基于高通量測(cè)序技術(shù)分析瓶裝泉水中真菌生物多樣性研究

王菁華，劉 威，李月興，郭新明

(黑龍江省科學(xué)院自然與生態(tài)研究所，哈爾濱 150040)

真菌是異養(yǎng)類真核微生物的一種，主要包括單細(xì)胞酵母和多細(xì)胞絲狀真菌兩大類[1]，其中絲狀真菌常見(jiàn)于水源水體中，能夠在適宜的環(huán)境條件下繁殖，并借助流水進(jìn)行傳播。如果真菌以水為媒介進(jìn)入水處理和供水管道，極易附著在管道表面、接口處，形成生物膜或懸浮物長(zhǎng)期生存并繁殖，導(dǎo)致水體污染，并通過(guò)生產(chǎn)環(huán)節(jié)污染瓶裝水，尤其是絲狀真菌肉眼能夠觀察到，形成沉淀，影響產(chǎn)品感官，甚至產(chǎn)生毒素對(duì)人體造成危害[2-6]。真菌具有廣泛性，很多企業(yè)的生產(chǎn)、貯存及廠房車間都存在真菌污染的潛在隱患[7]。真菌孢子繁殖可引發(fā)包裝物、墻壁等霉變，在瓶裝水中產(chǎn)生絮狀或絲狀沉淀，導(dǎo)致感官指標(biāo)不合格，存在安全隱患，造成企業(yè)經(jīng)濟(jì)損失[8-10]。

有關(guān)真菌在水中的生長(zhǎng)繁殖研究主要集中在天然水體方面，瓶裝水的相關(guān)研究較少。徐向前[11]對(duì)地下水中絲狀真菌生長(zhǎng)繁殖特性及二氧化氯滅火機(jī)制進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，水質(zhì)指標(biāo)中，pH值、碳氮比及溫度是影響其活性的主要因素，而無(wú)機(jī)離子鐵錳濃度對(duì)其影響較小。韓琳等[12]對(duì)瓶裝薄荷水生產(chǎn)過(guò)程中的霉菌污染進(jìn)行檢測(cè)分析發(fā)現(xiàn)，霉菌類型并非全部是水生霉菌，導(dǎo)致這種問(wèn)題發(fā)生的原因很可能與環(huán)境、包裝物污染有關(guān)。Hageskal 等[13-14]研究發(fā)現(xiàn)，在地表水中，真菌能夠大量繁殖且速度快，多樣性程度高，這主要與地表水的水質(zhì)尤其是有機(jī)物含量密切相關(guān)，同時(shí)無(wú)機(jī)鈣離子也是影響真菌繁殖的重要因素之一。

高通量測(cè)序分析技術(shù)是目前應(yīng)用較為廣泛的一種微生物分析手段，可有效對(duì)樣本進(jìn)行真菌菌群的多樣性分析[15]。真菌在水體中的繁殖研究尤其是在瓶裝水中的污染并未引起足夠的重視，本研究對(duì)市售的不同產(chǎn)區(qū)的瓶裝泉水中的真菌菌落多樣性進(jìn)行分析，為掌握真菌分布規(guī)律和產(chǎn)品質(zhì)量控制技術(shù)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

瓶裝水樣品：分別采集自黑龍江省5個(gè)地區(qū)的市售瓶裝水。1號(hào)樣品采集自哈爾濱，2號(hào)樣品采集自五大連池，3號(hào)樣品采集自克東，4號(hào)樣品采集自北安，5號(hào)樣品采集自大興安嶺。

試劑：E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit(美國(guó)Omega生物科技有限公司生產(chǎn))，Qubit3.0 DNA檢測(cè)試劑盒(美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司生產(chǎn))，10105ES03 2×Hieff? Robust PCR Master Mix(翌升生物科技(上海)股份有限公司生產(chǎn))。

1.2 儀器與設(shè)備

DYCZ-21電泳儀(北京市六一儀器廠生產(chǎn))，F(xiàn)R-1000凝膠成像系統(tǒng)(上海復(fù)日科技有限公司生產(chǎn))，Q32866 Qubit3.0熒光計(jì)(英杰生命技術(shù)有限公司生產(chǎn))，A00582 Illuminate MiSeq PE300測(cè)序儀(生工生物工程(上海)股份有限公司生產(chǎn))。

