經(jīng)方麻黃附子細(xì)辛湯合防己黃芪湯減輕膜性腎病小鼠氧化應(yīng)激損傷的機(jī)制研究*

黃山，劉納文，郝陽

（天津市第一中心醫(yī)院中醫(yī)科，天津 300192）

膜性腎?。∕N）又名膜性腎小球腎炎，其特征表現(xiàn)以高脂血癥、大量蛋白尿、水腫、低蛋白血癥等為主，以腎小球基底膜上皮細(xì)胞下彌漫的免疫復(fù)合物沉積伴基底膜彌漫增厚為病理特點(diǎn)[1]，是一類特殊的原發(fā)性腎小球病變病理類型，是成人特發(fā)性腎病綜合征最常見病因[2]。近年來越來越多的證據(jù)表明，MN發(fā)病機(jī)制與氧化應(yīng)激有著直接關(guān)系，而且該因素的占比較高[3-4]。對(duì)于MN西醫(yī)多使用激素以及免疫抑制劑（如環(huán)磷酰胺等）加以防治，但往往會(huì)產(chǎn)生皮質(zhì)功能亢進(jìn)、引起或加劇感染、骨髓控制、胃腸道癥狀、泌尿道癥狀等較多的不良反應(yīng)，且部分病人不能耐受，單純西醫(yī)治療具有一定局限性。

MN在中醫(yī)中并沒有切確的病名，根據(jù)病癥表現(xiàn)的特點(diǎn)可將之歸屬于中醫(yī)的“水腫”“尿濁”“膏淋”“虛勞”等疾病范疇。通過門診診治大量MN患者，總結(jié)本病的中醫(yī)辨證特點(diǎn)，筆者認(rèn)為少陰樞機(jī)不利為本病病機(jī)之關(guān)鍵，因而提出從少陰樞機(jī)論治膜性腎病的學(xué)術(shù)觀點(diǎn)，臨床上常選用麻黃附子細(xì)辛湯合防己黃芪湯加減進(jìn)行治療并取得了較好的療效。本研究觀察麻黃附子細(xì)辛湯聯(lián)合防己黃芪湯通過減輕腎臟氧化應(yīng)激反應(yīng)及炎癥反應(yīng)并參與調(diào)控核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）信號(hào)通路發(fā)揮治療作用，以期為中醫(yī)藥治療MN的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)雄性Balb/c小鼠60只，6～8周齡，平均體質(zhì)量20～25 g，購于斯貝福（北京）生物技術(shù)科技公司。

1.2 藥品與化學(xué)試劑 中藥（防己10 g，黃芪20 g，白術(shù) 10 g，麻黃 10 g，制附子 10 g，細(xì)辛 3 g，炙甘草3 g），以上藥品均由江陰天江藥業(yè)有限公司生產(chǎn)供應(yīng)，由天津市第一中心醫(yī)院中醫(yī)科統(tǒng)一制備。TBD氨基載玻片F(xiàn)ISH0010，天津市智恩博萊生物科技有限公司生產(chǎn)；陽離子化牛血清白蛋白（C-BSA）（Chondrex公司）、氟氏不完全佐劑，購于天津市南開區(qū)艾博抗生物試劑銷售中心；三酰甘油（TG）檢測盒、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）檢測盒、總膽固醇（T-CHO）檢測盒、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）檢測盒，南京建成生物工程研究所生產(chǎn)；超氧化物歧化酶（SOD）酶聯(lián)免疫分析試劑盒，丙二醛（MDA）酶聯(lián)免疫分析試劑盒、白細(xì)胞介素-6（IL-6）酶聯(lián)免疫分析試劑盒、單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）酶聯(lián)免疫分析試劑盒，上海泛柯實(shí)業(yè)有限公司生產(chǎn)；即用型SABC-POD（兔IgG）試劑盒，武漢博士德生物工程有限公司生產(chǎn)；DAB顯色試劑盒ZLI-9032 3 mL（20×），中杉金橋；兔多抗 NF-κB，北京博奧森生物科技公司生產(chǎn)。

1.3 主要儀器 TJP-01型排毒柜，天津市超純凈化設(shè)備廠工程部生產(chǎn)；電熱干燥箱DG-204，天津天宇技術(shù)實(shí)業(yè)有限公司；石蠟切片機(jī)（RM2235），德國Leica集團(tuán)；光學(xué)顯微鏡（BA410），Moticam Pro集團(tuán)；LX-200迷你離心機(jī)，海門市其林貝爾儀器制造有限公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組 60只Balb/c小鼠，按體質(zhì)量分層隨機(jī)分為正常組、模型組、中藥低劑量組、中藥中劑量組、中藥高劑量組，各12只。

