東南景天轉(zhuǎn)運(yùn)Cd 蛋白HMA3 基因載體的構(gòu)建及欒樹(shù)遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立

周韜，白 磊，何其浩，王平

（中南林業(yè)科技大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410004）

林木轉(zhuǎn)基因研究起始于20 世紀(jì)80 年代末[1]，開(kāi)始主要是利用一些標(biāo)簽基因研究樹(shù)木的轉(zhuǎn)化。隨著基因技術(shù)的發(fā)展，進(jìn)入90 年代后，具有技術(shù)價(jià)值的基因如抗蟲(chóng)、抗除草劑基因陸續(xù)被導(dǎo)入到一些林木中。植物基因工程技術(shù)在林木中的應(yīng)用彌補(bǔ)了常規(guī)育種周期長(zhǎng)、定向改良難以控制、遠(yuǎn)緣雜交或種間雜交難以實(shí)現(xiàn)的困難與不足[1]。但樹(shù)木生長(zhǎng)在開(kāi)放的自然環(huán)境中會(huì)遇到各種惡劣的環(huán)境，如重金屬、高鹽堿等。因此，抗環(huán)境脅迫的基因工程成為林木遺傳改良的重要領(lǐng)域[2]。木本植物穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化涉及基因組整合與再生過(guò)程，目的在于使外源基因不僅能在后代植株中穩(wěn)定表達(dá)，還需具備遺傳特性，從而研究某種基因功能或改良某種植物性狀[3]。目前針對(duì)林木進(jìn)行了遺傳轉(zhuǎn)化體系的研究，有農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法、基因槍轉(zhuǎn)化、電穿孔法和PEG 誘導(dǎo)法轉(zhuǎn)化等[4]。農(nóng)桿菌介導(dǎo)法以其費(fèi)用低、拷貝數(shù)低、重復(fù)性好、基因沉默現(xiàn)象少、轉(zhuǎn)育周期短及能轉(zhuǎn)化較大片段等獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)而備受科學(xué)工作者的青睞[5]。Cd 污染危害植物根系，造成根系生理代謝失調(diào)，生長(zhǎng)受到抑制[6]。欒樹(shù)因其根系發(fā)達(dá)、環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)，研究者將其應(yīng)用于重金屬污染土壤的修復(fù)并取得了良好的效果[7]。同一植物對(duì)不同重金屬富集量也不同，如重金屬在土壤—檜柏Sabina chinensis系統(tǒng)中的富集能力依次為 鎘（Cd）＞鋅（Zn）＞汞（Hg）＞鉛（Pb）[8]。造成植物體內(nèi)重金屬含量不同的原因有很多，從根向地上部運(yùn)輸能力的差異是其中之一[9]。由于植物組織對(duì)重金屬的轉(zhuǎn)移和運(yùn)輸具有一種屏蔽作用，能阻止重金屬?gòu)牡叵虏肯虻厣喜哭D(zhuǎn)移，所以一般認(rèn)為，重金屬在植物器官中的累積量為根＞莖＞葉[10]。欒樹(shù)同樣存在這個(gè)問(wèn)題，富集的Cd 大量存在于根部，很難向地上部運(yùn)輸[11]，且欒樹(shù)的生長(zhǎng)周期緩慢，很難短時(shí)間對(duì)Cd 重污染地區(qū)產(chǎn)生影響。HMA家族基因（Heavy metal ATPase）中的HMA基因是P1B-ATPase 家族的成員[11]，目前對(duì)該家族基因的研究多集中在HMA2/HMA3/HMA4上，且以擬南芥和水稻等植物為主。AtHMA3主要介導(dǎo)Cd 和Pb 的轉(zhuǎn)運(yùn)，通過(guò)酵母互補(bǔ)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其能互補(bǔ)Cd/Pb 敏感型菌株ycf1，而不能互補(bǔ)Zn 敏感型菌株zrc1[12]。AtHMA3基因主要定位于液泡膜上，過(guò)表達(dá)后植物體內(nèi)Cd 含量比野生型增加了2～3 倍，說(shuō)明AtHMA3主要通過(guò)將Cd等重金屬轉(zhuǎn)運(yùn)至液泡里，從而起到解毒的作用[13]。Morel等[14]利用QTL 方法從低累積Cd 的水稻中定位到一個(gè)OsHMA3基因，他是一個(gè)特異性的Cd轉(zhuǎn)運(yùn)基因，主要在根部表達(dá)，通過(guò)將Cd 轉(zhuǎn)運(yùn)到根部細(xì)胞的液泡中儲(chǔ)存，從而減少了Cd 向地上部轉(zhuǎn)運(yùn)。上述研究表明，HMA基因在植物對(duì)重金屬的轉(zhuǎn)運(yùn)和解毒，特別是在維持鋅鎘等重金屬在細(xì)胞中的穩(wěn)態(tài)過(guò)程中起到了非常關(guān)鍵的作用。因此，本研究計(jì)劃構(gòu)建欒樹(shù)遺傳轉(zhuǎn)化體系并將超轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白HMA3 轉(zhuǎn)入欒樹(shù)，以實(shí)現(xiàn)欒樹(shù)的定向改良，使其對(duì)Cd 的富集能力和轉(zhuǎn)運(yùn)能力獲得顯著提升。

