雞球蟲病活疫苗不同卵囊計(jì)數(shù)方法的比較

張 媛，任小俠，王秀麗，王 楠，李 建，張一幟，劉元杰，褚智菲，宋運(yùn)嬌，于慧娟，趙金羽，高 彬，劉 洋，王晨旭，張 慧，石宗昌，梁正鵬，劉麗丹，吳金香，羅玉峰*，李俊平*

(1.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081；2.齊魯青大生物制藥有限公司，山東萊陽265205；3.天津赫萊恩特生物科技有限公司，天津 301702；4.西安斯凱達(dá)生物制品有限公司，西安 710399；5.佛山市正典生物技術(shù)有限公司，廣東佛山 528138)

雞球蟲活疫苗中孢子化卵囊數(shù)直接關(guān)系到疫苗的安全及效力。我國已批準(zhǔn)的9個(gè)雞球蟲活疫苗中有7個(gè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中有卵囊計(jì)數(shù)檢驗(yàn)項(xiàng)目，但均未規(guī)定具體的計(jì)數(shù)方法，以上產(chǎn)品注冊(cè)檢驗(yàn)時(shí)提供的檢驗(yàn)操作規(guī)程均采用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板4角方格計(jì)數(shù)法進(jìn)行[1-3]。《歐洲藥典》也要求對(duì)球蟲活疫苗進(jìn)行卵囊計(jì)數(shù)檢驗(yàn)，規(guī)定選用適宜的計(jì)數(shù)板進(jìn)行卵囊計(jì)數(shù)，也未明確具體的計(jì)數(shù)方法[4]。有些國外產(chǎn)品，如捷克共和國BIOPHARM生物制品與獸藥研究所生產(chǎn)的雞球蟲活疫苗采用麥?zhǔn)嫌?jì)數(shù)板進(jìn)行卵囊計(jì)數(shù)。美國國內(nèi)球蟲活疫苗無卵囊計(jì)數(shù)檢驗(yàn)項(xiàng)[5]，如我國批準(zhǔn)進(jìn)口的由英特威美國分公司生產(chǎn)的肉雞球蟲活疫苗和種雞球蟲活疫苗[6]。

目前，雞球蟲活疫苗在采用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板4角方格計(jì)數(shù)法進(jìn)行卵囊計(jì)數(shù)檢驗(yàn)時(shí)，由于方法誤差較大，常遇到檢驗(yàn)結(jié)果不在標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定范圍內(nèi)的情況，即使同一名檢驗(yàn)員檢測(cè)同一份樣品，幾次檢驗(yàn)的結(jié)果間也不穩(wěn)定，同時(shí)會(huì)出現(xiàn)低于下限和高于上限的情況，給結(jié)果判定造成了困擾。為了解雞球蟲活疫苗常用的不同卵囊計(jì)數(shù)方法對(duì)檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性的影響，進(jìn)行了血細(xì)胞計(jì)數(shù)板4角方格法和9方格法以及麥?zhǔn)嫌?jì)數(shù)板法對(duì)3種雞球蟲活疫苗卵囊計(jì)數(shù)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)分析，從而篩選出更為穩(wěn)定、準(zhǔn)確、可靠、易操作的球蟲卵囊計(jì)數(shù)方法，為雞球蟲活疫苗卵囊計(jì)數(shù)提供可靠的技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 疫苗 疫苗Ⅰ雞球蟲病四價(jià)活疫苗(柔嫩艾美耳球蟲ETGZ株+毒害艾美耳球蟲ENHZ株+堆型艾美耳球蟲EAGZ株+巨型艾美耳球蟲EMPY株)，疫苗Ⅱ雞球蟲病三價(jià)活疫苗(柔嫩艾美耳球蟲PTMZ株+巨型艾美耳球蟲PMHY株+堆型艾美耳球蟲PAHY株)，疫苗Ⅲ雞球蟲病四價(jià)活疫苗(柔嫩艾美耳球蟲PTMZ株+毒害艾美耳球蟲PNHZ株+巨型艾美耳球蟲PMHY株+堆型艾美耳球蟲PAHY株)，均為已注冊(cè)上市產(chǎn)品。

