QuEChERS-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定乳粉中黃曲霉毒素B1和M1

劉 瑞，陳冬東，賈景建，王一名，霍思宇，董 靜，彭 濤*，呼秀智

(1.河北工程大學(xué)，生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，河北邯鄲 056107；2.中國檢驗檢疫科學(xué)研究院，北京 100176)

黃曲霉毒素天然存在于自然界中，在濕度大雨水偏多地區(qū)的飼料中往往能檢測出黃曲霉毒素含量超標(biāo)。在所有已分離出的結(jié)構(gòu)相似的黃曲霉毒素中，黃曲霉毒素B1(aflatoxin B1, AFB1)對人類和動物畜禽的毒害影響最大, 1 μg便能引起肝臟癌變[1-2]，各國對食品中黃曲霉毒素都進(jìn)行了嚴(yán)格控制。大量研究數(shù)據(jù)表明，進(jìn)入哺乳動物體內(nèi)的AFB1會有一部分在酶的作用下被羥化為毒性僅次于AFB1的黃曲霉毒素M1(aflatoxin M1, AFM1)[3]，并積蓄在動物乳汁中。我國奶類產(chǎn)量在2019年居世界第四位，面對日益增長的乳品產(chǎn)量及層出不窮的乳品中黃曲霉毒素含量超標(biāo)事件，我國于2017年規(guī)定了AFB1與AFM1在嬰幼兒食品及乳品中的限量標(biāo)準(zhǔn)為0.5 μg/kg?？梢?，能夠簡單準(zhǔn)確、高效快速的檢測乳粉中AFB1與AFM1在確保消費者健康方面至關(guān)重要。

近年來，檢測不同食品基質(zhì)中真菌毒素的各種方法隨著檢測儀器的進(jìn)步而迅速發(fā)展，包括液相色譜法[4-5]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[6-7]、酶聯(lián)免疫吸附法[8-9]等。其中高效液相色譜法需要大量試劑且靈敏度相對較低，酶聯(lián)免疫法存在酶不穩(wěn)定性問題，而高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(High performance liquid chromatography tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS)在分離及篩選待測物方面都有很好的效果，該技術(shù)結(jié)合了液相和質(zhì)譜的優(yōu)點，穩(wěn)定可靠、靈敏度高、高效快速[10-11]。前處理方法中，QuEChERS技術(shù)經(jīng)過不斷優(yōu)化，只需經(jīng)過提取、鹽析和凈化3個步驟則可將待測物從樣品基質(zhì)中轉(zhuǎn)移出來。目前報道的對乳粉中黃曲霉毒素的研究多集中在AFM1的測定上。曲斌等[12]檢測生鮮牛乳中AFM1以Sampli Q萃取劑萃取,用900 mg硫酸鎂和150 mg 十八烷基鍵合硅膠吸附劑(C18)對萃取液凈化并濃縮后,上機(jī)檢測。于建玉等[13]選擇用50 mg 胺丙基鍵合硅膠(NH2)和50 mg N-丙基乙二胺(primary secondary amine, PSA)吸附牛奶提取液中的干擾雜質(zhì)，建立了檢測牛乳中AFM1方法，說明QuEChERS技術(shù)在乳品中黃曲霉毒素檢測方面的可行性。因此，本研究選擇在優(yōu)化QuEChERS技術(shù)結(jié)合高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的基礎(chǔ)上，對乳粉中B1與M1的同時檢測方法進(jìn)行研究，以期為乳粉中黃曲霉毒素殘留的檢測提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 嬰幼兒配方乳粉(西安銀橋乳業(yè)集團(tuán)有限公司)；乙酸銨(色譜純，比利時Acros公司)；氯化鈉、無水硫酸鎂(使用前200 ℃烘干12 h)(分析純，北京伊諾凱科技有限公司)；十八烷基鍵合硅膠吸附劑(C18)、N-丙基乙二胺(PSA)(德國CNW科技公司)；C18柱(2.1 mm×150 mm，3 μm)(上海技爾商貿(mào)有限公司)；甲酸(質(zhì)譜級，美國Fisher公司)、甲醇、乙腈、正己烷(色譜純，美國Fisher公司)；AFB1、AFM1標(biāo)準(zhǔn)溶液(3 mg/L，純度≥98%，上海安譜實驗科技股份有限公司)；乳粉中AFB1、AFM1質(zhì)控樣品(中檢科(北京)實驗室能力評價有限公司)。

