黃芪甲苷通過調(diào)控Wnt-β-catenin/JAK-STAT通路對輸血相關(guān)性急性肺損傷大鼠的改善作用

唐龍泉， 傅 梅， 龔曉玲， 王文俊， 肖 昆*

(1.江西省撫州市第一人民醫(yī)院，江西 撫州 344000；2.南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院，江西 南昌 330006)

急性肺損傷及其重癥形式急性呼吸窘迫綜合征是發(fā)生在肺部的一種重癥炎癥反應(yīng)，嚴(yán)重者會因呼吸功能受到抑制而危及生命，患者的肺泡會出現(xiàn)損壞，肺部沒有足夠的氣流進(jìn)入，進(jìn)一步導(dǎo)致血液中氧含量嚴(yán)重不足，與此同時，患者肺部還會出現(xiàn)炎癥導(dǎo)致的水腫[1-2]。許多因素可以引起急性肺損傷，例如膿毒癥、脂多糖刺激及輸血相關(guān)的外傷等[3]。其中輸血相關(guān)性急性肺損傷(transfusion-related acute lung injury, TRALI)是指使用與血液有關(guān)制品后引起的肺組織急性損傷, 發(fā)病迅速, 致死率高,但臨床尚無可靠的治療方法[4-5]。黃芪具有抗氧化、消炎以及擴(kuò)張血管等作用，其有效成分對肺損傷有一定的治療作用。黃芪甲苷是黃芪的有效成分[6-8]，其對輸血相關(guān)性急性肺損傷的作用機(jī)制尚未有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。Wnt/β-catenin通路在受損的組織復(fù)原、傷口愈合、組織纖維化等中起著重要作用[9-10]；JAK2/STAT3通路是細(xì)胞中不可缺少的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,它能夠調(diào)控細(xì)胞分裂、凋亡和炎癥因子等表達(dá)[11-12]。本研究基于Wnt-β-catenin/JAK2-STAT3信號通路，探討黃芪甲苷對輸血相關(guān)性急性肺損傷大鼠的保護(hù)作用，以期為輸血相關(guān)性急性肺損傷的治療提供參考。

1 材料

1.1 動物 48只6周齡SPF級雄性SD大鼠，體質(zhì)量180～220 g，購自廣東省醫(yī)學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號SCXK(粵)2018-0002, 實(shí)驗(yàn)動物使用許可證號SYXK(粵)2018-0002，飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)動物飼養(yǎng)間。

1.2 試劑與藥物 黃芪甲苷對照品(純度≥98%，批號MUST-09102301)購自上海源葉生物科技有限公司；地塞米松(批號100129-200303)購自湖北紐蘭藥業(yè)有限公司。LPS(批號L4391-1MG)購自上海源葉生物科技有限公司；Wnt5a、p-GSK-3β、GSK-3β、β-catenin、p-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3抗體(批號bs-1948R、AG763、AG751、71-2700、3776、74987、9145、9139)購自美國Proteintech公司；蛋白、mRNA裂解液(批號G1120、C1053)購自上海泛思生物科技有限公司；BCA蛋白定量試劑盒、化學(xué)發(fā)光底物、HE染色液(批號23227、BL520B-1、WH1144)購自美國OriGene公司。其他試劑均為分析純。

1.3 血漿 2019年2月隨機(jī)選擇無償獻(xiàn)血者AB型全血10 U(1 U含全血200 mL及CPDA保存液30 mL)，無菌條件下分別留取血樣10份(10 mL/份)，存儲21 d，830×g離心5 min，獲得血漿約6 mL/份，分裝6份(1 mL/份)，于-80 ℃保存?zhèn)溆?。輸注前將血漿于56 ℃水浴30 min。

2 方法

2.1 分組、造模及給藥 大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、黃芪甲苷組和陽性藥組，每組12只。除正常組外，其余各組大鼠均建立輸血相關(guān)性急性肺損傷模型[13]，腹腔注射2 mg/kg LPS，2 h后麻醉，在股血管處插管，用注射器抽出1 mL血液，再輸注1 mL AB型人血漿，正常組大鼠抽出血液后輸注1 mL 0.9% NaCl。模型建立后，黃芪甲苷組腹腔注射黃芪甲苷(50 mg/kg，用0.9% NaCl溶液配置成1 mL黃芪甲苷注射液)，陽性藥組腹腔注射地塞米松(50 mg/kg)，正常組和模型組腹腔注射等體積0.9% NaCl，24 h后處死大鼠，取血和肺組織用于各指標(biāo)檢測。

2.2 肺組織濕干質(zhì)量比檢測 將分離的肺組織用PBS洗滌后稱定質(zhì)量，記作濕質(zhì)量WA；隨后將肺組織放入80 ℃烤箱烘烤至恒重再次稱定質(zhì)量，記作干質(zhì)量WB，肺組織濕干質(zhì)量比=(WA/WB)×100%。

