基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)探討腦泰方治療腦缺血的作用機(jī)制

賀 旭， 宋禎彥， 王珊珊， 劉曉丹， 葛金文*

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，湖南 長沙 410208；2.益陽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校解剖教研室，湖南 益陽 413000)

腦卒中是一種急性腦血管疾病，其中缺血性腦卒中占到 60%～70%。缺血性中風(fēng)屬中醫(yī)“中風(fēng)”范疇，其病機(jī)非常復(fù)雜，氣血兩虛是缺血性中風(fēng)的主要病機(jī)[1]?！夺t(yī)林改錯(cuò)》記載，“虧損元?dú)?，是其本源”“元?dú)饧忍?，必不能達(dá)于血管，血管無氣，必停留而瘀”，提出“氣虛血瘀”學(xué)說[2]。因此，缺血性中風(fēng)的主要病機(jī)為“氣虛血瘀”，其主要治則便是益氣活血。

王清任根據(jù)益氣活血的治則創(chuàng)立補(bǔ)陽還五湯，并以該法確立得到中藥復(fù)方腦泰方，由黃芪、川芎、地龍和僵蠶(8∶2∶3∶3)構(gòu)成，主要功效補(bǔ)氣活血、化瘀通絡(luò)，現(xiàn)已用于腦缺血急性期的治療，且取得了較好的臨床效果。課題組前期研究表明，腦泰方的作用機(jī)制可能是通過抗血小板活化[3]、抗血栓[4]、抑制神經(jīng)元的凋亡[5]、抗炎性作用[6]及上調(diào)膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)輔助蛋白，減少腦鐵沉積[7]起神經(jīng)保護(hù)作用，但其在腦缺血疾病中的藥理作用尚未完全闡明。本研究通過多個(gè)數(shù)據(jù)庫聯(lián)用檢索和文獻(xiàn)挖掘，篩選腦泰方的主要活性成分并進(jìn)行成分靶點(diǎn)預(yù)測，分析活性成分-作用靶點(diǎn)-疾病之間的作用關(guān)系，并對(duì)靶點(diǎn)基因功能及信號(hào)通路進(jìn)行分析，構(gòu)建腦泰方治療缺血性腦中風(fēng)的成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析，從而揭示其作用的分子機(jī)制，為腦泰方在腦缺血疾病中的臨床應(yīng)用和進(jìn)一步研究提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 腦泰方活性成分的收集和分析 腦泰方由黃芪、川芎、地龍、僵蠶組成，臨床水煎服用，該方劑化合物信息分析依托于中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)(TCMSP，http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)、中藥分子機(jī)制的生物信息學(xué)分析工具(BATMAN-TCM，http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)、中藥信息數(shù)據(jù)庫(TCMID，http://www.megabionet.org/tcmid)。設(shè)置口服生物利用度(OB)≥30%、類藥性(DL)≥0.18，對(duì)上述4味中藥所含的每個(gè)化合物進(jìn)行篩選，無藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)的化合物通過查閱文獻(xiàn)進(jìn)行篩選。最后通過Pubchem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/) 查詢篩選出的化合物結(jié)構(gòu)式，并獲得化合物的SMILES表達(dá)式。

1.2 腦泰方活性成分的靶點(diǎn)獲取 采用TCMS、SEA (http://sea.bkslab.org)、SwissTargetPrediction (http://www.swisstargetprediction.ch/)數(shù)據(jù)庫，根據(jù)化合物結(jié)構(gòu)相似性和分子對(duì)接特性進(jìn)行預(yù)測，并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行補(bǔ)充。腦泰方活性成分的靶點(diǎn)預(yù)測分?jǐn)?shù)閾值設(shè)置≥0.6[8]，使用UniProt (http://www.uniprot.org/)進(jìn)行除重及標(biāo)準(zhǔn)化命名。

1.3 “腦缺血”靶點(diǎn)獲取 在Drugbank(https://www.drugbank.ca/)、TTD(https://db.idrblab.org/ttd/)、DisGeNET (https://www.disgenet.org/)數(shù)據(jù)庫中輸入關(guān)鍵詞“cerebral ischemia”，獲取腦缺血疾病的相關(guān)靶點(diǎn)，然后將腦泰方的預(yù)測靶點(diǎn)映射到腦缺血疾病相關(guān)靶點(diǎn)中，以獲取腦泰方治療腦缺血的潛在作用靶點(diǎn)。