1 材料與方法

1.1 材料

基因型分析內(nèi)參為番茄，轉(zhuǎn)化受體材料為復(fù)羽葉欒樹(shù)；轉(zhuǎn)化菌株為農(nóng)桿菌LBA4404；轉(zhuǎn)化載體為pCAMBIA1302[15]。

1.2 流式細(xì)胞術(shù)對(duì)欒樹(shù)進(jìn)行基因型分析

將樣品置于0.8 mL預(yù)冷的MGb解離液（45 mM MgCl2·6H2O,20 mM MOPS,30 mM 檸檬酸鈉,1%(W/V) PVP 40，0.2% (V/V) Tritonx-100，10 mM Na2EDTA,20 μL/mLβ-巰基乙醇，pH 值7.5）中，用刀片將組織切碎，使其在解離液中冰上靜置10 min，然后用400 目濾網(wǎng)過(guò)濾，即得到細(xì)胞核懸浮液。在細(xì)胞核懸液中加入適當(dāng)體積的預(yù)冷的碘化丙啶（Propidium iodide，PI）（母液濃度1 mg/mL）和適當(dāng)體積的RNAase 溶液（母液濃度1 mg/mL），置于冰上避光染色0.5～1 h。PI 染液和RNAase溶液的工作濃度均為50 μg/mL。

以番茄為內(nèi)參，將待測(cè)樣品的懸液和內(nèi)參樣品的懸液按適當(dāng)比例混合。利用BD FACScalibur流式細(xì)胞儀對(duì)染色后的細(xì)胞核懸浮液樣品上機(jī)檢測(cè)，采用488 nm 藍(lán)光激發(fā)，檢測(cè)碘化丙啶的發(fā)射光熒光強(qiáng)度，每次檢測(cè)收集10 000 個(gè)顆粒。變異系數(shù)CV%控制在5%以內(nèi)，使用Modifit 3.0 分析軟件作圖分析。

1.3 轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建

以從超富集東南景天Sedum alfrediiHance 中提取的RNA 為模板（PureLink RNA 小量試劑盒），逆轉(zhuǎn)錄得到超富集東南景天的cDNA 文庫(kù)（SureScriptTMcDNA 第一條鏈合成試劑盒），設(shè)計(jì)特異性Cd 轉(zhuǎn)運(yùn)HMA3基因序列（KM376975.1）的引物（F:5′ATGGATTCTGGATTGGATGAAGTCA3′，R：5′GGCATCCATCTGGCCTTTCGTCTTA3′），以cDNA 為模板，使用高保真酶KODFX(Takara)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，獲得超富集東南景天HMA3基因CDS 序列。BgI Ⅱ和Spe Ⅰ雙酶切PCR 純化產(chǎn)物及pCAMBIA1302 表達(dá)載體，然后通過(guò)DNA 連接酶進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)入大腸桿菌TOP10 體內(nèi)，通過(guò)篩選克隆、酶切檢測(cè)以及測(cè)序分析獲得正確的HMA3基因的表達(dá)載體。最后轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404 感受態(tài)，于-80℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 愈傷組織的誘導(dǎo)及繼代