2.2 造模與干預(yù) 適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，用C-BSA制成膜性腎病小鼠模：C-BSA 1 mg，加入0.5 mL磷酸緩沖鹽溶液（PBS）中，在同量的氟氏不完全佐劑中混勻配制為懸濁液，在小鼠的腹股溝處、雙側(cè)腋下多點(diǎn)皮下注射，每只注射0.3 mL，每日1次；正常組等容積的生理鹽水與弗氏不完全佐劑，按上述比例乳化后進(jìn)行腹股溝處、雙側(cè)腋下多點(diǎn)皮下注射。1周后每只小鼠尾靜脈內(nèi)注射C-BSA 20 mg/kg，隔日1次，4周后驗(yàn)證模型復(fù)制成功[5]。于造模完成后開始灌胃治療，向中藥低劑量組、中劑量組、高劑量組依次灌服標(biāo)準(zhǔn)中藥溶液（1、2、4 g生藥/mL），正常組和模型組灌服等量的生理鹽水，共6周。（60 kg成人的中藥治療用量大約為每日65 g生藥，按體表面積，小鼠單位體質(zhì)量的等效用量大約為成人用量的9.1倍，從而確定了每天對(duì)每只小鼠的灌胃劑量，每周測小鼠體質(zhì)量進(jìn)行藥量調(diào)節(jié)。成人用量1.08g生藥/kg，小鼠的等效用量為9.83 g生藥/kg，20 g小鼠按中藥濃度1 g生藥/mL，每日需灌藥約0.2 mL）。

2.3 標(biāo)本采集和處置方法 灌胃治療6周后，摘眼球取血法，室溫度下保存30 min后，以7 000 r/min離心15 min，離心半徑4 cm。采集上層的血清，于-80℃以下保存。取血后動(dòng)物取出腎臟組織，將腎臟沿冠狀面切成大致相等的兩半，用生理鹽水多次沖洗腎臟以洗去腎臟組織的血液，用濾紙片吸干水分，再將一半腎臟置于液氮瓶中封存，用于檢測SOD、MDA、IL-6、MCP-1含量；另一半放于中性福爾馬林中固定，用以制作病理切片。

2.4 指標(biāo)檢測

2.4.1 血脂及腎功能的測定 全自動(dòng)生化分析儀測定各組小鼠血清白蛋白（ALB）、三酰甘油（TG）、總膽固醇（TC）、血肌酐（SCr）、尿素氮（BUN）的水平。

2.4.2 腎臟病理 取固定好的腎組織，用石蠟包埋法，厚度為5 μm，將其進(jìn)行腎組織蘇木精-伊紅（HE）染色和過碘酸雪夫（PAS）染色，中性樹膠封閉，光鏡下觀察照相。

2.4.3 酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測腎臟組織SOD、MDA、IL-6、MCP-1含量表達(dá) 按ELISA試劑盒說明書操作。

2.4.4 免疫組化法觀察NF-κB蛋白的表達(dá) 具體按SABC免疫組化染色試劑盒使用說明完成。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)處理使用IBM SPSS statistics 22軟件完成計(jì)量資料數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間的比較使用單因素方差分析（one way-ANOVA），組間兩兩比較使用SNK-q檢驗(yàn)。P<0.05代表差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。免疫組化結(jié)果采用Image-Pro Plus 6.0軟件系統(tǒng)完成數(shù)據(jù)分析，使用積分光密度值分析法。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 中醫(yī)經(jīng)方麻黃附子細(xì)辛湯合防己黃芪湯對(duì)膜性腎病小鼠TG、TC、ALB、SCr、BUN水平的影響 與正常組相比，模型組小鼠血清中TG、TC、SCr、BUN水平上升（P<0.01），ALB 水平下降（P<0.01），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與模型組比較，中藥低中高各劑量濃度組TG、TC水平各有不同程度的下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01），ALB水平提高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），血清SCr、BUN水平差異無統(tǒng)計(jì)意義（P>0.05）。見表1。

表1 麻黃附子細(xì)辛湯合防己黃芪湯對(duì)MN小鼠TG、TC、ALB、SCr、BUN水平的影響（±s）Tab.1 Effect of Mahuang Fuzi Xixin Decoction combined with Fangji Huangqi Decoction on TG，TC，ALB，SCr，BUN level of MN mice（±s）