1.4 可視化網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 利用Cytoscape v3.6.1軟件構(gòu)建活性成分-靶點(diǎn)-腦缺血疾病可視化網(wǎng)絡(luò)圖，使用在線蛋白相互作用的檢索和預(yù)測數(shù)據(jù)庫STRING(https://string-db.org/)構(gòu)建腦泰方抗腦缺血潛在靶點(diǎn)的蛋白與蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)，選擇系統(tǒng)默認(rèn)分值score≥0.4，并使用Cytoscape v3.6.1軟件繪制靶蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5 GO、KEGG富集分析 將“1.4”項(xiàng)下腦泰方治療腦缺血的蛋白-蛋白相互作用重要拓?fù)淠K中的靶點(diǎn)導(dǎo)入在線基因功能富集工具DAVID 6.8 (http://david.abcc.ncifcrf.gov/)，以人類基因?yàn)楸尘?，P<0.05、FDR(錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率)<0.05為標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)主要活性成分和腦缺血的共同基因進(jìn)行GO富集分析。同時(shí)，將這些靶點(diǎn)導(dǎo)入KEGG數(shù)據(jù)庫(https://www.genome.jp/kegg/)查看對(duì)應(yīng)的通路圖并分類，利用Omicshare (www.omicshare.com/tools)，以P<0.05、FDR<0.05為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)通路進(jìn)行富集分析，找出腦泰方發(fā)揮抗腦缺血作用的關(guān)鍵通路。

1.6 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

1.6.1 動(dòng)物 SPF級(jí)雄性SD大鼠，8周齡，體質(zhì)量250～290 g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(湘)2019-0004。動(dòng)物房溫度保持(23±1)℃，相對(duì)濕度55%，通風(fēng)良好，飼養(yǎng)于光照/黑暗為12 h/12 h的環(huán)境，每籠4只，自由飲水，給予標(biāo)準(zhǔn)飲食。

1.6.2 試劑與儀器 兔抗p-ERK1/2、p-CREB抗體(美國CST公司)；兔抗BDNF抗體(美國Affinity Biosciences公司)；兔抗GAPDH抗體(武漢博士德生物工程有限公司)。Kopf腦立體定位儀(美國David KOPF Instruments公司)；線栓(北京西濃科技有限公司)。

1.6.3 腦泰方制備 黃芪、川芎、地龍、僵蠶均購自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥房，25 g川芎加80%乙醇浸泡45 min，提取2次，加醇量分別為8、6倍，提取時(shí)間為2、1.5 h，濾過，合并濾液，60 ℃真空濃縮；另取黃芪100 g、地龍37.5 g、僵蠶37.5 g 、川芎醇提后的藥渣適量，加水浸泡30 min，提取2次，每次加10倍量水，提取時(shí)間分別為2、1 h，濾過，合并濾液，真空濃縮，干燥成干浸膏，臨用時(shí)生理鹽水稀釋。前期課題組發(fā)現(xiàn)，1.8、0.9 g/mL腦泰方能顯著改善腦缺血大鼠的神經(jīng)功能缺損體征，故本實(shí)驗(yàn)選擇0.9 g/mL進(jìn)行考察。

1.6.4 模型建立 采用大腦中動(dòng)脈栓塞法制備局灶性腦缺血模型，大鼠腹膜腔注射10%水合氯醛(3.5 mL/kg)麻醉，仰臥位固定做手術(shù)切口，鈍性分離頸總動(dòng)脈和迷走神經(jīng)，微動(dòng)脈夾夾閉頸總動(dòng)脈的近心端，找到頸總動(dòng)脈分叉處并分離頸外動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈，在分叉處結(jié)扎(活結(jié))頸外動(dòng)脈，在附近剪一小口，將拴線插入到頸內(nèi)動(dòng)脈，深度為(18±0.5)mm，右側(cè)大腦中動(dòng)脈栓塞30 min后拔出拴線，將分叉處結(jié)扎(活結(jié))的頸外動(dòng)脈手術(shù)線松開，去除近心端的微動(dòng)脈夾，用簽壓住出血處止血，縫合切口；假手術(shù)組除不插入線栓外，其余步驟同模型組。