1.2 樣品處理 樣品A為疫苗原液，樣品B為疫苗用飽和食鹽水稀釋后的稀釋液。

1.3 卵囊計(jì)數(shù) 疫苗Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ樣品A用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)；樣品B用麥?zhǔn)嫌?jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.3.1 血細(xì)胞計(jì)數(shù)板與麥?zhǔn)嫌?jì)數(shù)板計(jì)數(shù)結(jié)果比較由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所(簡(jiǎn)稱“中監(jiān)所”)的4名檢驗(yàn)員用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板4角方格法、血細(xì)胞計(jì)數(shù)板9方格法和麥?zhǔn)嫌?jì)數(shù)板法分別重復(fù)計(jì)數(shù)3種疫苗中孢子化卵囊數(shù)6次，用6次計(jì)數(shù)結(jié)果平均值計(jì)算每羽份疫苗中含有的孢子化卵囊數(shù)作為統(tǒng)計(jì)值進(jìn)行t檢驗(yàn)，分析3種計(jì)數(shù)方法的差異顯著性。P<0.05表示存在顯著性差異，P<0.01則存在極顯著性差異。

1.3.2Z比分值計(jì)算 選擇1.3.1項(xiàng)中差異小的兩種方法，由來自中監(jiān)所和全國4家球蟲疫苗生產(chǎn)企業(yè)的共16名檢驗(yàn)員分別重復(fù)計(jì)數(shù)3種疫苗中孢子化卵囊數(shù)6次。以第1～3次計(jì)數(shù)結(jié)果的平均值和6次計(jì)數(shù)結(jié)果去除極大值和極小值后剩余4次計(jì)數(shù)結(jié)果的平均值分別作為統(tǒng)計(jì)值，進(jìn)行Z比分值計(jì)算。

根據(jù)CNAS-GL02:2014 《能力驗(yàn)證結(jié)果的統(tǒng)計(jì)處理和能力評(píng)價(jià)指南》[7]中穩(wěn)健統(tǒng)計(jì)方法，測(cè)定Z比分值，用于分析各檢驗(yàn)員在總體檢測(cè)結(jié)果中所處的位置。Z比分值采用X、XM、NormIQR來確定[8]。

Z比分值計(jì)算公式：Z=(X-XM)/NormIQR

式中：Z為穩(wěn)健比分值；X為檢驗(yàn)數(shù)據(jù)；XM為中位值；NormIQR為標(biāo)準(zhǔn)化四分位距，NormIQR=0.7413×四分位間距(IQR)。

判定標(biāo)準(zhǔn)為：︱Z︱≤2為滿意結(jié)果；2<︱Z︱<3時(shí)，表示結(jié)果可疑；︱Z︱≥3為不滿意結(jié)果。

1.3.4 不同方法計(jì)數(shù)結(jié)果比較 用1.3.3項(xiàng)中變異系數(shù)最小的方法，與血細(xì)胞計(jì)數(shù)板4角方格3次平均值法對(duì)16名參比人員的檢驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行判定，計(jì)算檢驗(yàn)結(jié)果低于標(biāo)準(zhǔn)下限、符合標(biāo)準(zhǔn)和高于標(biāo)準(zhǔn)上限的概率，分析檢驗(yàn)結(jié)果符合標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定概率最高的檢驗(yàn)方法。再由中監(jiān)所的9名檢驗(yàn)員對(duì)疫苗Ⅰ采用新建立的計(jì)數(shù)方法與血細(xì)胞計(jì)數(shù)板4角方格3次平均值法進(jìn)行檢驗(yàn)，分析檢驗(yàn)結(jié)果是否符合標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定。

1.3.5 同一人員計(jì)數(shù)結(jié)果變異系數(shù)的計(jì)算 對(duì)中監(jiān)所9名檢驗(yàn)員的計(jì)數(shù)結(jié)果進(jìn)行人員內(nèi)變異系數(shù)的計(jì)算，根據(jù)1.3.4項(xiàng)中的判定結(jié)論，確定檢驗(yàn)成立的變異系數(shù)范圍。

2 結(jié)果與分析

2.1 血細(xì)胞計(jì)數(shù)板與麥?zhǔn)嫌?jì)數(shù)板比對(duì)結(jié)果及統(tǒng)計(jì)分析 每種樣品均由4名參比人員在相同條件下，分別采用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板4角方格法、血細(xì)胞計(jì)數(shù)板9方格法和麥?zhǔn)嫌?jì)數(shù)板法進(jìn)行測(cè)試。從表1可見，麥?zhǔn)嫌?jì)數(shù)板法計(jì)數(shù)結(jié)果明顯低于血細(xì)胞計(jì)數(shù)板法，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明血細(xì)胞計(jì)數(shù)板4角方格法和9方格法計(jì)數(shù)結(jié)果差異不顯著(P=0.9969)，但均顯著高于麥?zhǔn)嫌?jì)數(shù)板法計(jì)數(shù)結(jié)果(P<0.05)，故采用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板4角方格法和9方格法進(jìn)行人員比對(duì)。

