水酶法提油過程中破乳方法研究進展

高玉航，牛瑞浩，姚飛，陳復生

（河南工業(yè)大學糧油食品學院，河南 鄭州 450001）

傳統(tǒng)的油脂提取方法為壓榨法和浸出法，壓榨法通過機械擠壓的方式破壞細胞結構，使油脂釋放，油脂品質(zhì)較高，但壓榨法得油率較低。由于蛋白質(zhì)在高溫和高剪切力的作用下發(fā)生變性，導致利用率低，生產(chǎn)過程耗能耗時[1-2]。浸出法是依據(jù)溶劑相似相溶的原理提取油脂，提取率高，但存在生產(chǎn)安全、溶劑殘留和空氣污染等問題，產(chǎn)生的粕被當作飼料或者肥料使用，造成資源的浪費[3-4]。因此需要尋找一種新型提油方法來改善或者避免這些問題。

水酶法是一種綠色環(huán)保、安全、操作簡潔的提油方法。在機械破碎油料細胞結構的基礎上，通過添加纖維素酶、果膠酶等復合酶水解細胞壁，釋放油脂和蛋白質(zhì)，能夠同時得到品質(zhì)好的油脂和變性程度低的蛋白質(zhì)，成本低、操作條件溫和[5]。與浸出法相比，水酶法生產(chǎn)安全、綠色環(huán)保、無氣體排放，與壓榨法相比，提取率高、油脂品質(zhì)較高，但水酶法提取過程中蛋白質(zhì)和磷脂會乳化油滴，形成穩(wěn)定的乳狀液需要進一步破乳[6]。

1 提油過程中乳狀液特性及其影響因素

植物油通常存在于油脂體中，由磷脂單層膜和油脂體蛋白包裹而穩(wěn)定[7]。水酶法酶解后，由于蛋白質(zhì)是具有親水和親油兩性基團的表面活性分子，能夠吸附到油滴表面，在油水之間形成夾層，形成以蛋白質(zhì)-磷脂復合的膜包裹著的乳狀液[8]。膜上的蛋白質(zhì)主要包括油體蛋白（15 kDa～25 kDa）、油體鈣蛋白（27 kDa～30 kDa）、固醇蛋白（40 kDa），油體蛋白和油體鈣蛋白是乳狀液液滴表面主要的結構蛋白，由錨定在三酰基甘油內(nèi)的中央疏水域和面對細胞質(zhì)的親水性N端和C端組成，可在油滴表面形成黏彈性吸附層，有效地防止油滴聚集和奧斯特瓦爾德成熟，保持乳化體系的穩(wěn)定[8-11]。

許多因素會影響乳狀液的穩(wěn)定性，例如液滴尺寸和表面電荷、水解度、表面疏水性。例如，隨著液滴尺寸和表面張力變小，黏度變高，乳液變得更穩(wěn)定[12]。包裹液滴的界面膜主要是通過蛋白質(zhì)分子間和分子內(nèi)的靜電與疏水相互作用的結合而形成的。因此蛋白質(zhì)的分子組成和結構會強烈影響界面膜的性質(zhì)和乳狀液的穩(wěn)定[13]。其中乳狀液穩(wěn)定性對液滴尺寸和表面電荷敏感[14]。

液滴尺寸主要取決于所使用的乳化劑（蛋白質(zhì)）和乳化過程中的剪切力，剪切力越大，粒徑越小，乳狀液分布均勻[8]。液滴尺寸受表面蛋白質(zhì)影響，TCHOLAKOVA等[15]指出，當表面蛋白濃度達到1 mg/m2～2 mg/m2時，足以形成一個穩(wěn)定的單層來包裹油滴。ZHANG和LI等[16-17]測得花生乳狀液的表面蛋白質(zhì)濃度分別為7.92、87.95 mg/m2，這表明在油滴表面覆蓋了多層蛋白質(zhì)，并且油滴粒徑與粉碎方法（干法和濕法）、油料內(nèi)部結構有關[18]。當?shù)鞍踪|(zhì)數(shù)量不足以包裹所有油滴時，往往會與相鄰的油滴共享，導致油滴絮凝但不會失穩(wěn)[11]。蛋白質(zhì)濃度增加將增加油滴的覆蓋面積，抑制油滴聚集并形成較小的油滴，并且隨著乳狀液黏度的增加，被蛋白質(zhì)覆蓋的液滴碰撞減少，所以在一定范圍內(nèi)平均粒徑隨著蛋白質(zhì)濃度的增加而減小[14]。當大液滴相互碰撞時，除了暴露疏水基團以外，液滴之間沒有足夠的斥力來阻止形成二硫鍵或疏水鍵，最終導致液滴的聚集[12]。破乳后，粒徑分布從單峰分布變?yōu)殡p峰粒徑分布。升高溫度會導致粒徑增加，較大尺寸的顆?？赡苁怯捎谟偷蔚木奂?，或者是吸附在不同小液滴上的蛋白質(zhì)之間形成了共價結合的聚集體[19]。