1.2 儀器 Milli-Q去離子水發(fā)生器(美國Millipore公司)；ms205 du型精密電子天平(十萬分之一，上海梅特勒-托利多儀器公司)；H1750R型離心機(jī)(湖南湘儀離心機(jī)儀器公司)；STM-18-14型馬弗爐(河南三特爐業(yè)科技有限公司)；VORTEX-5型渦旋振蕩器，(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)；STV-100型多管渦旋振蕩器(杭州茂豐儀器有限公司)；DC-24-RT型24位水浴加熱氮吹儀(上海安譜實驗科技股份有限公司)；KQ-700DV型超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司)；HPLC-MS 8045型高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(日本島津公司)。

1.3 樣品來源 從北京市超市采購的乳粉樣品，選擇無黃曲霉毒素殘留且基質(zhì)背景較為干凈的樣品，最終確定以西安銀橋牌乳粉樣品作為空白樣品。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 各取濃度為3 mg/L的AFB1與AFM1標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL于10 mL容量瓶內(nèi)，甲醇稀釋并定容，標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度為300 μg/L，保存于-18 ℃恒溫環(huán)境中，所用容量瓶為棕色且保存過程中注意避光。使用前靜置至常溫，并用甲醇稀釋至目標(biāo)濃度。

1.5 樣品前處理

1.5.1 樣品提取 稱取2 g乳粉樣品(精確至0.001 g)于25 mL離心管中，3 mL超純水溶解。渦旋1 min，10 mL乙腈提取，振蕩10 min，超聲10 min，10 000 r/min離心8 min。

1.5.2 樣品凈化 取上述上清液至另一裝有4 g無水硫酸鎂和1 g氯化鈉離心管中，渦旋1 min，振搖10 min，10000 r/min離心8 min。取全部上清液至含40 mg C18和450 mg無水硫酸鎂離心管中，渦旋1 min振蕩10 min，10000 r/min離心8 min，全部上清液于40 ℃下氮吹至干，1 mL初始流動相定容，過0.22 μm有機(jī)相濾膜，待測。

1.6 儀器分析條件

1.6.1 色譜條件 InertSustain-C18色譜柱(2.1 mm×150 mm，3 μm)；柱溫:28 ℃；流速:0.2 mL/min；進(jìn)樣量:5 μL；流動相:A為5 mmol/L乙酸銨，B為甲醇溶液；梯度洗脫程序:0～5 min，30%～100% B；5～5.5 min，100% B；5.5～6 min，30% B；6～9 min，30% B。

1.6.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源(electrosprayionization, ESI)；多反應(yīng)監(jiān)測(multi-reactionmonitoring，MRM)模式；正離子模式；霧化器流量：3 L/min；干燥器流量：10.0 L/min；加熱器流量：10 L/min；接口溫度：300 ℃；接口電壓：4.0 kV；其他質(zhì)譜采集參數(shù)見表1。

表1 AFM1與AFB1的質(zhì)譜分析條件參數(shù)

1.7 基質(zhì)匹配外標(biāo)曲線 各稱取6份2 g陰性乳粉樣品(精確至0.001 g)于離心管中，分別加入AFB1和AFM1的標(biāo)準(zhǔn)工作液，使樣品中質(zhì)量濃度分別為0.08、0.5、1、5、10、20 μg/kg，經(jīng)過1.4項和1.5項的前處理，用1.6項條件檢測。以所得AFB1和AFM1的色譜峰面積為縱坐標(biāo)，所添加質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)分別繪制基質(zhì)添加外標(biāo)曲線，進(jìn)行定量分析。