表1 3種計(jì)數(shù)方法計(jì)數(shù)結(jié)果平均值

2.2Z比分值計(jì)算 根據(jù)Z比分值計(jì)算公式，計(jì)算16名參比人員每種樣品測(cè)定結(jié)果的Z值(血細(xì)胞計(jì)數(shù)板4角方格法結(jié)果見表2，血細(xì)胞計(jì)數(shù)板9方格法結(jié)果見表3)。結(jié)果顯示，16名參比人員中有10名出現(xiàn)可疑或不滿意的計(jì)數(shù)結(jié)果，將此10人的計(jì)數(shù)結(jié)果剔除，用剩余6名參比人員(編號(hào)01、02、11、13、14、15)的計(jì)數(shù)結(jié)果進(jìn)行人員間變異系數(shù)的統(tǒng)計(jì)分析。

表2 4角方格法參比人員Z比分值統(tǒng)計(jì)處理結(jié)果匯總

表3 9方格法參比人員Z比分值統(tǒng)計(jì)處理結(jié)果匯總

2.3 不同人員間計(jì)數(shù)結(jié)果變異系數(shù)計(jì)算 將2.2項(xiàng)中個(gè)別檢驗(yàn)員可疑及不滿意的檢驗(yàn)結(jié)果剔除，計(jì)算剩余6名檢驗(yàn)員之間計(jì)數(shù)結(jié)果的變異系數(shù)，結(jié)果見表4、表5，可知采用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板4角方格法進(jìn)行卵囊計(jì)數(shù)，同一樣品重復(fù)計(jì)數(shù)6次，取6次計(jì)數(shù)結(jié)果去除極大值和極小值后剩余4次計(jì)數(shù)結(jié)果的平均值進(jìn)行判定的方法變異系數(shù)(10.94%)相對(duì)較低，說明采用這種方法進(jìn)行卵囊計(jì)數(shù)，不同人員的檢驗(yàn)結(jié)果差異性相對(duì)較小。

表4 4角方格法參比人員卵囊計(jì)數(shù)結(jié)果變異系數(shù)

表5 9方格法參比人員卵囊計(jì)數(shù)結(jié)果變異系數(shù)

2.4 不同方法計(jì)數(shù)結(jié)果比較 疫苗用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板4角方格法重復(fù)計(jì)數(shù)6次后，將計(jì)數(shù)結(jié)果分別用第1～3次求平均值法，以及6次計(jì)數(shù)結(jié)果去除極值后剩余4次平均值法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)計(jì)算，結(jié)果見表6。疫苗Ⅰ的判定標(biāo)準(zhǔn)是每羽份疫苗中含有的孢子化卵囊數(shù)位于1530～1870之間為合格，疫苗Ⅱ的判定標(biāo)準(zhǔn)是每羽份疫苗中含有的孢子化卵囊數(shù)位于360～440之間為合格，疫苗Ⅲ的判定標(biāo)準(zhǔn)是每羽份疫苗中含有的孢子化卵囊數(shù)位于990～1210之間為合格，從圖1可知采用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板4角方格法進(jìn)行卵囊計(jì)數(shù)，同一樣品重復(fù)計(jì)數(shù)6次，取6次計(jì)數(shù)結(jié)果去除極大值和極小值后剩余4次計(jì)數(shù)結(jié)果的平均值進(jìn)行判定，計(jì)數(shù)結(jié)果的總體符合率要高于目前使用的4角方格法重復(fù)計(jì)數(shù)3次取平均值進(jìn)行判定的檢驗(yàn)方法。

表6 不同取值方法計(jì)算結(jié)果

圖1 兩種方法卵囊計(jì)數(shù)結(jié)果比較

中監(jiān)所9名檢驗(yàn)員用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板4角方格法對(duì)疫苗Ⅰ進(jìn)行卵囊計(jì)數(shù)，每人重復(fù)計(jì)數(shù)9次，用4角方格3次平均值法和4角方格6次去除極值后剩余4次計(jì)數(shù)結(jié)果平均值法分析計(jì)數(shù)結(jié)果，對(duì)于4角方格3次平均值法，以第1～3次的平均值作為首檢結(jié)果，如不符合規(guī)定，以第4～6次的計(jì)數(shù)結(jié)果作為重檢結(jié)果。對(duì)于4角方格6次去除極值后剩余4次計(jì)數(shù)結(jié)果平均值法，以第1～6次去除極值后剩余4次計(jì)數(shù)結(jié)果的平均值作為首檢結(jié)果，如不符合規(guī)定，以第4～9次去除極值后剩余4次計(jì)數(shù)結(jié)果的平均值作為重檢結(jié)果。從表7可見，采用每批檢品抽檢1瓶，每瓶使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板4角方格法重復(fù)計(jì)數(shù)6次，6次計(jì)數(shù)結(jié)果中去除極大值和極小值后剩余4次計(jì)數(shù)結(jié)果的平均值作為該瓶檢品卵囊計(jì)數(shù)結(jié)果，如首次檢驗(yàn)不符合規(guī)定可重檢一次的方法，可以最大程度統(tǒng)一不同人員的檢驗(yàn)結(jié)論。