1.4.1 復(fù)羽葉欒樹(shù)種子萌發(fā)

將過(guò)6 目篩的欒樹(shù)種子進(jìn)行65%～75%濃硫酸浸泡3～4 min 后，60 g/L 的碳酸氫鈉溶液反復(fù)清洗種子徹底中和濃硫酸，再利用60 g/L 的碳酸氫鈉水溶液浸泡種子10～12 min，然后對(duì)種子進(jìn)行消毒處理：70%乙醇50 s，0.1%升汞2～10 min，無(wú)菌水沖洗3 次以上獲得無(wú)菌種子，最后將沖洗好的種子放到滅菌濾紙上晾干5 min。在每個(gè)倒有促萌發(fā)培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中放入3～4 粒種子，放入培養(yǎng)箱（23±1℃）中光照培養(yǎng)，光照周期16/8，光照強(qiáng)度為40 μmolm-2s-1。經(jīng)過(guò)7 d 的培養(yǎng)，發(fā)芽成為無(wú)菌苗。（促萌發(fā)固體培養(yǎng)基為DKW基本培養(yǎng)基，6-BA，2.0 mg/L，NAA，0.4 mg/L，GA3，0.4 mg/L）。

1.4.2 復(fù)羽葉欒樹(shù)愈傷組織的誘導(dǎo)

將無(wú)菌苗切割，其中莖段與根系切割為0.5～1 cm，轉(zhuǎn)入愈傷組織快速誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行誘導(dǎo)，培養(yǎng)基設(shè)定添加聚乙烯吡咯烷酮（PVP）100 mg/L與無(wú)PVP，以及設(shè)定吲哚丁酸（IBA）、萘乙酸（2,4-D）、椰汁含量?jī)?yōu)化欒樹(shù)愈傷組織培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)箱（23±1℃）、黑暗環(huán)境下培養(yǎng)。經(jīng)過(guò)21 d 的黑暗誘導(dǎo)，挑選愈傷組織，用鑷子輕輕分為3 份，轉(zhuǎn)入新的繼代培養(yǎng)基中培養(yǎng)10～30 d。

1.5 農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化體系建立

從固體劃線平板上挑取已轉(zhuǎn)化pCAMBIA1302-HMA3農(nóng)桿菌LBA4404 單克隆菌株，對(duì)欒樹(shù)愈傷組織進(jìn)行侵染轉(zhuǎn)化具體操作步驟參考《植物基因工程》[16]。將抗性愈傷繼代增殖培養(yǎng)形成成熟的愈傷塊，繼代培養(yǎng)基設(shè)定細(xì)胞分裂素（6-BA），IBA、噻苯?。═DZ）含量?jī)?yōu)化欒樹(shù)繼代培養(yǎng)。將兩輪篩選后的愈傷組織轉(zhuǎn)移到不定芽分化培養(yǎng)基中，培養(yǎng)20～40 d 出現(xiàn)新的芽點(diǎn)，繼而轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)生根。待幼苗長(zhǎng)出較為發(fā)達(dá)的根系后進(jìn)行移栽煉苗，除繼代培養(yǎng)基外其他培養(yǎng)基配方參考傳統(tǒng)植物組培培養(yǎng)基配方[17-18]。

1.6 轉(zhuǎn)基因植株的檢測(cè)

1.6.1 目的基因PCR 檢測(cè)

剪去植株的幼嫩葉片，液氮研磨，利用RNAprep Pure 多糖多酚植物總RNA 提取試劑盒提取欒樹(shù)抗性篩選后的愈傷組織RNA，PrimeScript ?II 1st Strand cDNA Synthesis Kit cDNA 合成試劑盒（TaKaRa 公司）逆轉(zhuǎn)錄cDNA 作為模板，利用Premier5 設(shè)計(jì)目的基因東南景天HMA3（AJF37113.1）轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白引物，利用高保真酶進(jìn)行PCR 克隆，反應(yīng)條件：98℃2 min；98℃10 s，55℃30 s，72℃1 min，35 個(gè)循環(huán)，瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證目的基因已順利插入欒樹(shù)基因轉(zhuǎn)錄組。

