描，發(fā)現(xiàn)茵陳樣品中所含綠原酸、咖啡酸等有機(jī)酸在220 nm附近有很強(qiáng)吸收，濱蒿特異峰（峰11、峰12）在360 nm附近有較強(qiáng)吸收及較好的分離，故而最終確定了雙波長(zhǎng)測(cè)定；對(duì)比了茵陳采用不同溶劑超聲提取圖譜，發(fā)現(xiàn)茵陳70%甲醇提取液對(duì)各種有機(jī)酸類(lèi)及黃酮類(lèi)提取效果好；研究中用70%甲醇作為提取溶劑，對(duì)比濱蒿對(duì)照藥材回流和超聲提取的色譜圖，發(fā)現(xiàn)兩種處理方式對(duì)目標(biāo)成分影響差異不大，最終選擇了操作簡(jiǎn)便的超聲提取方法。

3.2 不同基原茵陳的區(qū)別

茵陳藥材不同基原品種在性狀上差異不大，僅能從氣味等細(xì)微的差別上進(jìn)行判定，而本研究構(gòu)建的方法可以作為茵陳基原鑒定除性狀之外的一種有效的補(bǔ)充方法。結(jié)合指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)、聚類(lèi)分析、PCA分析、正交偏最小二乘判別以及含量測(cè)定結(jié)果分析所得結(jié)論與本研究中藥材基原的鑒定結(jié)論是一致的，即S1、S5、S7、S8、S14、S16被判定為濱蒿，S2、S3、S4、S6、S9、S10、S11、S12、S13、S15被判定為茵陳蒿；從樣品S1、S5、S7、S8、S14、S16中檢測(cè)到了峰11、峰12，而S2、S3、S4、S6、S9、S10、S11、S12、S13、S15未檢測(cè)到，與濱蒿對(duì)照藥材及茵陳蒿對(duì)照藥材指紋圖譜一致，進(jìn)一步證明了此差異是真實(shí)存在的，未受其它干擾因素影響。

研究中共收集到了6個(gè)省的16批次茵陳樣品及中國(guó)食品藥品檢定研究院4批次對(duì)照藥材，發(fā)現(xiàn)不同基原茵陳共有成分含量差異較為明顯，茵陳蒿中金絲桃苷、蘆丁平均含量是濱蒿的2倍 ～ 6倍，綠原酸、阿魏酸、香草酸、咖啡酸等有機(jī)酸平均含量均高于濱蒿，各成分加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果顯示回收率均在98% ～100%范圍，RSD均小于1.5%，表明含量測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確可靠，故可作為茵陳藥材不同基原區(qū)分的一個(gè)量化指標(biāo)。S1樣品中23個(gè)共有峰峰面積整體偏小，結(jié)合性狀及含量分析，推測(cè)可能是采收貯存時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，造成所含成分整體降低，但當(dāng)增加取樣量或進(jìn)樣體積時(shí)，峰11、12峰面積成比例增大，繼而驗(yàn)證峰11、12也為S1樣品的特征峰。通過(guò)性狀觀察發(fā)現(xiàn)S3樣品老莖較多，猜測(cè)是春季采收較晚或是秋季采收，檢測(cè)到濱蒿內(nèi)酯成分積累較多，與相關(guān)文獻(xiàn)[16] “綿茵陳”幾乎不含濱蒿內(nèi)酯及《中國(guó)藥典》收錄“花茵陳”以濱蒿內(nèi)酯為指標(biāo)性成分相一致。目前尚無(wú)有關(guān)兩種基原的茵陳品種比較研究，有關(guān)濱蒿特有的2種差異成分具體化學(xué)結(jié)構(gòu)，需要進(jìn)一步確定。

4 結(jié)論

本研究成功構(gòu)建了濱蒿與茵陳蒿的HPLC指紋圖譜，可將兩種基原茵陳進(jìn)行有效區(qū)分，綜合指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)的結(jié)果與聚類(lèi)分析、共有化學(xué)成分PCA分析、OPLS-DA綜合分析結(jié)果，均可明確將不同基原茵陳分為濱蒿和茵陳蒿，且結(jié)論一致。根據(jù)PCA分析可確定綠原酸、3, 5-O-二咖啡?？鼘幩?、4,5-O-二咖啡?？鼘幩?、新綠原酸、金絲桃苷5種成分為茵陳藥材的主要質(zhì)量標(biāo)志性成分，不同基原的茵陳含量差異明顯，茵陳蒿中各成分平均含量明顯高于濱蒿。結(jié)合相似度評(píng)價(jià)、指紋圖譜分析研究及多成分同時(shí)測(cè)定協(xié)同多指標(biāo)定量評(píng)價(jià)不僅為茵陳的質(zhì)量控制提供優(yōu)化方案，同時(shí)也為茵陳藥材兩種不同基原（濱蒿、茵陳蒿）的特異性、差異性研究提供了科學(xué)依據(jù)。