通常用zeta-電位來對表面電荷定量，并將乳狀液按照電位值±（0～10）、±（10～20）、±（20～30）、±（>30）mV分為高度不穩(wěn)定、相對穩(wěn)定、中度穩(wěn)定、高度穩(wěn)定。pH值和離子濃度對zeta-電位有顯著影響。在等電點處，乳狀液的zeta-電位接近0，并且由于乳液粒子靜電斥力降低和范德華力的作用，粒子疏水性最強，乳狀液失穩(wěn)，有大量的液滴聚集；等電點以下，由于氨基質(zhì)子化，帶正電；等電點以上，由于羧基去質(zhì)子化，帶負電。通過調(diào)節(jié)pH值可以減少表面蛋白與磷脂之間的相互作用[11-12，20]。在離子強度為0時，乳狀液中蛋白質(zhì)顆粒表面帶有凈電荷，這些凈電荷產(chǎn)生斥力可使乳狀液穩(wěn)定處于動態(tài)平衡。當加入離子，會與這些帶電基團結合降低總電荷，zeta-電位降低，顆粒聚集，粒徑顯著增加。NING等[21]發(fā)現(xiàn)當花生乳狀液中NaCl濃度從0增加至500 mmol/L時，粒徑從178.2 nm增加至260.9 nm，zeta-電位從-36.2 V增加至-8.4 V，帶電的Na+與帶負電的花生蛋白相互作用，降低靜電斥力，油滴聚集（鹽析）。

除此之外，游離油得率與蛋白質(zhì)水解度呈正相關。蛋白質(zhì)的廣泛水解（水解度通常超過10%）明顯導致表面疏水性降低。蛋白質(zhì)表面疏水性是與極性水環(huán)境接觸的蛋白質(zhì)表面疏水基團數(shù)量的指數(shù)，與其乳化性能密切相關[22]。表面疏水性的變化與二級結構的變化程度有關，當?shù)鞍踪|(zhì)水解后掩埋的疏水基團暴露，并通過疏水作用相互作用而聚集，從而有效地將它們重新掩埋在較大聚集結構的內(nèi)部，從而降低了表面疏水性[16]。

2 破乳方法

一般的破乳機制主要是沉淀、上浮、聚集、相轉變、合并以及奧斯特瓦爾德熟化6種[23]。破乳的目的是加速或者促進組成分離。對于離心破乳，只是加速不同相合并和分層，并不能完整分離。如何有效破乳，提高油脂和蛋白質(zhì)得率，是目前水酶法研究的重點之一。

2.1 物理法破乳

2.1.1 加熱法破乳

溫度升高會加快乳狀液中分子的熱運動，降低界面膜的黏度和乳狀液的穩(wěn)定性，同時高溫使蛋白質(zhì)變性聚沉并加速水分子的運動，增加液滴相互碰撞機會，有利于乳化油的釋放，實現(xiàn)破乳[24-25]。在一定程度加熱時，乳狀液的蛋白質(zhì)可以產(chǎn)生穩(wěn)定的納米顆粒和聚集體，通過增加連續(xù)相的黏度和在油滴上形成第二層蛋白質(zhì)層使乳狀液穩(wěn)定性增加。此時乳狀液從單峰粒徑分布變?yōu)殡p峰粒徑分布和更大的粒徑[19，26]。高溫可能會通過改變蛋白質(zhì)的粒徑、二級結構和表面疏水性而影響乳化性能[27]。當溫度高于蛋白質(zhì)變性點，蛋白質(zhì)展開，靜電斥力降低，并暴露出巰基和二硫鍵，二者形成共價分子間二硫鍵，疏水鍵與二硫鍵相互作用，致使變形蛋白質(zhì)聚集[28-30]。