1.6.2 欒樹(shù)原生質(zhì)體制備及激光共聚焦觀測(cè)GFP表達(dá)

取4 g 篩選后的愈傷組織，用鑷子輕輕搗碎，于30 mL 酶解前溶液漂洗3次，每次5min。（酶解前溶液：0.4MD-Mannitol、20 mM MES）。用孔徑為0.15 mm 的濾網(wǎng)過(guò)濾溶液，將愈傷組織轉(zhuǎn)移至酶解液中（酶解液：20 mM MES、0.4M D-Mannitol、20 mM KCl、0.40% macerozyme R-10、1.50% Cellulase R-10，加ddH2O 至10 mL，用KOH 調(diào)pH 值至5.7，55℃，10 min，冷卻至室溫后加入隨后試劑至終濃度，10 mM CaCl2，0.1%BSA。加ddH2O 至30 mL）。錫紙包裹避光，于搖床中26 ℃、50 rpm 下?lián)u蕩，酶解6～10 h，去除離心管上層液2 mL。用孔徑為0.15 mm 濾網(wǎng)過(guò)濾，盡量減少濾液流動(dòng)距離，動(dòng)作輕柔，用等體積W5溶液（154 mM NaCl，125 mM CaCl2，5 mM KCl，5 mM glucose，0.03% MES，KOH調(diào)pH值至5.8，高溫高壓滅菌20 min，4℃）可保存一個(gè)月，可以保持原生質(zhì)體的滲透壓，防止原生質(zhì)體破裂。清洗離心管及濾渣至酶解后溶液中，終止反應(yīng)。去除濾渣，得到濾液后在顯微鏡觀察完整細(xì)胞比例，在激光共聚焦下觀測(cè)細(xì)胞中GFP 的瞬時(shí)表達(dá)。

1.7 轉(zhuǎn)基因欒樹(shù)Cd 吸附能力檢測(cè)

將轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性的欒樹(shù)幼苗與未轉(zhuǎn)基因的欒樹(shù)幼苗進(jìn)行相同程度的Cd 脅迫處理。20 mg/L 處理7 d 后用HNO3-HClO4濕法消解測(cè)定。用自來(lái)水清洗干凈后用超純水潤(rùn)洗，將新鮮的根、新長(zhǎng)的嫩莖和葉分開(kāi)。放入烘箱中105℃下殺青30 min 后將溫度降至80℃，烘干至恒質(zhì)量。用粉碎機(jī)粉碎，裝袋保存。稱取0.5 g 粉碎的植物樣品于100 mL三角瓶中，加入5 mL 濃硝酸，蓋上彎頸漏斗，搖勻后靜置過(guò)夜。次日，置于電熱板上，在通風(fēng)櫥180℃下加熱30 min，每30 min 升高5℃，至4 h后棕色氣體基本趕完。取下三角瓶冷卻，加1.5 mL高氯酸，電熱板升高溫度至200℃加熱1～2 h 產(chǎn)生濃白煙揮發(fā)大部分高氯酸，至三角瓶中溶液為無(wú)色透明，植物殘?jiān)鼮榘咨∠吕鋮s。用去離子水過(guò)濾，定容于50 mL 的容量瓶，轉(zhuǎn)至75 mL小白瓶，根據(jù)樣品中各待測(cè)元素含量和儀器的最低檢測(cè)限值適當(dāng)稀釋，最后用原子吸收分光光度計(jì)測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)羽葉欒樹(shù)基因組大小分析