1.8 數(shù)據(jù)處理 本研究數(shù)據(jù)采用Excel和Origin 8.5進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

1.9 方法準(zhǔn)確度與精密度 采用標(biāo)準(zhǔn)添加法，分別準(zhǔn)確稱取空白乳品樣品2 g并添加一定體積的黃曲霉毒素，使乳粉中AFM1與AFB1的含量分別為0.05、0.25、0.50 μg/kg三個不同濃度，按上述樣品前處理方法處理后進(jìn)行測定，一日內(nèi)每種毒素的每個添加濃度取6個平行樣品進(jìn)行測定，重復(fù)測定3 d，基質(zhì)匹配外標(biāo)法定量，計算回收率和批內(nèi)、批間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的建立 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法既能做定性檢測又能做定量檢測，已成為國內(nèi)實驗室日常使用的檢測技術(shù)。黃曲霉毒素具有較好的脂溶性，最常采用的分析柱為C18色譜柱，為選擇最佳色譜柱分離條件，本研究選用高純度、高比表面積的硅膠材料、具有很強(qiáng)惰性、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定的InertSustain-C18(2.1 mm×150 mm，3 μm)。因此，本研究將上述溶液進(jìn)行組合來選出最佳流動相體系。結(jié)果表明，甲醇-5 mmol/L乙酸銨溶液做流動相時分離效果和靈敏度最好。在確定流動相成分后，對高效液相色譜的洗脫條件、流速及色譜柱柱溫進(jìn)行優(yōu)化，確定了1.6項的梯度洗脫條件，在28 ℃時以2.0 mL/min的流速完成儀器檢測，圖1b為5 μg/L的濃度水平下AFB1與AFM1的色譜圖。

圖1 AFB1與AFM1的HPLC-MS/MS圖(質(zhì)量濃度5 μg/L)

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化 由于AFB1和AFM1的化學(xué)結(jié)構(gòu)及相對分子質(zhì)量相似，用高效液相色譜法得到的AFB1和AFM1色譜峰為重疊狀態(tài)，分離度較差，因此，選擇HPLC-MS/MS法并優(yōu)化其質(zhì)譜條件?？紤]到乳粉樣品不易揮發(fā)以及AFB1和AFM1屬極性化合物的特性，本研究選擇離子源為ESI源。將濃度為5 μg/L的AFB1和AFM1標(biāo)準(zhǔn)溶液分別通過流動注射泵打進(jìn)質(zhì)譜分析系統(tǒng)，進(jìn)行ESI+和ESI-離子模式掃描，發(fā)現(xiàn)目標(biāo)待測物在正離子模式下自身所帶氧原子易獲得質(zhì)子，得到[M+H]+結(jié)構(gòu)響應(yīng)最高，其在負(fù)離子模式下較難失去氫離子且響應(yīng)度較差，故選擇在ESI+掃描模式下優(yōu)化AFB1和AFM1的質(zhì)譜檢測條件，獲得它們的母離子分別為313和329。在多反應(yīng)模式下，優(yōu)化AFB1和AFM1的霧化器流量、干燥器流量、接口電流、加熱塊溫度、檢測器電壓、加熱器流量等質(zhì)譜參數(shù)，使所有參數(shù)均為最優(yōu)檢測參數(shù)以得到更高的質(zhì)譜響應(yīng)。隨后將上述所得母離子打碎，尋找豐度較強(qiáng)、適合用于定量定性的碎片離子作子離子(圖2、圖3)。