1.3 方法

1.3.1 樣品預(yù)處理

將采集的水樣5 000 mL進(jìn)行抽濾，抽濾膜選擇孔徑0.45 μm。將水樣濃縮到抽濾膜上，按照水體基因組DNA提取試劑盒操作說(shuō)明提取樣品DNA。每次抽濾所需水樣用量5 L，單個(gè)樣品需要重復(fù)提取3次DNA。將提取的DNA樣本進(jìn)行充分混合，再取1份進(jìn)一步檢測(cè)。

1.3.2 Illumina MiSeq高通量測(cè)序

上述制得的DNA樣本經(jīng)檢測(cè)合格后作為模板擴(kuò)增18SV4區(qū)，擴(kuò)增引物為18SV4F(GGCAAGTCTGGTGCCAG)和18SV4R(ACGGTATCTRATCRTCTTCG)進(jìn)行第一輪擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系(30 μL)：2×Hieff?Robust PCR Master Mix 15 μL，Bar-PCR primer F 1 μL，Primer R 1 μL，PCR products 10～20 ng，H2O 9～12 μL。使用移液器輕輕吹打或震蕩混勻并短暫離心，將反應(yīng)液離心至管底。PCR反應(yīng)體系條件：94℃ 3 min、94℃ 30 s、45℃ 20 s、65℃ 30 s、94℃ 20 s、55℃ 20 s、72℃ 30 s、72℃ 5 min、10℃循環(huán)。之后引入Illumina橋式PCR兼容引物進(jìn)行第二輪擴(kuò)增，體系條件(30 μL)：2×Hieff?Robust PCR Master Mix 15 μL，Primer F 1 μL，Index-PCR Primer R 1 μL，PCR products 20～30 ng，H2O 9～12 μL。使用移液器輕輕吹打或震蕩混勻并短暫離心，將反應(yīng)液離心至管底。將PCR管置于PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件：95℃ 3 min、94℃ 20 s、55℃ 20 s、72℃ 30 s、72℃ 5 min、10℃循環(huán)。利用IlluminaMiSeqTM/HiseqTM測(cè)序平臺(tái)，對(duì)真菌18SV4區(qū)基因序列進(jìn)行測(cè)序。利用USEARCH，將序列按97%相似度聚類為可操作分類單元(operational taxonomic unit，OTU)。利用基本局部比對(duì)搜索工具(basic local alignment search tool，BLAST)，在Silva數(shù)據(jù)庫(kù)(https：//www.arb-silva.de/)對(duì)真菌序列進(jìn)行分類注釋，獲得有效的OTU分類學(xué)信息。

1.3.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)分析主要基于R語(yǔ)言，對(duì)其進(jìn)行分析獲得真菌門、綱、目、科、屬的組成情況，再利用vegan包對(duì)主坐標(biāo)(pricipal coordinates analysis, PCoA)進(jìn)行分析，從而獲得不同地區(qū)瓶裝泉水樣本中的真菌分布特征。

2 結(jié)果與分析

2.1 多樣性分析

2.1.1 Alpha多樣性分析

5份瓶裝泉水樣品的真菌18SV4區(qū)測(cè)序共獲得121 766條真菌序列，按照97%相似度歸類并進(jìn)行Alpha多樣性分析，可以反映微生物群落的豐度和多樣性，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 5份瓶裝泉水樣品真菌菌群α-多樣性指數(shù)統(tǒng)計(jì)表Tab.1 Statistical table of α-diversity index of fungal flora in 5 bottled spring water samples

α多樣性指數(shù)主要對(duì)單個(gè)樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，再以統(tǒng)計(jì)學(xué)指數(shù)反映微生物群落的多樣性和物種豐度。由表1數(shù)據(jù)可知，5份天然瓶裝水樣品累積獲得179個(gè)OTU，樣品3的OTU數(shù)最高，為57；樣品4的OTU數(shù)最低，為15。Chao指數(shù)常用來(lái)估計(jì)物種總數(shù)、指示菌群豐度，與物種豐度成正比，5個(gè)樣品的豐度最高為57.0，最低為15.0。Shannon指數(shù)從均勻度和豐富度兩方面來(lái)體現(xiàn)菌群多樣性，數(shù)值越大多樣性越高，測(cè)試樣品的Shannon指數(shù)1號(hào)最高，為3.34；3號(hào)最低，僅為1.04。Coverage指數(shù)常用作反映測(cè)序群落的覆蓋率，數(shù)值越高，則樣本中序列沒(méi)有被測(cè)出的概率越低。5份樣品的Coverage均為1.0，說(shuō)明測(cè)序結(jié)果能夠較好地反映樣品中真菌的情況，所有提供的樣本中真菌的物種信息基本全被覆蓋。通過(guò)以上數(shù)據(jù)分析表明，不同產(chǎn)地的瓶裝泉水中，真菌菌群多樣性存在較大差異，這可能是生產(chǎn)工藝流程對(duì)水質(zhì)處理能力和條件差異導(dǎo)致的，物種多樣性越高，生產(chǎn)工藝對(duì)水質(zhì)的作用越小，需加強(qiáng)對(duì)水質(zhì)處理工藝的調(diào)整。