碘化丙啶是一種熒光染料，能均勻地嵌入到雙鏈核酸堿基對(duì)中，因此可以對(duì)DNA 進(jìn)行特異性染色。在488 nm 激發(fā)光下，PI 發(fā)出的熒光可被流式細(xì)胞儀檢測(cè)。并且，PI 在著色過(guò)程中的嵌入量與DNA 量成正比，故熒光強(qiáng)度可以表示出基因組DNA 的相對(duì)含量。觀察待測(cè)樣品和對(duì)照植物PIDNA 復(fù)合體的熒光峰值，即可得出2 種植物DNA含量的比值，再乘以內(nèi)參植物的C 值，即可計(jì)算出待測(cè)植物的C 值。即計(jì)算公式：待測(cè)樣品DNA含量=內(nèi)參DNA 含量×待測(cè)樣品的熒光強(qiáng)度/內(nèi)參樣品的熒光強(qiáng)度。根據(jù)圖1 可知，測(cè)定3 組生物學(xué)重復(fù)欒樹(shù)葉片樣品，Modifit 3.0 計(jì)算峰圖面積得出樣品吸光度分別為20.32、21.62、20.28，剔除可能因采樣手段或樣品自身病變?cè)斐傻恼`差數(shù)據(jù)21.62，根據(jù)與內(nèi)參番茄相比可知欒樹(shù)基因組的大小為335 Mb 左右（表1 和圖1）。欒樹(shù)的基因型為2n=32[19]。較小的基因組以及二倍體的特性決定了欒樹(shù)有較好的遺傳性，插入的外源基因更不容易丟失，預(yù)示著復(fù)羽葉欒樹(shù)品種具有基因工程改良可能性，尤其是對(duì)于景觀栽培花色改良或環(huán)境應(yīng)用修復(fù)植物品種選育都具有應(yīng)用前景。

圖1 欒樹(shù)基因組大小結(jié)果直方圖Fig.1 Histogram of the Koelreuteria paniculata genome size

表1 欒樹(shù)相較于番茄基因組結(jié)果Table 1 Koelreuteria paniculata genome versus tomato genome

2.2 表達(dá)載體HMA3+pCAMBIA1302 的獲得

通過(guò)高保真酶PCR 擴(kuò)增HMA3基因（ID：KM376975.1），將該基因通過(guò)雙酶切與酶連反應(yīng)，連接到pCAMBIA1302 載體上，目的基因插入載體位置及該載體功能組件如圖2 所示。該載體具有潮霉素（Hyg）與卡那霉素（Kan）篩選位點(diǎn)，在農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化步驟可利用Kan 抗性篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌。植物組培階段可利用Hyg 抗性篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化組培植株，目的基因尾端連接有熒光蛋白（GFP）融合表達(dá)可用于后續(xù)的激光共聚焦觀察目的基因在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)細(xì)胞器部位分析表達(dá)模式。由此可見(jiàn)，該載體非常適用于植物的遺傳轉(zhuǎn)化構(gòu)建，可縮短轉(zhuǎn)化篩選步驟時(shí)間周期，且有利于后期基因表達(dá)純化及功能研究。轉(zhuǎn)入大腸桿菌T10 中獲得大量載體拷貝，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗(yàn)證（圖3），酶切后的目的基因大小為2 401 bp，符合東南景天HMA3基因大小，其余熒光片段為載體片段大于5 000 bp，進(jìn)一步對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序比對(duì)，確定質(zhì)粒序列、堿基序列無(wú)移碼突變，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

圖2 pCAMBIA1302 質(zhì)粒圖譜Fig.2 pCAMBIA1302 plasmid

圖3 pCAMBIA1302 質(zhì)粒酶切驗(yàn)證Fig.3 Validation of the digestion of pCAMBIA1302 plasmids

