基于專利網(wǎng)的中藥治療偏頭痛方劑核心藥物配伍規(guī)律及分子作用機制研究*

孫星怡 ，宋志會 ，彭真 ，韋明艷 ，陳雨釗 ，吳美蓉 ，李霖 ，郭利平

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)組分中藥國家重點實驗室，天津 301617；2.方劑學(xué)教育部重點實驗室，天津 301617；3.天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，天津 301617；4.天津市中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院，天津 300120）

偏頭痛是一種反復(fù)發(fā)作的慢性神經(jīng)血管性疾病，臨床常見頭部單側(cè)或雙側(cè)搏動性疼痛。偏頭痛已被世界衛(wèi)生組織列為全球第3大最常見疾病和第2大神經(jīng)系統(tǒng)致殘疾病，其患病率高達8.4%～28.0%，嚴重影響患者生活質(zhì)量并帶來沉重的經(jīng)濟負擔(dān)[1-2]。偏頭痛的病因和發(fā)病機制尚未完全闡明，研究指出偏頭痛的發(fā)作主要與環(huán)境因素、生活方式、遺傳因素導(dǎo)致的神經(jīng)系統(tǒng)紊亂有關(guān)[3]。偏頭痛西藥常規(guī)治療主要以減輕頭痛嚴重程度、降低發(fā)作頻率、緩解癥狀為目的，采用非甾體抗炎藥、鎮(zhèn)痛藥、曲坦類等藥物改善生活質(zhì)量[4]。中醫(yī)藥基于辨證論治的基本原則，采用中藥、針灸取穴、推拿等方式對偏頭痛進行治療，可減輕患者發(fā)病次數(shù)和程度，且安全性較好。近年來，聚焦于基礎(chǔ)研究，闡明中醫(yī)藥治療偏頭痛的用藥規(guī)律與作用機制并指導(dǎo)臨床用藥逐漸成為中醫(yī)藥防治偏頭痛領(lǐng)域的研究方向。

專利信息服務(wù)平臺（簡稱專利網(wǎng)）由知識產(chǎn)權(quán)出版社開發(fā)，收載不同領(lǐng)域科技創(chuàng)新的專利信息，通過對所收載的中藥方劑或中藥材進行藥物歸類、中藥組方配伍規(guī)律或各種制劑類方藥成分的數(shù)據(jù)挖掘，為中醫(yī)藥防治各類疾病提供研究思路和方法[5-6]。本研究應(yīng)用數(shù)據(jù)挖掘的方法統(tǒng)計專利網(wǎng)治療偏頭痛的中藥處方，對其用藥及配伍規(guī)律進行整理與分析，并從“疾病-藥物-化學(xué)成分-關(guān)鍵靶點-功能分析”角度，分析中藥治療偏頭痛的核心藥物配伍規(guī)律及潛在的分子作用機制，為臨床用藥提供有效的理論依據(jù)，也為揭示中藥復(fù)方治療偏頭痛的科學(xué)內(nèi)涵提供研究思路，本研究的整體思路見，圖1。

圖1 基于專利網(wǎng)的核心中藥治療偏頭痛的作用機制研究思路流程Fig.1 Flow chart of research on mechanism of coredrugs in the treatment of migraine according to patent information search platform

1 資料與方法

1.1 資料來源 登錄專利網(wǎng)（http：//search.cnipr.com/），以偏頭痛為檢索詞，收集所有中藥治療偏頭痛的信息。

1.2 數(shù)據(jù)處理 納入所有以中藥或中西醫(yī)結(jié)合治療偏頭痛，并含有詳細的處方藥物記載的專利。剔除有關(guān)保健品、營養(yǎng)粥、茶飲、功能飲料，以及并未明確方藥的專利。

將所有符合納入標準的方藥錄入Excel中，對中醫(yī)證型及主要代表方劑（加減方）進行統(tǒng)計。以《中藥學(xué)》和2015版《中國藥典》為參考，對中藥名稱進行規(guī)范，剔除無效中藥名稱（未出現(xiàn)在以上兩個參考書目的中藥），并錄入已規(guī)范中藥的四氣五味、歸經(jīng)、功效、以及功效分類[7-8]。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

