化學(xué)-酶法串聯(lián)一鍋合成R-γ-氨基酸

楊 鵬,程 熹,吳星均,朱虹旭,劉雪粉，楊華云,許 可

(1. 杭州師范大學(xué)錢江學(xué)院,浙江 杭州 310036； 2. 浙江省天正設(shè)計工程有限公司,浙江 杭州 310030)

γ-氨基酸是哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中一類具有重要生理作用的神經(jīng)遞質(zhì)抑制劑，它的缺失會導(dǎo)致亨廷頓病、帕金森病及癲癇等多種神經(jīng)性疾病[1].隨著非天然氨基酸領(lǐng)域研究的不斷深入，手性γ-氨基酸在多肽合成、納米材料及生物醫(yī)藥等領(lǐng)域也呈現(xiàn)出許多獨特的性能.例如，手性γ-氨基酸被廣泛用于α, β-和β, γ-混合多肽二級結(jié)構(gòu)修飾及自組裝環(huán)肽納米管等領(lǐng)域[2]；一些抗痙攣藥物如喜寶寧、巴氯芬等的活性成分主要為γ-氨基丁酸類似物.因此，新型手性γ-氨基酸合成將是手性化合物合成領(lǐng)域的重要研究方向.

手性非天然氨基酸領(lǐng)域的研究工作主要集中在手性α-非天然氨基酸的合成上.迄今為止，有機(jī)化學(xué)家們開發(fā)了一系列合成手性α-氨基酸的方法，如：α-亞胺酯的不對稱加成反應(yīng)、α-烯胺及亞胺酯不對稱氫化、α-酮酸及其派生物的不對稱還原胺化、亞胺的不對稱環(huán)加成反應(yīng)等[3-4].近年來，隨著手性γ-氨基酸在生物醫(yī)藥和材料化工等領(lǐng)域顯示出的巨大應(yīng)用前景，其合成方法也逐漸得到重視，多位學(xué)者相繼開發(fā)出了一系列手性γ-氨基酸的合成方法[5-7].但現(xiàn)有合成方法通常需要昂貴的手性催化劑，反應(yīng)歷程比較復(fù)雜，且往往只能得到一種構(gòu)型的手性γ-氨基酸.因此，開發(fā)手性γ-氨基酸的簡易高效合成方法并實現(xiàn)其立體構(gòu)型調(diào)控對拓展非天然氨基酸應(yīng)用范圍具有重大的科學(xué)價值.

酶促動態(tài)動力學(xué)拆分(dynamic kinetic resolution,DKR)是一種綠色高效、低毒環(huán)保的制備手性小分子的有效途徑，國內(nèi)外研究者通過酶促拆分制備了多種具有重要生物活性的手性仲醇或仲胺[7-12].雖然酶促拆分具有種種優(yōu)點，但是其底物譜較窄，一般只能用于制備一些結(jié)構(gòu)比較簡單的仲醇與仲胺.本文報道了一種手性γ-氨基酸合成策略.該方法以烯丙基胺作為起始底物，在脂肪酶催化下利用酯化動態(tài)動力學(xué)拆分反應(yīng)得到光學(xué)純的烯丙基酰胺，烯丙基酰胺再與α, β-不飽和酸發(fā)生烯烴復(fù)分解反應(yīng)制得相應(yīng)的手性γ-氨基酸，從而實現(xiàn)手性γ-氨基酸立體構(gòu)型可調(diào)控生物合成的目的.該策略充分利用了酶促動態(tài)動力學(xué)拆分綠色、高效、高度專一性等優(yōu)點，可以在溫和的反應(yīng)條件下得到光學(xué)純度高的烯丙基酰胺，且反應(yīng)歷程簡單，通過一鍋反應(yīng)就可以獲得單一構(gòu)型手性γ-氨基酸衍生物.

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

1-苯基烯丙基胺、1-(4-溴)苯基烯丙基胺、1-(4-氯)苯基烯丙基胺、1-(4-甲基)苯基烯丙基胺和1-(4-甲氧基)苯基烯丙基胺，一代和二代Grubbs試劑，鈀(Pd)、鎳(Ni)、鈷(Co)等過渡金屬，PS-IM脂肪酶，乙酸乙酯，乙酸苯酚酯，乙酸乙烯酯，乙酸對氯苯酚酯及其他必要的化學(xué)試劑.