2.1.2 Beta多樣性分析

PCoA(principal co-ordinates analysis)是一種研究數(shù)據(jù)相似性或差異性的可視化方法，通過(guò)一系列的特征值和特征向量進(jìn)行排序后，可以用于顯示個(gè)體和群體間的差異，樣品距離越接近，表示物種組成結(jié)構(gòu)越相似，因此群落結(jié)構(gòu)相似度高的樣品傾向于聚集在一起，群落差異很大的樣品則會(huì)遠(yuǎn)遠(yuǎn)分開(kāi)。為進(jìn)一步揭示真菌菌群相似度，基于nuifrac距離，對(duì)測(cè)序獲得的OTU進(jìn)行主坐標(biāo)分析，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 基于OTU數(shù)據(jù)5份樣品真菌菌群PCOA結(jié)果Fig.1 PCOA results of fungal community in 5 samples based on OTU

由圖1可知，PCoA1和PCoA2對(duì)樣品差異性方差貢獻(xiàn)率分別為52.08%和27.08%，累積方差貢獻(xiàn)率為79.16%，說(shuō)明在5份樣品中，真菌組成存在差異，但不顯著。1號(hào)樣品和2號(hào)樣品距離較近，且更接近0，說(shuō)明兩個(gè)樣品的群落進(jìn)化分類更相似。3號(hào)樣品和5號(hào)樣品距離較近，說(shuō)明兩個(gè)樣品的真菌菌群組成相似。4號(hào)樣品與其他4個(gè)樣品的距離比較遠(yuǎn)，相似程度較低。通過(guò)數(shù)據(jù)比對(duì)，說(shuō)明不同產(chǎn)地的瓶裝泉水真菌組成間在OTU水平上存在一定的差異性，但差異不顯著。

2.2 樣品真菌菌群結(jié)構(gòu)分析

使用R軟件，分析樣本在不同分類水平上的群落結(jié)構(gòu)，對(duì)比5個(gè)樣品的結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步對(duì)瓶裝泉水中真菌菌落結(jié)構(gòu)差異進(jìn)行分析，基于門和屬水平的5個(gè)瓶裝泉水樣品真菌群落結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖2。

圖2 基于門(2-a)、屬(2-b)水平的真菌群落結(jié)構(gòu)Fig.2 Fungal community structure at phylum(2-a) and genus(2-b) level

由圖2可以看出，5份瓶裝泉水樣品檢測(cè)到的179個(gè)OTU屬于17個(gè)門71個(gè)屬。在門分類水平上，豐度排名前5的分別為子囊菌門(Ascomycota)、擬桿菌門(Phragmoplastophyta)、未分類的真核(norank-Eukaryota)、毛霉門(Mucoromycota)和線蟲(chóng)門(Nematoda)。其中子囊菌門的豐度最高，在5份樣品中的含量分別為17.11%、41.15%、50.87%、10.51%和12.64%。擬桿菌門在3號(hào)樣品中的含量較高，達(dá)到47.67%。毛霉門在1、2和3號(hào)樣品中有檢出。