2.3 農(nóng)桿菌介導(dǎo)欒樹(shù)遺傳轉(zhuǎn)化

木本植物遺傳轉(zhuǎn)化效率普遍較低，嚴(yán)重阻礙了木本植物的轉(zhuǎn)基因工作開(kāi)展。為了提高欒樹(shù)的轉(zhuǎn)化效率，對(duì)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的欒樹(shù)遺傳轉(zhuǎn)化體系中的培養(yǎng)基配方進(jìn)行了系統(tǒng)優(yōu)化，該體系可高效且穩(wěn)定地獲得欒樹(shù)遺傳轉(zhuǎn)化幼苗（圖4）。相對(duì)于已有報(bào)道的傳統(tǒng)植物培養(yǎng)基，本研究對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基與轉(zhuǎn)化后愈傷組織繼代培養(yǎng)基配方進(jìn)行了大幅度的優(yōu)化，使欒樹(shù)愈傷組織形成與農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)可穩(wěn)定獲得目的基因轉(zhuǎn)化植株。在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加聚乙烯吡咯烷酮（PVP）防止愈傷組織褐化，而相較于未加 PVP 組欒樹(shù)，愈傷組織的抗褐化能力有了明顯的提升（圖5），每10 瓶欒樹(shù)愈傷組織培養(yǎng)過(guò)程中未添加PVP 出現(xiàn)個(gè)體愈傷組織褐化率約為56.1%，添加后降低至33.1%，PVP 極顯著降低了愈傷組織褐化率。0.25 mg/L IBA，1.0 mg/L 2,4-D 及10%的椰汁，使得欒樹(shù)愈傷組織的誘導(dǎo)成功率與繼代成長(zhǎng)速度都有了明顯的提升，同時(shí)有效地減少了在潮霉素抗性篩選培養(yǎng)基中的玻璃化幼苗的產(chǎn)生（表2～3）?？梢?jiàn)，優(yōu)化后的培養(yǎng)基對(duì)于欒樹(shù)遺傳轉(zhuǎn)化體系的構(gòu)建明顯優(yōu)于傳統(tǒng)植物組織培養(yǎng)基，提高愈傷組織獲得效率，降低了抗性篩選過(guò)程中對(duì)欒樹(shù)轉(zhuǎn)化后的愈傷組織的消耗。

表2 欒樹(shù)愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基Table 2 Callus induction medium of Koelreuteria paniculata

圖4 欒樹(shù)遺傳轉(zhuǎn)化體系培育動(dòng)態(tài)Fig.4 Dynamic diagram of Koelreuteria paniculata culture in the genetic transformation system

圖5 欒樹(shù)愈傷組織褐化率Fig.5 Callus browning rate of Koelreuteria paniculata

2.4 轉(zhuǎn)基因植株的激光共聚焦檢測(cè)，PCR 檢測(cè)及陽(yáng)性苗的獲得

將經(jīng)過(guò)抗性篩選的部分陽(yáng)性愈傷組織制備成原生質(zhì)體，并在激光共聚焦顯微鏡下觀察，結(jié)果如圖6 所示。目的基因與GFP 為融合表達(dá)基因，且HMA3 為跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，在激光共聚焦下GFP發(fā)出綠色熒光，其表達(dá)模式與目的基因一致，都在欒樹(shù)原生質(zhì)體細(xì)胞膜附近。以獲得的抗性轉(zhuǎn)化苗的葉片總DNA 為模板，以AJF37113.1F/R為引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增反應(yīng)，分別取PCR 產(chǎn)物5 μL，采用1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖7 所示，共檢測(cè)隨機(jī)植株17 株，其中可以擴(kuò)增出HMA3基因的有5 株，據(jù)此獲得的陽(yáng)性率即成功表達(dá)HMA3基因植株得率為29.4%。同時(shí)激光共聚焦結(jié)果表明，東南景天HMA3基因在欒樹(shù)細(xì)胞中的表達(dá)具有相同的表達(dá)模式即細(xì)胞膜表達(dá)，進(jìn)一步說(shuō)明該基因的生物學(xué)功能可能會(huì)在欒樹(shù)中產(chǎn)生相關(guān)表型。

圖6 欒樹(shù)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化愈傷組織原生質(zhì)體GFP 激光共聚焦亞細(xì)胞定位Fig.6 Subcellular localization of the positive callus protoplasts of Koelreuteria paniculata observed by GFP laser confocal

圖7 欒樹(shù)轉(zhuǎn)化再生植株P(guān)CR 檢測(cè)結(jié)果Fig.7 PCR detection results of the transformed Koelreuteria paniculata plants

2.5 轉(zhuǎn)基因欒樹(shù)Cd 富集能力檢測(cè)

表3 欒樹(shù)轉(zhuǎn)化愈傷組織繼代培養(yǎng)基Table 3 Medium for the subculture of Koelreuteria paniculata callus