1.3.1 數(shù)據(jù)挖掘方法對藥物規(guī)律的分析及預(yù)測 建立Excel數(shù)據(jù)庫，分別統(tǒng)計中藥名稱、四氣五味、歸經(jīng)、功效分類的頻數(shù)，并按照頻數(shù)由高到低排序。使用SPSS modeler 18.0，設(shè)置最大前項數(shù)為4，置信度97.015%，支持度13.06%，根據(jù)Apriori算法進行關(guān)聯(lián)規(guī)則分析。使用SPSS statistics 22.0對使用頻數(shù)排名前25的中藥進行系統(tǒng)聚類分析，統(tǒng)計高頻藥物的常用配伍。

1.3.2 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對預(yù)測方劑的深度分析 將1.3.1中預(yù)測得到的高頻方劑及相關(guān)藥物，通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析（TCMSP，https：//tcmspw.com/tcmsp.php）平臺篩選中藥有效成分，并以偏頭痛（migrain）為關(guān)鍵詞在 GeneCards數(shù)據(jù)庫（https：//www.genecards.org）、TherapeuticTargetDatabase（TTD）數(shù)據(jù)庫（http：//db.idrblab.net/ttd）、OMIM數(shù)據(jù)庫（http：//omim.org）數(shù)據(jù)庫中檢索該疾病相關(guān)靶點，使用Venny 2.1.0平臺構(gòu)建中藥-疾病交際靶點，在Cytoscape3.7.1中構(gòu)建藥物-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖，通過STRING（https：//string-db.org）平臺下載蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖（PPI），并利用Cytoscape 3.7.1進行優(yōu)化及繪制，采用R 4.0.2軟件進行GO功能和亦都基因和基因組百科全書（KEGG）通路富集分析，以預(yù)測專利網(wǎng)中治療偏頭痛高頻方藥的潛在作用機制。

2 結(jié)果

2.1 中醫(yī)證型及方劑統(tǒng)計分析 對納入的512個中藥處方相關(guān)中醫(yī)證型及主要代表方劑（加減方）進行統(tǒng)計，依照中醫(yī)證型（代表方劑）出現(xiàn)頻數(shù)由高到低進行排序，其中前5位分別為風(fēng)熱頭痛（芎芷石膏湯），瘀血頭痛（通竅活血湯），風(fēng)寒頭痛（川芎茶調(diào)散），肝陽頭痛（天麻鉤藤飲）和血虛頭痛（加味四物湯），共占比63.87%，其中風(fēng)熱頭痛占比最高，為28.71%，見表1。

表1 治療偏頭痛各證型對應(yīng)方劑（加減方）統(tǒng)計Tab.1 Statistics of different syndromes corresponding prescriptions in the treatment of migraine

2.2 中藥頻次統(tǒng)計分析 對納入的512個中藥處方進行統(tǒng)計，共6 148味中藥，其中單個藥物使用頻數(shù)>40次的有34味，藥物總數(shù)占比50.29%，使用頻數(shù)由高到低依次為：川芎（286次）、白芷（220次）、天麻（176次）、甘草（141次）、當歸（128次）等。見表2。

表2 治療偏頭痛的中藥使用頻次（>40次）Tab.2 Usage frequency of traditional Chinese medicine in the treatment of migraine(>40 times)

2.3 中藥四氣五味統(tǒng)計 對錄入的512個中藥處方進行統(tǒng)計，共6 148味中藥、四氣頻數(shù)為6 148次，五味頻數(shù)為9524次，其中溫性2076次，占比33.77%；平性1 358次，占比22.09%；微寒905次，占比14.72%等。五味頻數(shù)及比例依次為：辛味3 399次，占比35.69%；甘味2 396次，占比25.16%；苦味2 314次，占比24.30%等。

2.4 中藥歸經(jīng)統(tǒng)計分析 對納入的6 148味中藥進行歸經(jīng)統(tǒng)計，歸經(jīng)頻數(shù)為15 277次，其中肝經(jīng)3 832次，占比25.08%；肺經(jīng)2 455次，占比16.07%；脾經(jīng)5192次，占比12.64%；心經(jīng)1 677次，占比10.98%；胃經(jīng)1 620次，占比10.60%；腎經(jīng)1 145次，占比7.49%。