DYBOWSKA[19]發(fā)現(xiàn)隨著溫度升高，乳狀液的穩(wěn)定性從52.2%降至48.2%，乳清濃縮蛋白的乳化能力從22.6 mL油/100 mg乳清濃縮蛋白降至19.6 mL油/100 mg乳清濃縮蛋白。王文睿等[31]將乳狀液進行油浴或者水浴，通過加熱作用，破壞蛋白質(zhì)結構，使其變性，然后在10 000 r/min條件下離心10 min，發(fā)現(xiàn)最佳破乳條件為乳狀液濃度85%、pH4.5、加熱溫度120℃、加熱時間15 min，破乳率為90.76%。李楊等[24]使用高壓蒸汽對花生乳狀液進行加熱破乳，最佳工藝條件為蒸汽壓力18.2 MPa、蒸汽溫度115℃、蒸汽處理時間21 s，破乳率和總油得率為93.49%和89.54%，并且高壓蒸汽的破乳率和總油得率高于水浴加熱。

2.1.2 冷凍-解凍法破乳

冷凍-解凍破乳方法分為兩步，在冷凍過程中，乳狀液出現(xiàn)油相結晶，當脂肪晶體出現(xiàn)在相鄰油滴之間時，界面膜會被刺穿導致油滴聚集，從而降低乳狀液穩(wěn)定性，達到破乳的目的。在解凍過程中，乳狀液溫度升高，黏度降低，增加了油水之間的相互碰撞，有利于油水分離，破乳率提高[28]。冷凍-解凍破乳遵循碰撞機制，是一個漸進的過程。破乳效果與水分含量（30%～65%）之間存在線性關系，并且破乳率隨著液滴粒徑的增加而增加，而油的種類對其影響不大[32]。

LIN等[33]對比了冰箱冷凍法、低溫水浴法、干冰法、液氮法4種冷凍方法對破乳效果的影響，發(fā)現(xiàn)去除水的最佳冷凍方法是低溫水浴法和干冰法，并且對于所有含水量為60%的體系，其效率都超過70%，而與液滴大小和油相類型無關。程雪等[28]使用冷凍-微波解凍對紫蘇籽水酶法所得乳狀液進行破乳，最佳工藝條件為冷凍溫度-20℃、冷凍時間13 h、微波解凍時間60 s、微波解凍強度450 W下，此時破乳率94.53%。在響應面優(yōu)化大豆乳狀液冷凍微波解凍破乳工藝中，齊寶坤等[29]發(fā)現(xiàn)冷凍時間對破乳效果影響最大，其次是微波解凍功率、冷凍溫度、微波解凍時間、微波解凍溫度，最佳破乳條件為-16.9℃、冷凍時間17.5 h、解凍溫度62.4℃、解凍功率666.5 W、解凍時間10.5 min，響應面最優(yōu)值為（96.89± 1.43）%。CHABRAND[1]采用冷凍解凍法對大豆乳狀液破乳，油脂得率從3%提高到22%。

2.1.3 微波法破乳和高壓CO2法破乳

微波作用產(chǎn)生電磁場，乳狀液內(nèi)部水滴不斷地在電磁場作用下沿著電場方向發(fā)生聚集、破裂使油水兩相之間的薄膜變薄，并且由于電磁場的高頻振蕩，體系內(nèi)部的極性分子加速運動自由振蕩，完成破乳[35]。其中微波強度與破乳效果在一定范圍內(nèi)呈線性關系，強度過大時，油脂與蛋白質(zhì)會重新結合，破乳率反而降低。王文睿等[36]對大豆乳狀液進行微波破乳，最佳條件為微波作用時間49 s、微波強度700 W、pH4.66、乳狀液體積分數(shù)82%，此時破乳率為75.88%，并分析得出，對破乳效果的影響從大到小為微波強度、微波作用時間、乳狀液體積分數(shù)、pH值。微波破乳法與加熱法相比，油脂得率更高，比冷凍-解凍法速度更快，并且不使用溶劑，破乳率高[37]。Liu等[30]采用微波破乳所得油的脂肪酸組成與加熱法、冷凍-解凍法沒有明顯差異，但氧化穩(wěn)定性要好于加熱法。

高壓CO2破乳中，CO2對非極性物質(zhì)具有高親和力，并能夠溶解在油相中以溶脹乳液的油滴，從而導致密度降低。CO2溶解在水相中形成碳酸，碳酸作為電解質(zhì)破壞了乳液的電荷平衡，使乳液失穩(wěn)。NAGAO等[38]試驗結果表明，高壓CO2可以作為溶脹劑，降低分散的油相密度，從而使油滴漂浮聚集，實現(xiàn)破乳。韓宗元等[39]利用響應面分析方法得到最佳工藝條件為高壓CO2壓力13.96 MPa、溫度 155.64℃、處理時間 21.46 s、CO2濃度0.53g/cm3，破乳率為（94.88±0.30）%。但是此過程中存在高壓和高溫，具體的機制尚未得到闡明。