1.6.5 分組及給藥 大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、腦泰方組，腦泰方組于腦缺血第1天灌胃給予9 g/kg腦泰方(0.9 g/mL)，每天1次；模型組在腦缺血第1天灌胃給予等體積0.9%生理鹽水，每天1次；假手術(shù)組不干預(yù)。當(dāng)大鼠恢復(fù)意識(shí)能進(jìn)行活動(dòng)后，在第1、7、15天采用Longa 5級(jí)4分法進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分[9]，在第15天后取海馬，檢測p-ERK1/2、p-CREB、BDNF蛋白表達(dá)。

1.6.6 免疫印跡實(shí)驗(yàn) 大鼠斷頭處死，取腦并分離海馬，組織與蛋白提取劑按1∶10比例稀釋，裂解組織，4 ℃、12 000 r/min離心20 min，收集上清液后測定蛋白濃度，SDS-PAGE凝膠電泳，每個(gè)泳道上樣20 μg總蛋白，電泳分離蛋白后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，p-ERK1/2、p-CREB轉(zhuǎn)膜約90 min，BDNF轉(zhuǎn)膜約45 min。一抗孵育(1∶1 000)在4 ℃下過夜，1×TBST 溶液漂洗，稀釋偶聯(lián)HRP標(biāo)記羊抗兔二抗 (1∶10 000)室溫孵育2 h，漂洗后采用ECL化學(xué)發(fā)光法顯影，以GAPDH為內(nèi)參，使用Image J軟件分析目的條帶灰度值，并計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 腦泰方活性成分篩選 共篩選出29種活性成分，另外有10種雖不符合篩選條件，但文獻(xiàn)[10-21]報(bào)道它們也具有相應(yīng)活性，故予以補(bǔ)充，見表1。其中，黃芪占22種，川芎占11種，地龍占8種，僵蠶占6種，見圖1。

表1 腦泰方活性成分信息

2.2 腦泰方活性成分抗腦缺血的靶點(diǎn)預(yù)測和可視化網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 腦泰方39種活性成分共有629個(gè)作用靶點(diǎn)，存在1 819個(gè)相互作用關(guān)系，其中每種活性成分都有2個(gè)以上的作用靶點(diǎn)，平均46.6個(gè)。從TTD、Drugbank、DisGeNET數(shù)據(jù)庫中共獲得腦缺血疾病靶點(diǎn)312個(gè)，本實(shí)驗(yàn)將預(yù)測靶點(diǎn)與其相互映射，共獲取80個(gè)潛在作用靶點(diǎn)，見圖2。

將腦泰方39種活性成分與80個(gè)抗腦缺血的潛在靶點(diǎn)構(gòu)建成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)，網(wǎng)絡(luò)中化合物與靶點(diǎn)相連的連線稱之為度(Degree)，連線越多，自由度越高，表明該節(jié)點(diǎn)(化合物或靶點(diǎn))存在的相互作用關(guān)系越多[22]，見圖3。由此可知，具有較高自由度的靶點(diǎn)包括PTGS2(Degree=24)、PPARG(Degree=12)、NOS2(Degree=9)、VEGFA(Degree=6)、TNF(Degree=5)，具有較多預(yù)測靶點(diǎn)的有槲皮苷(M36，Degree=47)、山柰酚(M28，Degree=26)、異鼠李素(M26，Degree=17)、十八烯酸(M33，Degree=14) 等，可能是腦泰方抗腦缺血的重要藥效成分。

將80個(gè)潛在靶點(diǎn)構(gòu)建了PPI網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)包含1 190種相互作用關(guān)系，其中處于PPI網(wǎng)絡(luò)中心擁有較多蛋白相互作用的靶點(diǎn)有VEGFA(Degree=60)、TNF(Degree=59)、CREB1(Degree=57)、IL6(Degree=56)、CASP3(Degree=55)、BDNF(Degree=53)、MAPK1(Degree=43)等，提示這些蛋白可能是抗腦缺血的重要效應(yīng)蛋白，見圖4。

