氣相色譜-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用法分析廣藿香揮發(fā)油成分

陳欣陳巧蘭吳澤吟李燕明

(1.珠檢協(xié)科技(珠海)有限公司，廣東 珠海 519015；2.珠海市食品藥品檢驗(yàn)所，廣東 珠海 519015；3.拱北海關(guān)技術(shù)中心,廣東 珠海 519015)

廣藿香為唇形科植物廣藿香(Pogostemon cablin Benth.)的地上部分，常用芳香化濕中藥，有芳香化濁、開胃止嘔、發(fā)表解暑功效，是著名成藥“藿香正氣丸(水)”的重要組成藥物。廣藿香的主要藥物活性成分是其揮發(fā)油，據(jù)報(bào)道，廣藿香揮發(fā)油對(duì)真菌、細(xì)菌有明顯的抑菌作用[1,2]。

對(duì)于廣藿香揮發(fā)油成分的分析，主要應(yīng)用氣相色譜、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行定性分析[3-5]，通過與標(biāo)準(zhǔn)譜庫對(duì)比確定化合物結(jié)構(gòu)。然而，天然植物的揮發(fā)油的主要成分為萜類(主要為單萜及倍半萜類)、芳香類化合物，同類化合物質(zhì)譜圖非常相似，很難確定其結(jié)構(gòu)，實(shí)際分析時(shí)與譜庫中獲得標(biāo)準(zhǔn)譜圖時(shí)的條件無法完全一致，也給結(jié)構(gòu)的確定增加了困難。

恒溫保留指數(shù)是氣相色譜定性分析中一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的參數(shù)，自Kováts于1958年提出以來，得到了廣泛的應(yīng)用，并且有大量可參考的數(shù)據(jù)庫、手冊(cè)及文獻(xiàn)[6]。但是由于天然植物揮發(fā)油成分的復(fù)雜性，一般都是在程序升溫的條件下進(jìn)行色譜分離分析，因此，在揮發(fā)油分析中，程序升溫保留指數(shù)(PTRIs)較之恒溫保留指數(shù)更具有實(shí)用價(jià)值。近期的一些研究也證明PTRIs是比較可靠的定性參數(shù)[7-9]。

利用GC-MS分析揮發(fā)油存在的另一個(gè)問題就是多種化合物在同一時(shí)間出峰，相互混淆，無法準(zhǔn)確對(duì)成分進(jìn)行鑒定。GC-MS分析還存在的一個(gè)問題就是一些濃度相對(duì)比較低的化合物，其相對(duì)極低的信噪比致使質(zhì)譜很難檢測(cè)到信號(hào)峰。

本研究旨在應(yīng)用PTRIs和類分離方法(HPLC and Silica gel CC)分析廣藿香揮發(fā)油，這些數(shù)據(jù)對(duì)于建立天然植物揮發(fā)油通用PTRIs數(shù)據(jù)庫有很大貢獻(xiàn)，并且為今后的揮發(fā)油分析前處理提供了新思路。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與材料

氣相色譜Hewlett-Packard 6890(Agilent Technologies,USA)，氣相色譜-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用儀(Waters,UK)，MCP質(zhì)譜檢測(cè)器；石英毛細(xì)管柱HP-5(30m×0.25mm×0.25μm)。廣藿香原材料為海南廣藿香植物的干燥地上部分，經(jīng)中國中醫(yī)研究院中藥研究所鑒定。正構(gòu)烷烴(C6～C26)標(biāo)樣為色譜純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 廣藿香揮發(fā)油的提取

按中國藥典(2020年版)方法提取[10]，并計(jì)算其含油率為0.19%。

1.2.2 廣藿香揮發(fā)油的類分離-硅膠柱分離方法

將0.2mL揮發(fā)油溶于1mL正己烷中，上樣到硅膠柱(硅膠15g)層析分離，分別以石油醚、石油醚-乙醚(80∶20)、石油醚-乙醚(60∶40)、石油醚-乙醚(50∶50)、石油醚-乙醚(40∶60)、石油醚-乙醚(20∶80)、乙醚各100mL洗脫，30℃減壓濃縮，TLC薄層色譜檢測(cè)，得到7部分揮發(fā)油樣品，待GC-MS檢測(cè)。為避免偶然因素的影響，重新取0.2mL揮發(fā)油溶于1mL正己烷中，上樣、洗脫與上述過程一致，得到另一組7部分揮發(fā)油樣品待測(cè)。

1.2.3 廣藿香揮發(fā)油的類分離-HPLC分離方法

50μL揮發(fā)油以正己烷稀釋到50mL，取稀釋后的樣品20μL滿環(huán)進(jìn)樣。分離使用的是正相柱ZORBAX CN(25×0.46cm.P.N.880952-705)(Agilent 1100 HPLC)，采用正己烷-異丙醇作為混合流動(dòng)相，先以100%正己烷洗脫25min，至30min緩沖至95%正己烷(異丙醇5%)洗脫，然后以95%正己烷再洗脫至40min，流速為恒流1mL·min-1，通過氣相色譜檢測(cè)，合并相同部分，得到8部分揮發(fā)油樣品，待GC-MS檢測(cè)。為避免偶然因素的影響，重新取20μL揮發(fā)油進(jìn)樣，洗脫條件與上述過程一致，得到另一組8部分揮發(fā)油樣品待測(cè)。