表7 不同卵囊計(jì)數(shù)方法計(jì)數(shù)結(jié)果比較

2.5 同一人員多次計(jì)數(shù)結(jié)果變異系數(shù)計(jì)算 對(duì)中監(jiān)所9名檢驗(yàn)員采用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板4角方格法重復(fù)計(jì)數(shù)6次，6次計(jì)數(shù)結(jié)果去除極值后剩余4次計(jì)數(shù)結(jié)果的變異系數(shù)進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果見表8，可見6次計(jì)數(shù)結(jié)果中去除極大值和極小值后剩余4次計(jì)數(shù)結(jié)果的變異系數(shù)可作為檢驗(yàn)成立的條件，當(dāng)變異系數(shù)≤20%時(shí)檢驗(yàn)成立。

表8 去除極值后剩余4次計(jì)數(shù)結(jié)果變異系數(shù)統(tǒng)計(jì)

3 討論與結(jié)論

使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板可以直接進(jìn)行疫苗檢品卵囊計(jì)數(shù)，不需要進(jìn)行稀釋或濃縮。而麥?zhǔn)嫌?jì)數(shù)板，由于計(jì)數(shù)室位于計(jì)數(shù)板的上層，需要使用大量飽和食鹽水使卵囊漂浮于液體表面，和上層的計(jì)數(shù)室處于同一界面才可計(jì)數(shù)，用飽和食鹽水對(duì)疫苗進(jìn)行處理的過程會(huì)引入誤差，龔振興等發(fā)現(xiàn)不同濃度、不同體積的飽和食鹽水對(duì)卵囊的漂浮回收率為55%～97%[9-10]，本研究結(jié)果也表明使用麥?zhǔn)嫌?jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)結(jié)果顯著低于血細(xì)胞計(jì)數(shù)板。而且，疫苗充分混勻后卵囊在疫苗中進(jìn)行布朗運(yùn)動(dòng)，吸取的樣品更能代表整瓶檢品的質(zhì)量，而加入飽和食鹽水后，卵囊不斷上浮，很難將其充分混勻，可見，不適宜用麥?zhǔn)嫌?jì)數(shù)板代替血細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行疫苗的卵囊計(jì)數(shù)檢驗(yàn)。

血細(xì)胞計(jì)數(shù)板可以用于球蟲卵囊的定量檢測(cè)，但這種方法也存在一定的誤差，這些誤差包括技術(shù)誤差和固有誤差。技術(shù)誤差包括加樣量不準(zhǔn)確、誤把未孢子化卵囊計(jì)作孢子化卵囊、誤把疫苗中的雜質(zhì)計(jì)作卵囊等。研究結(jié)果也表明不同檢驗(yàn)員卵囊計(jì)數(shù)的熟練程度有差別，16名參比人員中有10人均出現(xiàn)了可疑或不滿意的計(jì)數(shù)結(jié)果。技術(shù)誤差可以通過規(guī)范檢驗(yàn)操作和提高檢驗(yàn)人員的熟練程度來避免或糾正，需要加強(qiáng)對(duì)檢驗(yàn)員培訓(xùn)，統(tǒng)一行業(yè)操作方法。此外，固有誤差包括計(jì)數(shù)板的精密度誤差、方法自身存在的誤差、卵囊在計(jì)數(shù)池內(nèi)分布不均勻帶來的誤差等，也是導(dǎo)致計(jì)數(shù)結(jié)果不穩(wěn)定的關(guān)鍵因素。研究結(jié)果表明，采用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板4角方格法重復(fù)計(jì)數(shù)6次，取6次計(jì)數(shù)結(jié)果中去除極大值和極小值后剩余4次計(jì)數(shù)結(jié)果的平均值計(jì)算每羽份疫苗中含有孢子化卵囊數(shù)的方法最能降低誤差對(duì)檢驗(yàn)結(jié)果的影響，使不同人員檢驗(yàn)結(jié)論的一致性更高。從試驗(yàn)數(shù)據(jù)看，血細(xì)胞計(jì)數(shù)板4角方格法與9方格法在計(jì)數(shù)結(jié)果上沒有顯著差異，但血細(xì)胞計(jì)數(shù)板4角方格法較9方格法于操作上更簡(jiǎn)便。變異系數(shù)提示對(duì)同一瓶疫苗采用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板4角方格法重復(fù)計(jì)數(shù)6次，取6次計(jì)數(shù)結(jié)果中去除極大值和極小值后剩余4次計(jì)數(shù)結(jié)果的平均值計(jì)算每羽份疫苗中含有孢子化卵囊數(shù)的方法較目前使用的重復(fù)計(jì)數(shù)3次取平均值進(jìn)行計(jì)算的方法，人員間的差異更小，是較為理想的一種卵囊計(jì)數(shù)法。在今后的工作中應(yīng)針對(duì)此方法建立標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，統(tǒng)一操作細(xì)節(jié)，規(guī)范操作手法，開展長(zhǎng)期的、多次的比對(duì)活動(dòng)，獲取更多實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，從而提升球蟲類活疫苗卵囊計(jì)數(shù)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