欒樹(shù)作為對(duì)Cd 有一定富集能力的木本植物，其本身對(duì)Cd 吸收后主要富集于地下部分，即主要位于根部，較難向地上部運(yùn)輸。特別是隨著Cd 濃度的升高，其轉(zhuǎn)運(yùn)能力進(jìn)一步降低[15]。轉(zhuǎn)入HMA3基因后，轉(zhuǎn)基因欒樹(shù)獲得了更強(qiáng)的富集能力與轉(zhuǎn)運(yùn)能力。相較于陰性對(duì)照，其整體富集Cd 含量增加了40.3%，根部富集Cd 含量增加了26.2%，且地上部（莖、葉）的Cd 含量占比相較于陰性對(duì)照提升了62.9%。欒樹(shù)對(duì)Cd 的富集系數(shù)（Bioconcentration factors,BCF，為欒樹(shù)體內(nèi)Cd 含量除以水培液中的Cd 含量）提升了40.3%；轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)（Translocation factors,TF，為欒樹(shù)地上部Cd含量除以地下部的Cd 含量）提升了29.3%（表4）。這些結(jié)果表明轉(zhuǎn)入HMA3基因的欒樹(shù)幼苗有更強(qiáng)的富集能力和轉(zhuǎn)運(yùn)能力，該結(jié)果證明了東南景天HMA3 蛋白在欒樹(shù)中同樣行使了Cd 轉(zhuǎn)運(yùn)功能，且使欒樹(shù)富集系數(shù)與轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)發(fā)生了顯著性變化。然而與同生物量草本植物相比仍然處于劣勢(shì)，這可能是由于植物響應(yīng)Cd 脅迫反應(yīng)并非點(diǎn)反應(yīng)，而是復(fù)雜的基因網(wǎng)絡(luò)調(diào)控響應(yīng)，木本植物與草本植物相比仍然具有較大差異。因此，東南景天HMA3基因在欒樹(shù)細(xì)胞內(nèi)并沒(méi)有完全發(fā)揮特異性轉(zhuǎn)運(yùn)Cd的生物學(xué)功能。

表4 欒樹(shù)根、莖、葉中Cd 濃度及其亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)分布?Table 4 Cd concentration and subcellular structure distribution in roots,stems and leaves of Koelreuteria paniculata

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

重金屬植物修復(fù)技術(shù)因其低成本和無(wú)害化而被廣泛應(yīng)用，植物修復(fù)應(yīng)用于重金屬的修復(fù)技術(shù)可分為3 個(gè)類型，植物提取、植物揮發(fā)、植物穩(wěn)定。欒樹(shù)是我國(guó)南方地區(qū)一種常見(jiàn)的綠化樹(shù)種，因其根系發(fā)達(dá)、環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)，研究者將其應(yīng)用于重金屬污染土壤的修復(fù)并取得了良好的效果。在湘潭錳礦區(qū)成功建成以欒樹(shù)為修復(fù)樹(shù)種的生態(tài)修復(fù)基地，開(kāi)創(chuàng)了我國(guó)欒樹(shù)修復(fù)重金屬礦區(qū)的先例。選用欒樹(shù)、千頭柏、棕櫚、灑金柏等植物進(jìn)行土培試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)欒樹(shù)對(duì)重金屬礦渣土壤基質(zhì)的適應(yīng)性很強(qiáng)，是用于重金屬礦渣廢棄地生態(tài)修復(fù)的理想樹(shù)種。

然而，欒樹(shù)卻很難將地下部分（根部）富集的Cd 轉(zhuǎn)運(yùn)至地上部分（莖，葉），無(wú)法發(fā)揮其生物量大的優(yōu)勢(shì)。本研究組前期轉(zhuǎn)錄組分析研究表明，欒樹(shù)響應(yīng)Cd 脅迫主要通過(guò)根系的吸附作用實(shí)現(xiàn)，其分子機(jī)理可能是欒樹(shù)根系具有響應(yīng)Cd脅迫分泌根系代謝物，螯合Cd 離子阻遏進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，且轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)顯示欒樹(shù)并不具有特異性高表達(dá)響應(yīng)Cd 脅迫的金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，這與大部分高抗性木本植物研究報(bào)道的結(jié)果一致[20-22]，因此，欒樹(shù)具有較強(qiáng)的Cd 抗性而不具備高富集性的分子機(jī)制。欒樹(shù)作為環(huán)境修復(fù)植物的應(yīng)用雖具有生態(tài)修復(fù)的主要承載體價(jià)值[23]，卻缺乏高效修復(fù)的屬性。隨著基因工程的發(fā)展，篩選利用特異性Cd 轉(zhuǎn)運(yùn)基因?qū)铇?shù)的富集表型改造將有利于解決這一問(wèn)題。