圖2 二級碎片離子掃描圖

圖3 特征離子色譜圖

2.3 提取方法的優(yōu)化 AFB1和AFM1均屬于極性分子，呈弱酸性。因此，要根據(jù)乳粉樣品基質(zhì)與黃曲霉毒素具體的理化性質(zhì)，選擇合適的提取溶劑把黃曲霉毒素從復(fù)雜的樣品基質(zhì)中提取出來，同時要做到避免對共萃物的萃取。根據(jù)國內(nèi)外參考文獻(xiàn)，本研究選擇用乙腈、乙腈-水(V∶V=4∶1)、乙腈-0.1%甲酸溶液(V∶V=85∶15)、甲醇、甲醇-水(V∶V=4∶1)、甲醇-0.1%甲酸溶液(V∶V=85∶15)分別提取乳粉樣品中黃曲霉毒素并比較其回收率，結(jié)果見圖4a，在5 μg/kg的添加量水平下，乙腈回收率最高。對乙腈用量進(jìn)一步優(yōu)化，結(jié)果見圖4b，選取10 mL乙腈提取乳粉樣品最合適。

圖4 提取液對乳粉中AFM1與AFB1回收率的影響

2.4 凈化方式的優(yōu)化 根據(jù)QuEChERS前處理技術(shù)，首先用4 g無水MgSO4和1 g NaCl的鹽類初步凈化，隨后采用C18、PSA和無水硫酸鎂分別處理乳粉并通過改變各吸附劑的用量來選出回收率最高的組合。在5 μg/kg添加量下，使用20、40、60 mg的PSA、C18分別與450 mg無水硫酸鎂組合凈化乳粉樣品，所得回收率結(jié)果見圖5。對C18用量優(yōu)化，C18在40 mg時回收率最高，當(dāng)用量大于60 mg時，回收率變低。對PSA用量優(yōu)化，結(jié)果顯示隨著PSA用量的增多樣品回收率只在56%～62%范圍內(nèi)波動，并無明顯變化。之后進(jìn)一步優(yōu)化無水硫酸鎂用量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在300 mg以及600 mg添加量時回收率比450 mg的回收率低，因此本研究最終采用40 mg C18和450 mg無水硫酸鎂為乳粉中AFB1和AFM1的凈化方案，回收率更好(圖5)。

圖5 吸附劑質(zhì)量對乳粉中AFB1與AFM1回收率的影響(n=3)

2.5 基質(zhì)效應(yīng)測定 乳粉樣品溶液中常常帶有大量基質(zhì)成分，會在一定程度上對儀器分析黃曲霉毒素過程產(chǎn)生干擾，形成基質(zhì)效應(yīng)，影響儀器定量。當(dāng)前有兩種基質(zhì)效應(yīng)的評價方式:一種是得到待測物在空白溶劑中的響應(yīng)值或峰面積及其在樣品基質(zhì)中的響應(yīng)值或峰面積，通過響應(yīng)值或峰面積的比值來評價[14]，一種是通過分別繪制空白溶劑標(biāo)準(zhǔn)工作液和基質(zhì)添加標(biāo)準(zhǔn)溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線，比較兩線性方程的斜率比值來評價[15]。本研究結(jié)合實驗室實際環(huán)境選擇采用第二種評價方法，所得結(jié)果為正時，表現(xiàn)出基質(zhì)增強(qiáng)，結(jié)果為負(fù)時，表現(xiàn)出基質(zhì)抑制，計算公式如式(1)所示，數(shù)據(jù)如表2所示。

表2 基質(zhì)效應(yīng)評估結(jié)果(n=3)

(1)

可得計算結(jié)果為AFB1基質(zhì)效應(yīng)為-10.2%，AFM1基質(zhì)效應(yīng)為-15.7%，表明乳粉基質(zhì)對AFB1與AFM1的檢測結(jié)果表現(xiàn)出抑制效應(yīng)。為減弱基質(zhì)效應(yīng)，故采用基質(zhì)添加外標(biāo)法定量。

2.6 線性關(guān)系及靈敏度 以1.7項繪制的基質(zhì)添加標(biāo)準(zhǔn)曲線評估乳粉中AFB1與AFM1的線性定量關(guān)系，經(jīng)過本研究前處理方法優(yōu)化及儀器條件測定后，結(jié)果表明AFB1與AFM1在0.08～20 μg/kg范圍內(nèi)呈線性關(guān)系。以3倍信噪比(S/N)為檢出限，10倍信噪比(S/N)為定量限，見表3，檢出限均低于國家標(biāo)準(zhǔn)檢出限，r都大于0.999，表明本方法靈敏度較高，可用于實際樣品檢測。