2.2 化學法破乳

2.2.1 有機溶劑法破乳

有機溶劑萃取破乳原理是以分配定律為基礎（萃取相濃度/萃余相濃度=分配系數(shù)），分配系數(shù)越大，分離效果越好。萃取效果主要受溶劑用量、介質(zhì)pH值、萃取時間3個因素影響。常用的溶劑有乙醇、乙醚等。肖麗飛等[40]使用乙醇對油茶籽油進行破乳，在乙醇濃度為35%、乙醇添加量為1∶1（體積比）時，破乳率分別為58.73%和58.52%。FANG等[4]使用20%的乙醇破乳，最高破乳率為91.38%。馬嬌[32]采用不同體積分數(shù)的正己烷和氯仿/甲醇（2∶1，體積比）對小麥胚芽油乳狀液進行破乳，發(fā)現(xiàn)用量越大破乳效果越明顯。TABTABAEI等[41]以托克黃芥粉為原料，先用水將蛋白質(zhì)進行回收，再經(jīng)過二甲基甲酰胺或異丙醇提取黃芥末油，二甲基甲酰胺與水有廣泛的混溶性，最高能提?。?8±3）%的油，在異丙醇 ∶油質(zhì)量比為 31∶1時，可有效提取乳狀液中94%以上的油。

2.2.2 無機鹽法破乳

一般油水界面上有電荷存在時，界面兩側都有雙電層和電位降。對于由蛋白質(zhì)穩(wěn)定的水包油型乳狀液，當油滴表面上的雙電層發(fā)生相互重疊時，在靜電排斥的作用下油滴分開，乳狀液保持穩(wěn)定。而在加入無機鹽后，可能破壞穩(wěn)定的蛋白質(zhì)雙電層結構，促使油水之間因密度差和極性差而分離，油滴發(fā)生聚集導致破乳[35]。鹽濃度較低時，鹽離子的添加可以提高表面蛋白質(zhì)在水中的溶解度，增加乳狀液穩(wěn)定性；鹽濃度較高時，帶正電的離子與帶負電的蛋白相互作用，降低靜電斥力，油滴聚集（鹽析）[20-21]。肖麗飛[40]在使用食鹽破除油茶籽乳狀液中，分別研究了食鹽添加量、溫度和加熱時間對破乳率的影響，發(fā)現(xiàn)在食鹽添加量為15%、溫度為90℃、時間為30 min時，破乳率分別為42.15%、42.36%、43.07%。吳海波等[42]向大豆乳狀液中添加 0.04 mol/L CaCl2，在 60、70、80 ℃下反應 90、50、30 min可完全破乳。

2.2.3 酸堿破乳法

在乳狀液中，pH值的變化會影響蛋白質(zhì)的溶解度以及乳化能力，當體系pH值很高時，體系負電荷較多，分子間的排斥作用力增強，蛋白質(zhì)（主要是油質(zhì)蛋白）溶解度降低，容易從油滴表面脫落，從而利于油滴的聚集，并且在強堿的條件下，蛋白質(zhì)容易發(fā)生變形和沉降[43]。但pH值過高容易導致游離脂肪酸的形成，影響油脂品質(zhì)[40]。吳海波等[42]發(fā)現(xiàn)體系pH值的降低使乳狀液電位絕對值和黏度下降，促使油滴發(fā)生聚合，油滴平均粒徑增大，導致乳狀液穩(wěn)定性降低。當pH值為3～4時，50℃作用30 min大豆乳狀液完全破乳。當接近蛋白質(zhì)的等電點時，包裹油滴的蛋白質(zhì)聚集，破壞了乳狀液的完整性[16]。CHABRAND等[1]通過調(diào)節(jié)pH值使油得率從2%提高到83%。當pH值調(diào)節(jié)至乳狀液等電點附近，乳狀液粒徑增大，zeta-電位接近于0，蛋白質(zhì)的二級結構發(fā)生變化，表面疏水性降低，結構松散，使乳狀液穩(wěn)定性降低[44]。