首先通過(guò)對(duì)比番茄的基因組，發(fā)現(xiàn)欒樹(shù)的基因組大小為335 Mb 左右，具有較小的基因組以及二倍體的特性，使得欒樹(shù)在遺傳轉(zhuǎn)化上有著更大的優(yōu)勢(shì)。然而，林木轉(zhuǎn)基因技術(shù)的難題主要在不定芽與不定根的誘導(dǎo)[24]以及目的基因的準(zhǔn)確表達(dá)，我們通過(guò)優(yōu)化培養(yǎng)基的激素配比，同時(shí)在其中加入PVP 預(yù)防褐化，成功誘導(dǎo)形成了欒樹(shù)愈傷組織，并誘導(dǎo)其長(zhǎng)出不定芽與不定根，說(shuō)明本研究的激素配方適宜欒樹(shù)的無(wú)性繁殖體系，這有力地保障了欒樹(shù)快繁的同時(shí)，使得轉(zhuǎn)化基因的穩(wěn)定遺傳成為可能。轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白HMA 家族是一種對(duì)重金屬特異性很強(qiáng)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，通過(guò)轉(zhuǎn)運(yùn)金屬離子參與細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)調(diào)節(jié)，其中擬南芥中的AtHMA3主要介導(dǎo)Cd 與Pb 的轉(zhuǎn)運(yùn)。東南景天同樣具有特異性Cd轉(zhuǎn)運(yùn)富集的HMA3基因，且僅存在于超富集東南景天中，該基因在東南景天中的生物學(xué)功能主要表現(xiàn)為將地下部的Cd 離子轉(zhuǎn)運(yùn)至地上部，并且通過(guò)跨膜運(yùn)輸富集于植物液泡中，使得超富集東南景天具有高富集性的同時(shí)具有高Cd 抗性[25]。因此，本研究成功克隆了超富集東南景天Cd 特異性的超轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白HMA3基因，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方式轉(zhuǎn)入欒樹(shù)愈傷組織，通過(guò)篩選培養(yǎng)，選育陽(yáng)性幼苗，以及表達(dá)模式分析得出草本植物東南景天的HMA3基因在欒樹(shù)中同樣具有表達(dá)與Cd 轉(zhuǎn)運(yùn)生物學(xué)功能。最后對(duì)轉(zhuǎn)基因欒樹(shù)Cd 脅迫試驗(yàn)可以得出，轉(zhuǎn)入HMA3基因的欒樹(shù)幼苗，對(duì)Cd 的富集能力，由地下部轉(zhuǎn)移至地上部的能力均有顯著提升，但是相較于超富集草本植物，其相同生物量的富集系仍然較低，說(shuō)明木本植物存在復(fù)雜的Cd 脅迫響應(yīng)機(jī)制，并非改變轉(zhuǎn)運(yùn)基因就能獲得相同的轉(zhuǎn)運(yùn)效率與富集量，因此，欒樹(shù)的Cd 脅迫響應(yīng)機(jī)制的揭示有待進(jìn)一步研究。

3.2 結(jié)論

本研究建立了由農(nóng)桿菌介導(dǎo)的欒樹(shù)遺傳轉(zhuǎn)化體系，其最佳轉(zhuǎn)化體系為：欒樹(shù)愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基：0.25 mg/L IBA，1.0 mg/L 2,4-D，100 mg/LPVP 及10%的椰汁；欒樹(shù)愈傷組織繼代培養(yǎng)基：1.0 mg/L 6-BA，0.1 mg/L IBA，0.5 mg/L TDZ，100 mg/L PVP 及10%的椰汁，并成功轉(zhuǎn)入東南景天HMA3基因，使得欒樹(shù)對(duì)Cd 的富集能力得到了顯著的提升，該結(jié)果將為后續(xù)研究欒樹(shù)逆境分子機(jī)制下的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供技術(shù)支持。