表1 麻黃附子細(xì)辛湯合防己黃芪湯對(duì)MN小鼠TG、TC、ALB、SCr、BUN水平的影響（±s）Tab.1 Effect of Mahuang Fuzi Xixin Decoction combined with Fangji Huangqi Decoction on TG，TC，ALB，SCr，BUN level of MN mice（±s）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別動(dòng)物數(shù)TG（mmol/L）TC（mmol/L）ALB（g/L）SCr（mmol/L）BUN（mmol/L）正常組 12 1.27±0.17 2.41±0.45 39.66±2.66 6.25±1.96 9.63±1.59模型組 12 1.96±0.15** 3.39±0.39** 30.58±1.18** 14.75±1.82** 18.54±1.46**中藥低劑量組 12 1.70±0.18## 2.99±0.43# 34.98±1.87## 13.67±1.92 17.55±1.96中藥中劑量組 12 1.58±0.18## 2.93±0.52# 37.99±1.55## 13.58±1.98 17.53±1.58中藥高劑量組 12 1.52±0.18## 2.80±0.40## 38.29±1.94## 13.50±1.51 17.31±1.08

3.2 經(jīng)方麻黃附子細(xì)辛湯合防己黃芪湯對(duì)膜性腎病小鼠腎組織病理形態(tài)學(xué)（HE染色、PAS染色）的影響 正常組小鼠腎臟組織被膜結(jié)構(gòu)比較完好，沒有發(fā)現(xiàn)炎性滲出或者結(jié)締組織增生，其髓質(zhì)與皮質(zhì)的界線也較清晰，皮質(zhì)區(qū)腎小球內(nèi)未見毛細(xì)血管基底膜以及基質(zhì)增生；腎小管結(jié)構(gòu)基本完整，上皮細(xì)胞沒有出現(xiàn)變性壞死，沒有發(fā)現(xiàn)間質(zhì)內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤現(xiàn)象且無充血。與正常組比較，模型組小鼠的腎組織皮質(zhì)腎小球結(jié)構(gòu)模糊不清，基底膜增厚，由單層變?yōu)槎鄬?，?xì)胞胞核腫脹，周圍腎小管腫脹，部分變性壞死。與模型組相比較，中藥的低、中、高劑量濃度組小鼠腎臟組織被膜較為完整，皮質(zhì)與髓質(zhì)之間分界也較為清晰，皮質(zhì)腎小球結(jié)構(gòu)模糊，但基底膜增厚程度有改善，部分腎小管變性。見圖1。

圖1 各組小鼠腎組織病理改變HE染色（×400）Fig.1 HE staining of renal histological changes of mice in each group(×400)

正常組小鼠腎組織未見明顯纖維膠原物質(zhì)生成，腎小球細(xì)胞也未見纖維化樣變。但與正常組相比較，模型組的小鼠腎小球構(gòu)造紊亂，體積增大明顯，球囊毛細(xì)血管基底膜增厚，腎小球上皮下出現(xiàn)嗜復(fù)紅蛋白和膠原纖維的沉積，腎小管上皮細(xì)胞數(shù)量明顯減少，可見膠原纖維的沉積，部分出現(xiàn)空泡樣變性；與模型組相比較，中藥低、中、高劑量組小鼠的腎小球和腎小管結(jié)構(gòu)都有了不同程度的改善。見圖2。

圖2 各組小鼠腎組織病理改變PAS染色（×400）Fig.2 PAS staining of renal histological changes of mice in each group(×400)

3.3 經(jīng)方麻黃附子細(xì)辛湯合防己黃芪湯對(duì)膜性腎病小鼠腎組織 SOD、MDA、IL-6、MCP-1含量的影響 與對(duì)照組比較，模型組的小鼠腎臟組織SOD下降（P<0.01），MDA、IL-6、MCP-1 數(shù)值升高（P<0.01）；與模型組比較，中藥各劑量組腎組織SOD含量均有不同程度的增加（P<0.05或P<0.01），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，MDA、IL-6、MCP-1 含量均下降（P<0.01），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表2。

表2 麻黃附子細(xì)辛湯合防己黃芪湯對(duì)MN小鼠腎組織SOD、MDA、IL-6、MCP-1含量的影響（±s）Tab.2 Effect of Mahuang Fuzi Xixin Decoction combined with Fangji Huangqi Decoction on SOD，MDA，IL-6，MCP-1 level in kidney of MN mice（±s）