目前國內(nèi)雞球蟲病活疫苗卵囊計(jì)數(shù)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定得較為嚴(yán)苛，王鵬等人與第三方檢測(cè)機(jī)構(gòu)對(duì)8批雞球蟲病疫苗進(jìn)行了卵囊計(jì)數(shù)，自檢與第三方機(jī)構(gòu)檢測(cè)結(jié)果均僅有25%的結(jié)果處于疫苗參考標(biāo)準(zhǔn)±10%的范圍內(nèi)[11]。疫苗計(jì)數(shù)結(jié)果的變異系數(shù)只有限定在10%以內(nèi)才能保證計(jì)數(shù)結(jié)果處于疫苗參考標(biāo)準(zhǔn)±10%的范圍內(nèi)，而目前所使用的采用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板4角方格法重復(fù)計(jì)數(shù)3次求平均值的檢驗(yàn)方法，不同人員間的變異系數(shù)為12.25%，高于10%，以致會(huì)出現(xiàn)不同人員采用這種方法對(duì)同一產(chǎn)品進(jìn)行檢驗(yàn)，檢驗(yàn)結(jié)果不穩(wěn)定的情況。即使在改進(jìn)方法后，采用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板4角方格法重復(fù)計(jì)數(shù)6次，取6次計(jì)數(shù)結(jié)果中去除極大值和極小值后剩余4次計(jì)數(shù)結(jié)果的平均值計(jì)算每羽份疫苗中含有孢子化卵囊數(shù)的方法進(jìn)行卵囊計(jì)數(shù)，把不宜作為統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)的偏離結(jié)果去掉，不同人員間的變異系數(shù)(10.94%)有所降低，但仍要高于10%。國外產(chǎn)品，如捷克共和國BIOPHARM生物制品與獸藥研究所生產(chǎn)的雞球蟲病三價(jià)活疫苗，其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求每羽份含有每種球蟲卵囊數(shù)為300～500，即每羽份含有的球蟲卵囊數(shù)是900～1500，標(biāo)準(zhǔn)變異系數(shù)約為25%。在和企業(yè)檢驗(yàn)員溝通過程中也發(fā)現(xiàn)，其在檢驗(yàn)過程中如出現(xiàn)較高或較低的數(shù)據(jù)會(huì)進(jìn)行舍棄，在本研究中不進(jìn)行數(shù)據(jù)的挑選，16名參比人員采用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板4角方格3次平均值法，檢品一次檢驗(yàn)合格率僅為33.3%，改用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板4角方格法重復(fù)計(jì)數(shù)6次，取6次計(jì)數(shù)結(jié)果中去除極大值和極小值后剩余4次計(jì)數(shù)結(jié)果的平均值法后檢品一次檢驗(yàn)合格率提升為43.7%。中監(jiān)所9名檢驗(yàn)員方法改進(jìn)前后一次檢驗(yàn)合格率可由44.4%(4/9)提升到88.9%(8/9)，必須進(jìn)行重檢才可達(dá)到100%(9/9)的檢驗(yàn)合格率?？梢姡瑱z驗(yàn)方法對(duì)檢驗(yàn)結(jié)論有著決定性影響，為提升檢驗(yàn)結(jié)論的可重復(fù)性，建議把卵囊計(jì)數(shù)方法收錄至中國獸藥典中，以便統(tǒng)一方法和操作，提升卵囊計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確性。同時(shí)，進(jìn)一步修訂我國雞球蟲病活疫苗卵囊計(jì)數(shù)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(如參考標(biāo)準(zhǔn)±20%)，增加其科學(xué)性和合理性。