2.3 酶法破乳

乳狀液中蛋白質(zhì)、磷脂等兩親性物質(zhì)使乳狀液趨于穩(wěn)定。兩親的水溶性蛋白質(zhì)傾向于在油-水界面形成穩(wěn)定的蛋白質(zhì)薄膜，使油滴均勻分散，體系穩(wěn)定。磷脂具有很高的表面活性，可以顯著影響乳狀液的穩(wěn)定性。碳水化合物通過增加黏度或分離液滴的水相凝膠化來減少聚結，有效性隨濃度的增加而增加[4]。根據(jù)含量和功能的差別，現(xiàn)在普遍認為水-油界面處蛋白質(zhì)分子的裂解是造成破乳作用的主要原因。酶解后的短肽由于缺乏二級和三級結構，穩(wěn)定空間和界面膜的能力較差，從而實現(xiàn)破乳[16]。

LI等[45]分別使用蛋白酶、磷脂酶和淀粉酶對花生乳狀液進行破乳，發(fā)現(xiàn)使用堿性蛋白酶（Alcalase 2.4 L）可獲得（86.9±3.3）%的游離油，而使用淀粉酶和磷脂酶則分別獲得（69.0±4.0）%和（56.7±1.2）%，這可能是由于蛋白質(zhì)是穩(wěn)定乳狀液的主要物質(zhì)。其中蛋白酶中Protex 50FP和木瓜蛋白酶的破乳率均在90%以上。ZHANG等[46]使用堿性內(nèi)肽酶Mifong?2709，在水 ∶花生乳狀液體積比為1∶1、酶濃度1 600 IU/g、酶解溫度50℃下酶解70 min后，油脂得率為94%。LAMSAL等[47]使用磷脂酶對大豆乳狀液進行破乳，發(fā)現(xiàn)不同磷脂酶可以作用于磷酸甘油酯的不同位點，能夠極大地破壞乳狀液的穩(wěn)定性，如Lysomax（磷脂酶A2）、G-zyme999（磷脂酶A1）和磷脂酶C可以分別作用于磷脂的sn-2、sn-1和sn-3位點。

僅選用蛋白酶對其進行破乳處理，未考慮磷脂和碳水化合物等成分在乳狀液的穩(wěn)定中可能起到的作用，未篩選出適宜該乳狀液破除的專用酶及破乳條件，有時候破乳效果不理想[48]。因此可以考慮對酶進行復配。CHABRAND[1]對大豆乳狀液進行兩步破乳，先使用堿性肽鏈內(nèi)切酶，提油率提高到95%，然后使用溶血磷脂酶A1在pH4.5進行處理，可將乳狀液完全轉化為游離油。但是當使用過量的酶時，游離油得率開始下降，這是因為當高濃度蛋白質(zhì)存在乳狀液中，可能充當乳化劑[46]。

3 復合法破乳

將物理、化學、酶法破乳聯(lián)合使用，也可以對水酶法乳狀液破乳。LIU等[30]使用微波對花生乳狀液進行破乳，并加入CaCl2，在最佳條件下，CaCl2-微波破乳的破乳率為92.3%，時間僅為2min。當使用特殊的蛋白酶時，往往會與pH值產(chǎn)生協(xié)同效應。張根生等[49]在酶法破乳最佳工藝條件下對南瓜籽油乳狀液破乳，破乳率為88.39%，當pH值調(diào)節(jié)至4.5時，破乳率提高到95.47%。李世科等[50]對水酶法提取油茶籽油形成的乳狀液進行破乳研究，先調(diào)節(jié)pH值破乳后酶法破乳，最高破乳率為90.15%。

4 展望

乳液的穩(wěn)定性可以通過液滴粒徑、zeta-電位、水解度和表面疏水性進行表征，在乳狀液破乳過程中，粒徑變大、電位絕對值變小，表明蛋白質(zhì)功能性質(zhì)發(fā)生變化，乳液失穩(wěn)油滴釋放。所有破乳方法旨在提高乳狀液破乳率、增加游離油提取率，為水酶法提取植物油的實際生產(chǎn)提供參考依據(jù)。但是使用單一方法可能存在缺陷，如加熱破乳可能使油脂品質(zhì)下降；冷凍-解凍雖然油脂品質(zhì)好，但耗能較大、設備成本較高；酶法破乳，破乳率較其他方法高，無雜質(zhì)和污染，在合適的工藝條件下，酶可以回收重復利用，得到高品質(zhì)的油脂和蛋白質(zhì)。對于不同類型的乳狀液，蛋白質(zhì)的種類、作用不完全相同，具體的機制尚未闡明。若要達到的良好的破乳效果，必須對乳狀液中蛋白質(zhì)的作用進行深入的研究。