2.5 中藥功效統(tǒng)計分析 統(tǒng)計納入的6 148味中藥所有功效，共統(tǒng)計功效頻數(shù)19 350次，排名前5位的功效如下：祛風(fēng)止痛594次，占比3.07%；清熱解毒562次，占比2.90%；解表散寒470次，占比2.43%；平抑肝陽441次，占比2.28%；疏散風(fēng)熱382次，占比1.97%等，見表3。

表3 治療偏頭痛的中藥功效統(tǒng)計表（>170次）Tab.3 Statistical table of the efficacy of traditional Chinese medicine in the treatment of migraine(>170 times)

2.6 中藥關(guān)聯(lián)規(guī)則分析 對納入的6 148味中藥使用SPSS modeler 18.0進行關(guān)聯(lián)規(guī)則分析，設(shè)置最大前項數(shù)為2，置信度97.015%，支持度13.06%，高頻使用藥對前5位分別為川芎-白芍-白芷，川芎-當歸-白芷，川芎-細辛-白芷，川芎-蔓荊子-白芷，川芎-柴胡-白芷，見表4。

表4 治療偏頭痛藥物關(guān)聯(lián)規(guī)則分析結(jié)果Tab.4 Analysis results of association rules of drugs for treatment of migraine

2.7 高頻核心中藥聚類分析 對中藥使用頻數(shù)排名前25位的中藥進行聚類分析，得到4個藥物聚合組，第1組：菊花、蔓荊子、川芎、白芷、防風(fēng)、羌活、細辛、薄荷，藥物共出現(xiàn)頻數(shù)占比為17.59%；第2組：紅花、桃仁、當歸、甘草、白芍、柴胡、黃芩，藥物共出現(xiàn)頻數(shù)占比為11.06%；第3組：葛根、牛膝、延胡索、全蝎、僵蠶、天麻、丹參、鉤藤，藥物共出現(xiàn)頻數(shù)占比為10.11%；第4組半夏、茯苓，藥物共出現(xiàn)頻數(shù)占比為1.43%。見圖2。因第1組藥物組合出現(xiàn)頻次最高，緊密度最強，故探究該方劑治療偏頭痛的機制并開展后續(xù)研究。

圖2 治療偏頭痛高頻核心藥物聚類圖Fig.2 Cluster of high-frequency core drugs in the treatment of migraine

2.8 成分靶點網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 依據(jù)藥代動力學(xué)參數(shù)，共檢索得到菊花、蔓荊子、川芎、白芷、防風(fēng)、羌活、細辛、薄荷有效成分83個，其對應(yīng)靶點250個，偏頭痛疾病靶點900個，藥物靶點與偏頭痛疾病靶點取交集共得到共有靶點77個，通過Cytoscape 3.7.1軟件構(gòu)建“藥物-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖”。見圖3。

圖3 藥物-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖Fig.3 Network diagram of“drug-ingredient-target”

2.9 PPI網(wǎng)絡(luò)分析和核心靶點篩選 為進一步探討靶點在蛋白水平的作用關(guān)系，將STRING數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1軟件并通過Network Analyzer插件進行拓撲分析，以≥2倍DC中位數(shù)22為篩選條件，共得到該方劑治療偏頭痛的最相關(guān)靶點7個，分別是白細胞介素（IL）-1B、血管內(nèi)皮生長因子A（VEGFA）、前列素內(nèi)環(huán)氧化物合酶A（PTGS2）、腫瘤壞死因子（TNF）、表皮生長因子受體（EGFR）、IL-6、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）3。見圖4。

圖4 PPI網(wǎng)絡(luò)圖Fig.4 Network diagram of PPI

2.10 GO和KEGG通路富集結(jié)果與分析 利用R語言對該方劑治療偏頭痛的77個潛在靶點進行GO功能注釋，并按P值進行排序（閾值為P<0.05），將排名前30位的潛在生物過程（BP）進行展示，同時，將潛在靶點進行KEGG功能分析，并將排名前30位通路進行展示，如晚期糖基化產(chǎn)物（AGE）-晚期糖基化終末產(chǎn)物受體（RAGE）信號通路、IL-17信號通路、TNF信號通路、MAPK信號通路、磷脂酰肌醇激酶（PI3K）/蛋白激酶 B（Akt）信號通路等。見圖5。