化合物的核磁共振氫譜(1H-NMR)采用Bruker Advance DMX 400 MHz 型核磁共振儀測定，其中四甲基硅烷(TMS)作為內(nèi)標(biāo).

手性γ-氨基酸的對映體過量值(e.e.)采用手性液相色譜儀測定.檢測條件為：手性色譜柱為大賽璐AD-H，流動相為正己烷/異丙醇=90/10，流速0.1 mL/min，檢測波長254 nm.

1.2 實驗過程

1.2.1 酶促動態(tài)動力學(xué)拆分合成手性烯丙基酰胺

在干燥的Schlenck管中加入Pd催化劑 (摩爾分?jǐn)?shù)5.0%)、Na2CO3(5 mmol)和固定化脂肪酶(質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%).用針狀注射器注入除水甲苯(10 mL)，50 ℃攪拌5 min，注入5 mmol 烯丙基胺 (溶于10 mL除水甲苯).5 min后，加入15 mmol ?；噭?溶于20 mL除水甲苯)，50 ℃下攪拌24 h后檢測.TLC 檢測顯示原料完全轉(zhuǎn)化，過濾，脫溶劑，得手性烯丙基酰胺粗產(chǎn)物.粗產(chǎn)物經(jīng)柱色譜純化(流動相V石油醚∶V乙酸乙酯=2∶1).手性液相色譜測定產(chǎn)物e.e.值.

1.2.2 烯烴復(fù)分解反應(yīng)合成手性γ-氨基酸

50 mL三頸燒瓶中將取代-烯丙基胺(0.1 mmol)、?；噭?0.3 mmol)溶解到5.0 mL無水甲苯中，加入Pd催化劑(摩爾分?jǐn)?shù)5%)、脂肪酶(質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%)，50 ℃下反應(yīng)48 h.再加入丙烯酸甲酯(0.11 mmol)，第二代Grubbs催化劑(質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%)，加熱回流48 h.反應(yīng)結(jié)束后過濾，脫溶得粗產(chǎn)物.粗產(chǎn)物經(jīng)柱色譜純化(流動相V石油醚∶V乙酸乙酯=3∶1)，得手性γ-氨基酸.

R-4-苯基-4-乙酰氨基-2-乙烯-丁酸甲酯：1H NMR(400 MHz, CDCl3) δ 7.31～7.20(m,5H)，6.80～6.76(m,1H)，5.87～5.84(m,1H)，5.11～5.09(m,1H)，3.71(s,3H)，1.96(s,3H)ppm.e.e.值95%.

R-4-(4-溴-苯基)-4-乙酰氨基-2-乙烯-丁酸甲酯：1H NMR(400 MHz, CDCl3) δ 7.31～7.20(m,4H)，6.80～6.76(m,1H)，5.87～5.84(m,1H)，5.11～5.09(m,1H)，3.71(s,3H)，1.96(s,3H)ppm.e.e.值93%.

R-4-(4-氯-苯基)-4-乙酰氨基-2-乙烯-丁酸甲酯：1H NMR(400 MHz, CDCl3) δ 7.31～7.20(m,4H)，6.80～6.76(m,1H)，5.87～5.84(m,1H)，5.11～5.09(m,1H)，3.71(s,3H)，1.96(s,3H)ppm.e.e.值90%.

R-4-(4-甲基-苯基)-4-乙酰氨基-2-乙烯-丁酸甲酯：1H NMR(400 MHz, CDCl3) δ 7.31～7.20(m,4H)，6.80～6.76(m,1H)，5.87～5.84(m,1H)，5.11～5.09(m,1H)，3.71(s,3H)，2.20(s,3H)，1.96(s,3H)ppm.e.e.值94%.