在屬分類水平上，共檢測(cè)到71個(gè)真菌屬。由圖2-b可以看出，5份樣品水中真菌菌群在屬分類水平上出現(xiàn)了較大差異。其中3號(hào)樣品水中相對(duì)含量高于1%的真菌屬只有4種，分別是山茶屬Camellia47.70%、曲霉屬Aspergillus43.71%、枝孢屬Cladosporium7.06%和Schima1.13%。1號(hào)樣品中含量高于1%的真菌屬有26種，高于5%的真菌屬共有7種，含量最高的是Panagrolaimus7.11%，其余6種分別是Solanum6.58%、norank_Eukaryota6.32%、Rhabditis5.66%、Metus5.53%和Chlorella5.53%。2號(hào)樣品中含量高于1%的真菌屬有24種，含量高于5%的真菌屬有6種，分別為norank_Eimeriidae11.46%、Niesslia11.25%、Panagrolaimus8.80%、Geocenamus5.72%、Eleutherascus5.53%和Irantylenchus5.25%。4號(hào)樣品中含量高于1%的真菌屬有11種，含量高于5%的真菌屬有6種，分別為Solanum22.74%、Mortierella17.11%、Rhizopus13.85%、Aphelenchoides11.00%、Gyrodinium9.13%和Pichia8.31%。5號(hào)樣品中含量高于1%的真菌屬有24種，含量高于5%的真菌屬有4種，分別為Rhizopus21.09%、norank_Eukaryota12.98%、Heteromita8.24%和Vermamoeba5.05%。

數(shù)據(jù)表明，5份樣品中，在門分類水平上檢測(cè)到17個(gè)分類，共有的門類有5種：擬桿菌門、子囊菌門、Nematoda、Arthropoda、Chlorophyta。但是在屬分類水平上沒(méi)有一種真菌屬同時(shí)存在于每份樣品中，結(jié)合樣本α多樣性和β多樣性分析可以看出，不同樣本之間在屬分類水平上多樣性存在顯著差異。

2.3 瓶裝水中潛在致病菌的分布

對(duì)5份樣本水進(jìn)行高通量測(cè)序，共檢測(cè)出3種潛在致病菌屬，均是子囊菌門。其中，曲霉屬真菌Aspergillus在3份樣本中檢測(cè)出，鐮刀霉屬Fusarium在1份樣本中分離檢測(cè)到，假絲酵母菌屬Candida在1份樣本中檢測(cè)出。曲霉屬真菌存在一些條件致病菌，如黑曲霉等常在飲用水中被檢測(cè)出，而通常情況下，曲霉的污染很大概率是通過(guò)水源污染傳播的。本次調(diào)查中的曲霉屬主要是黑曲霉種。假絲酵母菌被認(rèn)為在長(zhǎng)期飲用后，會(huì)引起人體免疫力下降，導(dǎo)致臟器、黏膜、皮膚等急性或慢性炎癥，而鐮刀霉屬也是引發(fā)飲用水污染的一種真菌。

3 結(jié)論

真菌廣泛存在于水環(huán)境中，而飲用水供水系統(tǒng)經(jīng)常受到環(huán)境真菌的污染，存在一定的安全風(fēng)險(xiǎn)。本項(xiàng)目對(duì)市售的瓶裝水進(jìn)行樣品采集，共采集樣品5份，通過(guò)高通量測(cè)序方法，對(duì)采集的樣本進(jìn)行了真菌在18SV4區(qū)基因序列檢測(cè)分析，共計(jì)檢測(cè)到17個(gè)門、34個(gè)綱、54個(gè)目、65個(gè)科和71個(gè)種，并對(duì)其多樣性和潛在風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行了分析和評(píng)估。

通過(guò)對(duì)群落組成進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，子囊菌門是包裝飲用水的優(yōu)勢(shì)菌門，但是每個(gè)樣品間優(yōu)勢(shì)菌屬各不相同，沒(méi)有一種菌屬同屬于5份樣本中。結(jié)合α多樣性和β多樣性分析，不同地區(qū)采集的樣本具有一定的差異，同時(shí)受到不同水處理工藝的影響，也可能導(dǎo)致瓶裝水檢測(cè)群落結(jié)構(gòu)存在較大差異。在部分樣品中檢測(cè)到曲霉屬、鐮刀霉屬和假絲酵母菌屬的存在，表明其可能穿透水處理工藝的多級(jí)處理工藝屏障，最后在成品包裝水中被檢測(cè)到，這也反映出現(xiàn)有的凈水工藝技術(shù)和部分廠家的工藝流程無(wú)法將其有效去除，這些菌屬的存在可能導(dǎo)致一定的隱患，需要引起生產(chǎn)廠家和監(jiān)管部門的注意。飲用水真菌的生物安全問(wèn)題不容忽視，需要更多的研究發(fā)現(xiàn)其傳播途徑，找到合理有效的控制手段。