圖5 GO功能和KEGG通路富集結(jié)果TOP30Fig.5 TOP 30 of GO function and KEGG pathway enrichment analysis results

3 討論

中醫(yī)將偏頭痛歸屬“頭痛”的范疇，又有“頭風(fēng)”“腦風(fēng)”“首風(fēng)”之稱[9]。其病機主要為外感六淫邪氣、內(nèi)傷或久病入絡(luò)，導(dǎo)致清陽不升，痹阻頭部經(jīng)絡(luò)所致，主要分為外感與內(nèi)傷兩類。本研究結(jié)果顯示，治療偏頭痛各證型對應(yīng)方劑研究數(shù)量從高到低依次為：風(fēng)熱頭痛（芎芷石膏湯）>瘀血頭痛（通竅活血湯）>風(fēng)寒頭痛（川芎茶調(diào)散）>肝陽頭痛（天麻鉤藤飲）>血虛頭痛（加味四物湯），有臨床研究結(jié)果顯示，肝陽上亢、血瘀證、肝風(fēng)挾瘀、血虛肝旺、氣血虧虛、風(fēng)熱等為偏頭痛的主要證型，與本研究結(jié)果基本一致[10-12]。

本次數(shù)據(jù)挖掘結(jié)果顯示川芎、白芷、天麻、甘草、當歸、細辛、防風(fēng)、白芍、菊花、柴胡等使用頻率較高，四氣五味分別以溫性、平性藥物占比最大（55.88%），辛味、甘味占比最大（60.85%），分析可知臨床治療偏頭痛仍以能行能散，緩急止痛的行氣活血、祛風(fēng)止痛功效藥物為主。另外關(guān)聯(lián)規(guī)則顯示川芎-白芷-白芍，川芎-白芷-當歸，川芎-白芷-細辛，川芎-白芷-蔓荊子，置信度均在90%以上，是治療偏頭痛較為常見的藥物組合，其功效亦主要以行氣活血，祛風(fēng)止痛，清利頭目為主。

根據(jù)聚類分析所得的新的高頻藥物組方由菊花、蔓荊子、川芎、白芷、防風(fēng)、羌活、細辛、薄荷組成。該方在川芎茶調(diào)散基礎(chǔ)上去荊芥、甘草，加菊花、蔓荊子，在祛風(fēng)止痛功效之外，更著疏散風(fēng)熱、清利頭目的作用，因此更適用于風(fēng)熱所致的偏頭痛[13]。通過成分靶點網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建，發(fā)現(xiàn)該方劑的藥物靶點與偏頭痛疾病靶點共77個，且該可能通過甘露醇（Mandenol）、氨酰胺（Ammidin）、異歐前胡素（isoimperatorin）、克尼地林（Cnidilin）、β-谷甾醇（beta-sitosterol）等有效成分發(fā)揮治療作用。PPI網(wǎng)絡(luò)分析和核心靶點篩選結(jié)果顯示，IL-1B、VEGFA、PTGS2、TNF、EGFR、IL-6、MAPK3 可能為該方劑治療偏頭痛的關(guān)鍵因子，GO功能-BP顯示，該方劑對偏頭痛的防治主要涉及基因表達的正向調(diào)控、對藥物的反應(yīng)、對脂多糖的反應(yīng)、突觸前膜的組成部分、細胞對脂多糖的反應(yīng)等生物過程方面，KEGG富集通路顯示，AGE-RAGE信號通路、IL-17信號通路、TNF信號通路、HIF-1信號通路、Th17細胞分化、5-HT突觸信號通路、MAPK信號通路、PI3K-Akt信號通路等可能為重要通路，其中MAPK信號通路在核心靶點、功能富集及通路富集中均有顯示，可能為

該方劑治療風(fēng)熱型偏頭痛的關(guān)鍵通路，本研究后期也將通過藥物分析、分子生物學(xué)驗證等方法明確該方劑發(fā)揮疏散風(fēng)熱、清利頭目治療偏頭痛的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，為實現(xiàn)臨床轉(zhuǎn)化研究提供依據(jù)。