表3 乳粉中AFB1與AFM1的線性回歸方程、檢出限及定量限

2.7 準(zhǔn)確度和精密度 使用陰性乳粉為空白樣品，分別選擇添加定量限的1倍、5倍和10倍的黃曲霉毒素，按前述方法進(jìn)行加標(biāo)回收率測定。結(jié)果見表4，乳粉中AFM1的平均添加回收率在91.5%～100.7%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在3.8%～9.6%之間；乳粉中AFB1的平均添加回收率在91.7%～99.8%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在3.2%～9.3%之間，表明方法準(zhǔn)確度良好。

表4 準(zhǔn)確度和精密度實驗結(jié)果

2.8 質(zhì)控樣品分析 將本方法應(yīng)用于檢測乳粉中AFB1以及AFM1的質(zhì)控樣品。通過對有具體特性值及不確定度的質(zhì)控樣品的檢測，以達(dá)到對檢測方法驗證的目的。所用AFB1質(zhì)控樣指定值及不確定度為0.672±0.0119 μg/kg，能力評定標(biāo)準(zhǔn)差為0.113 μg/kg；AFM1質(zhì)控樣指定值及不確定度為0.811±0.0108 μg/kg，能力評定標(biāo)準(zhǔn)差為0.173 μg/kg。每個質(zhì)控樣品重復(fù)測定3次，取3次結(jié)果平均值得: AFB1檢測值為0.558 μg/kg，采用穩(wěn)健統(tǒng)計值的統(tǒng)計方式計算Z值為-1.0；AFM1檢測值為0.711 μg/kg，計算Z值為1.6。|z|均小于2.0，表明檢測結(jié)果為滿意結(jié)果，證明本方法檢測乳粉中AFB1和AFM1的可靠性。圖6為所檢測質(zhì)控樣品的AFB1和AFM1多反應(yīng)監(jiān)測色譜圖。

圖6 乳粉質(zhì)控樣品中AFB1和AFM1的MRM色譜圖

3 討論與小結(jié)

3.1 色譜條件的建立 實驗室在進(jìn)行各類樣品基質(zhì)中黃曲霉毒素的檢測時通常選擇以乙腈[16]或甲醇[17]作流動相中的有機(jī)相，以水[18]或緩沖鹽溶液[19]作水相，有時會在流動相中加入揮發(fā)性酸[20]以增強(qiáng)黃曲霉毒素的離子化效應(yīng)，提高儀器檢測的響應(yīng)度。本研究比較了5 μg/L濃度的AFB1和AFM1混合標(biāo)準(zhǔn)溶液在乙腈與甲醇兩種有機(jī)相下的色譜行為，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙腈雖然有很好的提取效果但在淋洗過程中會造成回收率損失。本研究還對比了水和5 mmol/L乙酸銨及0.1%甲酸洗脫待測物的區(qū)別，發(fā)現(xiàn)用水做流動相時，所得色譜峰頂端分叉，儀器響應(yīng)值低，加入甲酸后并不能有效改善峰形且待測物響應(yīng)值沒有明顯提高。用乙酸銨緩沖鹽溶液做流動相時，待測物分離度和響應(yīng)值得到改善，色譜峰峰形左右對稱?？紤]到洗脫方式的影響，比較了使用甲醇-5 mmol/L乙酸銨(1∶1)等度洗脫和梯度洗脫的響應(yīng)值和分離度，結(jié)果表明使用1.6項的梯度洗脫條件能把待測物很好分離，實現(xiàn)8 min內(nèi)快速出峰。隨后優(yōu)化了流動相流速，觀察了在1.0、2.0、3.0 mL/min的流速下待測物色譜峰峰形、出峰時間及色譜柱柱壓的變化，結(jié)果顯示流速為2.0 mL/min滿足殘留檢測要求。同時優(yōu)化柱溫條件28 ℃時AFB1與AFM1在儀器響應(yīng)度最高，避免了其他方法相對較高的柱溫對色譜柱的損耗。