2.3 部分動脈氧分壓(PaO2)檢測 通過一次性注射器采集大鼠動脈血0.2 mL,采用血?dú)夥治鰞xABL90，按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行檢測。

2.4 HE染色觀察肺組織病理形態(tài) 各組大鼠肺組織用10%中性甲醛固定后石蠟包埋切片，經(jīng)HE染色后光鏡下(×200)觀察拍照。HE染色病理評分標(biāo)準(zhǔn)為1分，無肺泡炎;2分，小于20%的視野呈現(xiàn)肺泡炎; 3分，21%～50%視野呈現(xiàn)肺泡炎;4分，超過半數(shù)視野呈現(xiàn)彌漫性肺泡炎。

2.5 免疫組織化學(xué)染色分析Wnt5a蛋白表達(dá) 大鼠肺組織石蠟切片經(jīng)脫蠟后進(jìn)行抗原修復(fù)，3% H2O2孵育10 min，滴加血清室溫封閉1 h，滴加一抗(1∶50)4 ℃孵育過夜，PBS沖洗，滴加辣根酶標(biāo)記二抗室溫孵育1 h，PBS沖洗，DAB顯色，顯微鏡拍攝肺泡上皮細(xì)胞，每張切片選擇5個視野(×200)，空白對照采用抗體稀釋液代替一抗。

2.6 Western blot法檢測β-catenin、GSK-3β、JAK2、STAT3蛋白表達(dá) 蛋白裂解液裂解肺組織，12 000 r/min離心10 min，取上清液即得總蛋白，BCA法進(jìn)行蛋白定量，將蛋白與上樣緩沖液混合后于100 ℃煮沸5 min，蛋白樣品采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行分離，隨后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h，加入一抗(β-catenin、GSK-3β、JAK2、STAT3)4 ℃孵育過夜，PBS洗滌，加入帶有辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h，PBS洗滌，使用化學(xué)發(fā)光液進(jìn)行顯色，成像系統(tǒng)上進(jìn)行曝光，分析條帶灰度值，以GAPDH作為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白相對表達(dá)。

2.7 RT-qPCR法檢測Axin2、CyclinD1、KLF4、VEGFmRNA表達(dá) 取出大鼠肺組織，按TRIzol試劑盒說明書進(jìn)行裂解并提取總RNA，并按說明書將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA。在冰上配置50 μL PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系，即2×SYBR 25 μL、正反向引物各1 μL、cDNA 2 μL、雙蒸水20.7 μL、Taq DNA Polymerase 0.3 μL，于在PCR儀上反應(yīng)，條件為預(yù)孵育95 ℃ 120 s；擴(kuò)增95 ℃ 20 s，59 ℃ 25 s，72 ℃ 30 s，共45個循環(huán)。以GAPDH作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCT法計(jì)算目的基因mRNA相對表達(dá)。引物序列見表1。

表1 引物序列

3 結(jié)果

3.1 黃芪甲苷對輸血相關(guān)性急性肺損傷大鼠肺組織濕干質(zhì)量比的影響 如表2所示，模型組大鼠肺組織濕干質(zhì)量比高于正常組(P<0.05)；黃芪甲苷組及陽性藥組大鼠肺組織濕干質(zhì)量比低于模型組(P<0.05)。

表2 黃芪甲苷對大鼠肺組織濕干質(zhì)量比的影響

3.2 黃芪甲苷對輸血相關(guān)性急性肺損傷大鼠動脈氧分壓的影響 如表3所示，模型組大鼠動脈氧分壓低于正常組(P<0.05)；黃芪甲苷組及陽性藥組大鼠動脈氧分壓高于模型組(P<0.05)。

表3 各組大鼠動脈氧分壓比較

3.3 黃芪甲苷對輸血相關(guān)性急性肺損傷大鼠肺組織病理形態(tài)的影響 如圖1、表4所示，正常組大鼠肺組織肺泡結(jié)構(gòu)比較清晰，未發(fā)現(xiàn)充血、炎癥細(xì)胞浸潤、水腫等病理現(xiàn)象；與正常組比較，模型組大鼠肺組織有較大程度的出血，肺泡腔里有大量炎性細(xì)胞浸潤，出現(xiàn)了明顯的肺水腫，肺泡間隔也有所加寬，病理評分升高(P<0.05)；與模型組比較，黃芪甲苷組大鼠肺泡壁增厚程度較輕，有少量充血，陽性藥組病變程度有所改善，病理評分降低(P<0.05)。

表4 各組大鼠肺組織病理評分比較

3.4 黃芪甲苷對輸血相關(guān)性急性肺損傷大鼠肺組織Wnt5a蛋白表達(dá)的影響 如圖2、表5所示，正常組大鼠肺組織Wnt5a蛋白陽性表達(dá)較低；與正常組比較，模型組Wnt5a蛋白陽性表達(dá)增加(P<0.05)；與模型組比較，黃芪甲苷組及陽性藥組Wnt5a蛋白陽性表達(dá)降低(P<0.05)。