表2 麻黃附子細(xì)辛湯合防己黃芪湯對(duì)MN小鼠腎組織SOD、MDA、IL-6、MCP-1含量的影響（±s）Tab.2 Effect of Mahuang Fuzi Xixin Decoction combined with Fangji Huangqi Decoction on SOD，MDA，IL-6，MCP-1 level in kidney of MN mice（±s）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

分組 動(dòng)物數(shù) SOD（pg/mL） MDA（nmol/L） IL-6（pg/ml） MCP-1（ng/L）正常組 12 17.92±0.57 18.31±0.54 27.57±1.50 285.13±12.96模型組 12 10.56±0.63** 29.56±0.49** 48.21±0.80** 519.67±21.79**中藥低劑量組 12 11.07±0.75# 27.13±0.37## 40.46±1.17## 447.52±17.03##中藥中劑量組 12 13.23±0.27## 24.56±0.59## 36.49±0.96## 355.04±14.59##中藥高劑量組 12 14.73±0.50## 22.22±0.34## 30.17±1.20## 328.14±14.73##

3.4 經(jīng)方麻黃附子細(xì)辛湯合防己黃芪湯對(duì)膜性腎病小鼠腎組織NF-κB蛋白表達(dá)的影響 光鏡下觀察組織切片免疫組化染色結(jié)果，NF-κB蛋白陽性表達(dá)主要位于小鼠腎小管及腎小球球囊，呈現(xiàn)出圓圈狀或團(tuán)狀的棕褐色著染，且分布范圍廣泛。正常組腎小管和腎小球球囊呈現(xiàn)的棕褐色著染比較少，與正常組相比，模型組NF-κB蛋白陽性表達(dá)明顯增加，棕褐色著染變深，范圍更大；與模型組比較，中藥低、中、高劑量組棕褐色著染依次變淺，范圍依次遞減。見圖3。

圖3 經(jīng)方麻黃附子細(xì)辛湯合防己黃芪湯對(duì)MN小鼠腎組織NF-κB蛋白表達(dá)的影響（×400）Fig.3 Effect of Mahuang Fuzi Xixin Decoction combined with Fangji Huangqi Decoction on NF-κB protein expressions in kidney of MN mice(×400)

各組中陽性表達(dá)的積分光密度值（IOD）統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示：與正常組比較，模型組小鼠腎組織NF-κB蛋白表達(dá)升高（P＜0.01），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與模型組比較，中藥低、中、高劑量組小鼠腎組織NF-κB蛋白表達(dá)均有不同程度的下降（P<0.05或P<0.01），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表3。

表3 各組小鼠腎組織NF-κB蛋白表達(dá)情況（IOD值，±s）Tab.3 Expression of NF-κB protein in renal tissue of mice in each group(IOD value，±s)

表3 各組小鼠腎組織NF-κB蛋白表達(dá)情況（IOD值，±s）Tab.3 Expression of NF-κB protein in renal tissue of mice in each group(IOD value，±s)

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01。

組別 動(dòng)物數(shù) NF-κB正常組 12 97 416.77±79.94模型組 12 122 082.31±54.60**中藥低劑量組 12 107 680.76±49.82##中藥中劑量組 12 81 120.63±35.96##中藥高劑量組 12 70 764.18±42.07##

4 討論

麻黃附子細(xì)辛湯出自《傷寒論·辨少陰病脈證并治》，“少陰病，始得之，反發(fā)熱，脈沉者，麻黃附子細(xì)辛湯主之”，有助陽解表之功。防己黃芪湯出自《金匱要略·痙濕暍病脈證并治》，“風(fēng)濕，脈浮身重，汗出惡風(fēng)者，防己黃芪湯主之”，有益氣祛風(fēng)，健脾利水之效。麻黃附子細(xì)辛湯溫少陰而解表，益火之源壯少陰樞機(jī)使陰陽調(diào)和，并以汗法開鬼門以消水腫；防己黃芪湯健脾利水，益氣祛風(fēng)。兩方聯(lián)合治療以少陰樞機(jī)不利為病機(jī)的膜性腎病，既能扶正固本，溫陽補(bǔ)脾腎益氣，又能對(duì)癥去標(biāo)，祛風(fēng)除濕利水，標(biāo)本兼顧，在臨證中取得了良好的療效。