3.2 提取方式的優(yōu)化 國內(nèi)外的研究報道中實驗室普遍選擇將黃曲霉毒素轉(zhuǎn)移到甲醇或乙腈等易于檢測的有機(jī)溶劑中[21-22]，或用它們和水的混合溶液為提取劑來提取黃曲霉毒素[23]。由于乳粉含水量在2.5%～5%之間，為使黃曲霉毒素與提取溶劑更充分融合，本研究在提取之前選擇先用水浸潤復(fù)溶乳粉，之后比較用乙腈、乙腈-水(V∶V=4∶1)、乙腈-0.1%甲酸溶液(V∶V=85∶15)、甲醇、甲醇-水(V∶V=4∶1)、甲醇-0.1%甲酸溶液(V∶V=85∶15)分別提取乳粉樣品中黃曲霉毒素的回收率，實驗發(fā)現(xiàn)用甲醇提取乳粉時上層清液會變渾濁不清并直接影響后續(xù)氮吹定容，最終優(yōu)化乙腈用量選取10 mL乙腈提取乳粉樣品，AFB1與AFM1的提取回收率為85%～100%。

3.3 凈化方式的優(yōu)化 黃曲霉毒素的前處理技術(shù)有很多，大多數(shù)實驗室普遍選擇的專一性好、抗干擾能力強(qiáng)的免疫親和柱進(jìn)行凈化[24]，但免疫親和柱價格昂貴且有保質(zhì)期限制，還需要保存于特定的低溫環(huán)境中，在進(jìn)行前處理凈化時需消耗大量時間。另一常見的固相萃取法[25]存在操作復(fù)雜、需要大量試劑等問題。QuEChERS (quick easy cheap，effective rugged and safe)技術(shù)作為新興的樣品前處理手段已逐漸被應(yīng)用到食品添加劑、生物毒素、激素及其他越來越多的不同領(lǐng)域[26-28]。因此本研究選擇采用QuEChERS技術(shù)代替免疫親和柱的使用進(jìn)行方法優(yōu)化。為了進(jìn)一步提高萃取效率及回收率，參考國內(nèi)外文獻(xiàn)[29-30]，考慮在提取上清液中加入4 g無水MgSO4和1 g NaCl的鹽類與水充分作用進(jìn)行初步凈化，促進(jìn)水和乙腈的分離，以利于AFM1與AFB1向有機(jī)溶劑中轉(zhuǎn)移。對于乳粉中通常會存在的脂肪、糖類以及蛋白質(zhì)等干擾物質(zhì)，有文獻(xiàn)報道用C18和PSA吸附去除乳粉中的酯類、碳水化合物、色素及脂肪酸等干擾物，但是在實驗中發(fā)現(xiàn)，加入PSA并不能有效提高方法回收率，而C18和無水硫酸鎂組合時所得回收率最高。同時考察C18和無水硫酸鎂的用量，最終確定了用40 mg C18和450 mg無水硫酸鎂凈化乳粉中AFB1和AFM1，比本文參考文獻(xiàn)更節(jié)約試劑的使用。

本研究建立了QuEChERS凈化與高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法結(jié)合對乳粉中B1、M1同時進(jìn)行檢測的方法。本研究對提取液、凈化條件等方面進(jìn)行優(yōu)化，最終選取乙腈作為提取液，40 mg C18和450 mg無水硫酸鎂凈化提取液，方法定量限為0.05 μg/kg，回收率在91.5%～100.7%之間，使用本方法可以彌補現(xiàn)行國標(biāo)不能同時檢測乳粉中M1和B1的缺陷。而且本方法檢測乳粉中黃曲霉毒素簡單快速、回收率和重現(xiàn)性好，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可為日常檢測乳粉中黃曲霉毒素提供技術(shù)支持。