表5 各組大鼠肺組織Wnt5a蛋白陽性表達(dá)比較

示，與正常組比較，模型組大鼠肺組織p-GSK-3β、p-JAK2、p-STAT3、β-catenin表達(dá)均升高(P<0.05)；與模型組比較，黃芪甲苷組和陽性藥組大鼠肺組織p-GSK-3β、p-JAK2、p-STAT3、β-catenin表達(dá)均降低(P<0.05)。

3.6 黃芪甲苷對輸血相關(guān)性急性肺損傷大鼠肺組織Wnt-β-catenin/JAK-STAT通路相關(guān)靶基因mRNA表達(dá)的影響 如圖4所示，與正常組比較，模型組大鼠肺組織Axin2、KLF4、CyclinD1、VEGFmRNA表達(dá)均升高(P<0.05)；與模型組比較，黃芪甲苷組及陽性藥組大鼠肺組織Axin2、KLF4、VEGFmRNA表達(dá)降低(P<0.05)，CyclinD1 mRNA表達(dá)升高(P<0.05)。

4 討論

在當(dāng)今學(xué)說中，“二次打擊”被認(rèn)為是造成輸血相關(guān)性急性肺損傷的重要原因，第一次打擊是患者伴有重大感染等情形可以導(dǎo)致中性粒細(xì)胞的活化，從而使其能躲藏在肺里；第二次打擊是將含白細(xì)胞抗體的血液輸注到患者體內(nèi)，其中的白細(xì)胞抗體和患者體內(nèi)的白細(xì)胞產(chǎn)生了抗原-抗體免疫反應(yīng)，使患者的補(bǔ)體和肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞Fcγ受體被激發(fā)，導(dǎo)致中性粒細(xì)胞的進(jìn)一步活化，給肺血管內(nèi)皮細(xì)胞造成沉重打擊，改變其通透性，使得血管中的物質(zhì)更容易進(jìn)入肺泡及肺泡間質(zhì)，導(dǎo)致肺水腫，呼吸膜加厚，引起各時間點(diǎn)氧氣進(jìn)入血液中的含量不一致，最終的結(jié)果便是導(dǎo)致輸血相關(guān)性急性肺損傷[14-15]。在上述理論的指導(dǎo)下，大鼠腹腔注射低劑量LPS，營造一種中性粒細(xì)胞在肺循環(huán)中激活的狀態(tài)，模擬患者輸血后肺部損傷的情況，建立輸血相關(guān)性急性肺損傷大鼠模型，建模后24 h檢測大鼠肺部病理特征、肺組織濕干質(zhì)量比和PaO2。結(jié)果，模型組大鼠肺組織濕干質(zhì)量比增加，PaO2降低，肺組織有不同程度的肺泡結(jié)構(gòu)被損壞、肺間質(zhì)變寬、肺水腫及炎癥細(xì)胞浸潤等表現(xiàn)；給予黃芪甲苷后，大鼠肺水腫及損傷情況有所緩解。

研究表明，Wnt-β-catenin/JAK-STAT信號通路對機(jī)體不同生理過程都有一定的影響[16-19]。當(dāng)發(fā)生了肺損傷時，Wnt信號的過度激活或許會引起胞外物質(zhì)的大量釋放，導(dǎo)致肺組織的纖維化，也可以促進(jìn)肺上皮細(xì)胞的過度增殖[20]。JAK-STAT通路可以參與目的基因的轉(zhuǎn)錄以及炎癥因子的表達(dá)[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，Wnt-β-catenin通路的配體Wnt5a參與到了黃芪甲苷治療輸血相關(guān)性急性肺損傷的過程中，與此同時，Wnt-β-catenin/JAK-STAT通路胞內(nèi)分子GSK-3β、JAK2以及STAT3的磷酸化和β-catenin表達(dá)也參與到該過程中。本研究還發(fā)現(xiàn)，黃芪甲苷組Wnt-β-catenin/JAK-STAT通路的靶基因Axin2、KLF4及VEGFmRNA表達(dá)均降低，CyclinD1 mRNA表達(dá)升高。

綜上所述，本研究初步解釋了黃芪甲苷對輸血相關(guān)性急性肺損傷的改善作用是通過抑制Wnt5a表達(dá)，降低GSK-3β、β-catenin、JAK2、STAT3蛋白磷酸化及提高Wnt-β-catenin/JAK-STAT信號靶基因的表達(dá)得以發(fā)揮的，提示促進(jìn)Wnt-β-catenin/JAK-STAT通路的活化或許能夠成為治療輸血相關(guān)性急性肺損傷的新手段。