MN的發(fā)病機(jī)制與氧化應(yīng)激有著重要關(guān)系[4-5]。首先，氧化應(yīng)激能夠直接損害腎臟從而誘導(dǎo)膜性腎病的發(fā)生：氧化應(yīng)激通常伴隨著活性氧（ROS）生成的增多和抗氧化分子的生成下降，而ROS則能使脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸等重要細(xì)胞分子過氧化，從而使細(xì)胞的結(jié)構(gòu)、功能出現(xiàn)損傷，對(duì)腎臟功能有直接破壞作用，從而參與MN的病理形成過程。其次，氧化應(yīng)激還可以激活相應(yīng)的信號(hào)通路（如NF-κB信號(hào)通路）介導(dǎo)免疫炎癥反應(yīng)促進(jìn)膜性腎病的發(fā)生發(fā)展。NF-κB是導(dǎo)致相應(yīng)炎癥因子基因表達(dá)的主要起始因子，調(diào)控了一系列趨化因子和黏附分子物質(zhì)的表達(dá)，如IL-6、MCP-1等，這些因子參與免疫和炎癥細(xì)胞的趨化、浸潤、增殖、分化過程，同時(shí)也能夠反過來刺激NF-κB的活化，而這種正反饋效應(yīng)使得炎癥反應(yīng)信號(hào)進(jìn)一步釋放，促進(jìn)炎性反應(yīng)，進(jìn)而加重了腎臟組織損害[6-7]。本研究從中醫(yī)經(jīng)方麻黃附子細(xì)辛湯聯(lián)合防己黃芪湯可能通過減輕腎臟氧化應(yīng)激反應(yīng)及炎癥反應(yīng)并參與NF-κB信號(hào)通路發(fā)揮對(duì)MN的治療作用這一假說出發(fā)，通過觀察腎臟組織中氧化應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)蛋白SOD、MDA和炎癥反應(yīng)相關(guān)蛋白IL-6、MCP-1含量，及腎組織NF-κB蛋白表達(dá)的影響，以證實(shí)假說的真實(shí)性。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)方麻黃附子細(xì)辛湯聯(lián)合防己黃芪湯可有效降低MN小鼠血清TG、TC水平，能夠使血漿白蛋白水平提高，但不會(huì)改變腎功能相關(guān)指標(biāo)如SCr、BUN的數(shù)值，從而得出結(jié)論：中醫(yī)經(jīng)方麻黃附子細(xì)辛湯聯(lián)合防己黃芪湯具有改善脂代謝紊亂和低蛋白血癥的作用，但對(duì)腎功能無明顯改善作用，這與以往學(xué)者研究麻黃附子細(xì)辛湯或防己黃芪湯單方作用的研究結(jié)果相似[8-10]。經(jīng)過逐層剖析兩方合用治療MN的作用途徑可以看到：首先，兩方合用能有效改善脂質(zhì)代謝紊亂，使得血漿白蛋白水平變高，從而減少高脂血癥、低蛋白血癥發(fā)生，減輕水腫癥狀；其次能有效改善膜性腎病腎臟病理形態(tài)，從而減輕病變程度，延緩病程進(jìn)展；再次，兩經(jīng)方合用可以使MN小鼠的氧化應(yīng)激反應(yīng)和炎癥反應(yīng)減低，并抑制NF-κB通路，從中醫(yī)宏觀思維與西醫(yī)微觀思維相互聯(lián)系的角度看，可以猜測這很可能是二聯(lián)方緩解MN病理的最可能內(nèi)在分子作用機(jī)制，而氧化應(yīng)激反應(yīng)、炎癥反應(yīng)以及NF-κB通路的激活等病理機(jī)制，是中醫(yī)病機(jī)里“水濕、濕熱、濁毒”等潛在的微觀病理表現(xiàn)，由它所產(chǎn)生的抑制NF-κB通路、降低氧化應(yīng)激反應(yīng)和炎癥反應(yīng)是扶正固本、祛風(fēng)除濕利水、化濁毒的內(nèi)在分子層面的表現(xiàn)。

同時(shí)筆者也認(rèn)識(shí)到本課題研究中存在的不足之處，如經(jīng)方麻黃附子細(xì)辛湯聯(lián)合防己黃芪湯對(duì)MN的作用機(jī)制只是初步的研究，其到底是如何發(fā)揮抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)和炎癥反應(yīng)作用的，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究探討。同時(shí)，在抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)和炎癥反應(yīng)之間有沒有潛在的內(nèi)在分子聯(lián)系，需要進(jìn)一步證實(shí)。中醫(yī)藥防治MN具有廣闊的研究前景和應(yīng)用價(jià)值，相信在未來會(huì)看到更多的突破性進(jìn)展和成果。