R-4-(4-甲氧基-苯基)-4-乙酰氨基-2-乙烯-丁酸甲酯：1H NMR(400 MHz, CDCl3) δ 7.31～7.20 (m,4H)，6.80～6.76(m,1H)，5.87～5.84(m,1H)，5.11～5.09(m,1H)，3.81(s,3H)，3.71(s,3H)，1.96(s,3H)ppm.e.e.值90%.

2 結(jié)果與討論

2.1 酶促動態(tài)動力學(xué)拆分手性烯丙基酰胺

酶促反應(yīng)最大的優(yōu)點在于其高度立體專一性，源自不同菌屬和種類的酶通常會呈現(xiàn)出不同的催化活性及立體選擇性.脂肪酶PS-IM已被證明是催化仲醇或仲胺酯化拆分反應(yīng)最為有效的酶催化劑.有鑒于此，本文采用野生型PS-IM催化的1-苯基烯丙基胺的動態(tài)動力學(xué)拆分作為模板反應(yīng).表1中序號1—4分別為1-苯基烯丙基胺在PS-IM催化下與不同?；噭┑膭討B(tài)動力學(xué)拆分結(jié)果，其中乙酸乙酯的拆分結(jié)果最佳，其e.e.值可以達(dá)到92%，同時轉(zhuǎn)化率達(dá)到80%.

表1 酰化試劑和外消旋化試劑對拆分結(jié)果的影響Tab.1 DKR with different acyl and racemic reagents

序號RCat.e.e./%產(chǎn)率/%a1-乙烯基Pd/C20822-乙基Pd/C92803-苯基Pd/C83754-4-氯苯基Pd/C64725-乙基Pd/BaSO496936-乙基雷尼鎳90327-乙基雷尼鈷9325

表2 烯丙基胺動態(tài)動力學(xué)拆分底物擴(kuò)展Tab.2 DKR substrate scope of allylamine

序號Re.e./%產(chǎn)率/%1-苯基96932-(4-溴)苯基95963-(4-氯)苯基92934-(4-甲基)苯基93925-(4-甲氧基)苯基9290

除了酶催化劑之外，外消旋化試劑也是影響酶促動態(tài)動力學(xué)拆分的重要因素.常見的仲胺酶促動態(tài)動力學(xué)拆分反應(yīng)外消旋化試劑包括Pd、Ni、Co等過渡金屬.在確定最佳?；噭┖螅瑢@些常用的外消旋化試劑進(jìn)行了考察，表1結(jié)果(序號5—7)顯示，以Pd/BaSO4的催化結(jié)果最佳，其產(chǎn)率可以達(dá)到93%.綜上，后續(xù)反應(yīng)采用乙酸乙酯作為酰化試劑，Pd/BaSO4作為外消旋化試劑.

基于最佳拆分條件繼續(xù)考察底物的適用范圍，分別選取1-苯基烯丙基胺、1-(4-溴)苯基烯丙基胺、1-(4-氯)苯基烯丙基胺、1-(4-甲基)苯基烯丙基胺和1-(4-甲氧基)苯基烯丙基胺5種不同底物的酶催化動態(tài)動力學(xué)拆分反應(yīng).從表2可以看出，該拆分條件對5種底物均呈現(xiàn)出較佳的拆分結(jié)果，其中1-(4-溴)苯基烯丙基胺的拆分效果最佳，其e.e.值和產(chǎn)率分別達(dá)到95%和96%；而1-(4-甲氧基)苯基烯丙基胺的拆分結(jié)果最差，e.e.值和產(chǎn)率分別為92%和90%，原因可能是苯環(huán)上取代基為吸電子基的底物的拆分效果要優(yōu)于給電子取代基底物.