1.3 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析參數(shù)

1.3.1 氣相色譜分析條件

氣化室溫度260℃，程序升溫：柱初溫80℃，4℃·min-1升到260℃。氦氣為載氣，流速為1.0mL·min-1，分流比20∶1。

1.3.2 高分辨質(zhì)譜儀分析條件

EI電離模式，電離電壓70eV，離子室溫度220℃，m/z40～400全掃描模式，質(zhì)譜圖2scans·s-1記錄。

1.4 保留指數(shù)計(jì)算方法

應(yīng)用由Van den Dool和Kratz[14]提出的公式(見下式)計(jì)算程序升溫保留指數(shù)。

(1)

式中，IuT為程序升溫保留指數(shù)；tn,tn+1和tu分別為碳數(shù)為n,n+1的正構(gòu)烷烴標(biāo)樣及目標(biāo)成分的氣相保留時(shí)間。

2 結(jié)果與討論

在應(yīng)用氣-質(zhì)方法分析揮發(fā)油時(shí)存在2個(gè)問題，其一是重疊峰的存在。揮發(fā)油的成分一般十分復(fù)雜，一些化合物在氣相色譜分析中在同一時(shí)間重疊出峰。本文采用HPLC及Silica gel CC(Silica gel Chromatography Column)2種分離方法對(duì)揮發(fā)油進(jìn)行預(yù)處理。由于不同的極性特點(diǎn)，得以分離不同的部分。如，在原始未經(jīng)處理的揮發(fā)油氣-質(zhì)總離子流圖中，在20.93min只有一個(gè)寬峰(廣藿香醇，匹配度52%)，但是經(jīng)過HPLC方法分離后，得到的第5、6部分的離子流圖顯示其為2個(gè)峰的重疊(7(11)-Selinen-4à-ol,56%；Patchouli alcohol,89%)，其定性的可靠性大大提高。

另外,揮發(fā)油成分的含量參差不齊，有一些含量相對(duì)很低的化合物，在原始總離子流圖中的信噪比相對(duì)極低，很難檢測(cè)到。如，在1g揮發(fā)油樣品中有1mg目標(biāo)組分，為使高含量組分在質(zhì)譜檢測(cè)器中有很好的匹配，需將樣品稀釋到100mL，則該1mg的目標(biāo)組分含量則為0.01mg·mL-1(10ppm)，很難檢測(cè)到。而利用類分離方法后，高含量組分與低含量組分得以分離，含有目標(biāo)組分的部分只需要稀釋到10mL，所以能檢測(cè)到更可靠的譜圖信息。

如，圖1b是原始未經(jīng)類分離的揮發(fā)油總離子流圖，在9.91min沒有明顯的譜峰，因?yàn)楹刻?。圖1a為經(jīng)過硅膠柱前處理的部分，可見在9.91min處有一明顯譜峰，經(jīng)氣-質(zhì)定性為對(duì)丙烯基苯甲醚(匹配度79%)。同樣的，在圖1c(經(jīng)HPLC預(yù)處理)中的18.19min(Cedr-8-en-13-ol,R.M.837)和18.46min(Flopropione,R.M.816)較圖1d(未經(jīng)處理樣品)有更好的譜峰及匹配度。在圖1c中19.24min(Calarene epoxide R.M.830)能夠很清晰地被檢測(cè)出來，但是在圖1d中卻未能檢出。

圖1 揮發(fā)油直接氣-質(zhì)分析及經(jīng)過類分離離子流圖對(duì)比

通過Silica gel CC分離輔助，識(shí)別出9個(gè)化合物。通過HPLC分離輔助，識(shí)別出10個(gè)化合物，另外有4個(gè)飽和烷烴通過2種方法共同輔助識(shí)別。所有鑒定出的化合物的PTRIs經(jīng)計(jì)算并且列于表1中。其中帶*標(biāo)記的11種化合物在廣藿香揮發(fā)油中未見報(bào)道。

表1 廣藿香揮發(fā)油成分

續(xù)表 廣藿香揮發(fā)油成分

3 結(jié)論

本文應(yīng)用高效液相色譜(HPLC)及硅膠柱色譜(Silica gel CC)方法對(duì)廣藿香揮發(fā)油進(jìn)行類分離，并結(jié)合程序升溫保留指數(shù)(PTRIs)輔助高分辨氣質(zhì)聯(lián)用法(GC-TOF)，鑒定廣藿香揮發(fā)油成分。鑒定出11種在廣藿香揮發(fā)油中未見報(bào)道的化合物，并得出廣藿香揮發(fā)油57種成分的程序升溫保留指數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果可用于建立天然植物揮發(fā)油通用PTRIs數(shù)據(jù)庫，且補(bǔ)充了廣藿香揮發(fā)油成分。