2.2 化學(xué)-酶法串聯(lián)一鍋合成手性γ-氨基酸

烯烴復(fù)分解反應(yīng)是增長碳鏈的重要反應(yīng)之一.20世紀(jì)70年代初期，Chauvin提出的烯烴與金屬卡賓通過[2+2]環(huán)加成形成金屬雜環(huán)丁烷中間體的相互轉(zhuǎn)化過程，是當(dāng)時被廣泛認(rèn)同的反應(yīng)機(jī)制；1992年Nguyen等[13]發(fā)現(xiàn)了釕卡賓絡(luò)合物，并成功應(yīng)用于降冰片烯的開環(huán)聚合反應(yīng).該催化劑克服了鈦、鎢等催化劑對功能基團(tuán)容許范圍小的缺點，并且對空氣穩(wěn)定，甚至在水、醇或酸的存在下，仍然可以保持催化活性.在成功實現(xiàn)手性取代烯丙基胺的動態(tài)動力學(xué)拆分后，本文繼續(xù)探討利用烯烴復(fù)分解反應(yīng)與酶促動態(tài)動力學(xué)拆分相結(jié)合串聯(lián)一鍋制備手性γ-氨基酸的可能性.

表3 烯烴復(fù)分解反應(yīng)條件優(yōu)化及底物擴(kuò)展Tab.3 Optimization and substrate scope of cross metathesis reaction

序號R溶劑 Cat.e.e./% 產(chǎn)率/%1-苯基乙酸乙酯一代86452-苯基甲苯一代93753-苯基二氯甲烷一代35834-苯基甲苯二代9587

本文采用1-苯基烯丙基胺的酶促動態(tài)動力學(xué)拆分-烯烴復(fù)分解串聯(lián)反應(yīng)作為模板反應(yīng)，結(jié)果如表3(序號1)所示.在模板反應(yīng)中，筆者采用前一步拆分的?；噭┮宜嵋阴プ鳛楹罄m(xù)反應(yīng)的溶劑，結(jié)果烯烴復(fù)分解反應(yīng)轉(zhuǎn)化率較低，只有45%，導(dǎo)致整體收率不高.為此，對溶劑和烯烴復(fù)分解反應(yīng)的催化劑進(jìn)行了進(jìn)一步考察(表3序號2—4)，發(fā)現(xiàn)當(dāng)溶劑為甲苯、催化劑為二代Grubbs催化劑時效果最佳，所得R-γ-氨基酸e.e.值和產(chǎn)率分別達(dá)到95%和87%.因此，后續(xù)底物譜擴(kuò)展中將采用甲苯/Grubbs 2nd體系作為最佳反應(yīng)體系.

表4 化學(xué)-酶法串聯(lián)一鍋合成R-γ-氨基酸Tab.4 Chemo-enzymatic synthesis of R-γ-amino acid in one pot

序號 Re.e./%產(chǎn)率/%11-(4-溴)苯基938521-(4-氯)苯基908231-(4-甲基)苯基948941-(4-甲氧基)苯基9080

在最佳反應(yīng)體系下，分別考察了1-苯基烯丙基胺、1-(4-溴)苯基烯丙基胺、1-(4-氯)苯基烯丙基胺、1-(4-甲基)苯基烯丙基胺和1-(4-甲氧基)苯基烯丙基胺為起始原料的化學(xué)-酶法串聯(lián)一鍋合成R-γ-氨基酸過程，結(jié)果如表4所示.可以看出，采用該方法所制備的R-γ-氨基酸e.e.值均可以保持在90%以上，其中以1-苯基烯丙基胺得到的e.e.值最佳，達(dá)95%；而以1-(4-甲基)苯基烯丙基胺為起始原料，其最終產(chǎn)率達(dá)到89%，e.e.值為94%.

3 結(jié) 論

本文報道了一種手性γ-氨基酸的化學(xué)-酶法一鍋串聯(lián)合成方法，采用烯丙基胺為起始原料，利用烯丙基胺末端烯烴的反應(yīng)活性與丙烯酸甲酯發(fā)生烯烴復(fù)分解反應(yīng)，從而實現(xiàn)碳鏈增長獲得手性γ-氨基酸的目的.通過該方法制備的手性γ-氨基酸的e.e.值均在90%以上，產(chǎn)率也高于80%.鑒于該方法利用了酶促動態(tài)動力學(xué)拆分在制備手性仲胺中的優(yōu)勢，也具有烯烴復(fù)分解在碳鏈增長方面的優(yōu)點，因此對推動手性非天然氨基酸領(lǐng)域的合成研究有一定的作用.