2.3 GO、KEGG富集分析 采用DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫對(duì)80個(gè)與腦缺血相關(guān)的靶點(diǎn)進(jìn)行GO、KEGG富集分析，篩選排名前20個(gè)GO生物學(xué)過程分析條目，見圖5。GO富集分析結(jié)果表明，腦泰方核心作用靶點(diǎn)主要通過衰老、凋亡過程、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖、血管生成、正調(diào)控磷脂酰肌醇3-激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、血管內(nèi)皮生長因子受體信號(hào)通路、MAPK激活、ERK1和ERK2級(jí)聯(lián)正調(diào)控等生物學(xué)過程來發(fā)揮抗腦缺血的作用；KEGG富集分析結(jié)果表明，腦泰方發(fā)揮抗腦缺血作用可能與MAPK、Neurotrophin、VEGF、PI3K-Akt、癌癥、cAMP、Ras等信號(hào)通路相關(guān)。

2.4 腦泰方對(duì)腦缺血大鼠神經(jīng)功能評(píng)分的影響 腦缺血第7、15天，腦泰方組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分低于模型組(P<0.05，P<0.01)，見表2。

表2 各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分

2.5 腦泰方對(duì)腦缺血大鼠海馬p-ERK1/2、p-CREB、BDNF蛋白表達(dá)的影響 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠海馬p-ERK1/2、BDNF蛋白表達(dá)升高(P<0.05)；與模型組比較，

腦泰方干預(yù)后大鼠海馬p-ERK1/2、p-CREB、BDNF蛋白表達(dá)均升高(P<0.05，P<0.01)，見圖6。

3 討論

中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)構(gòu)建“藥物活性成分-靶點(diǎn)以及疾病-靶點(diǎn)”多層次網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)圖，體現(xiàn)了中醫(yī)的整體性和辯證論治原則[23-24]，目前被廣泛應(yīng)用于探討中藥或中藥復(fù)方在治療復(fù)雜疾病的作用機(jī)制[25-27]。因此本研究擬基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析方法對(duì)腦泰方活性成分進(jìn)行篩選，靶點(diǎn)預(yù)測和疾病相關(guān)性分析，構(gòu)建了成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)和腦泰方-腦缺血相關(guān)性靶點(diǎn)的 PPI 網(wǎng)絡(luò)分析腦泰方治療腦缺血的作用機(jī)制，共獲得了39種活性成分的629個(gè)預(yù)測靶點(diǎn)，平均一種活性成分對(duì)應(yīng)約46.6個(gè)靶點(diǎn)，這充分顯示了腦泰方的多靶點(diǎn)作用。通過腦缺血疾病靶點(diǎn)映射篩選出80個(gè)預(yù)測靶點(diǎn)與腦缺血相關(guān)，發(fā)現(xiàn)腦泰方的主要活性成分中槲皮苷、山柰酚、異鼠李素等擁有較多的預(yù)測靶點(diǎn)，這可能是腦泰方抗腦缺血的重要藥效成分。其中槲皮苷能提高免疫功能[28]，山柰酚和異鼠李素有神經(jīng)保護(hù)作用[29-30]。為了更好地了解腦泰方治療腦缺血的生物學(xué)過程和可能的信號(hào)途徑，將獲得的腦泰方與腦缺血相關(guān)的基因進(jìn)行GO分析和通路分析，結(jié)果顯示腦泰方治療腦缺血的作用途徑主要與衰老、凋亡過程、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖、血管生成、正調(diào)控磷脂酰肌醇3-激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、血管內(nèi)皮生長因子受體信號(hào)通路、MAPK的激活和ERK1和ERK2級(jí)聯(lián)的正調(diào)控有關(guān)。PTGS2、PPARG、NOS2、VEGFA、TNF是參與較多生物學(xué)過程富集的關(guān)鍵基因。細(xì)胞內(nèi)的生物學(xué)功能是由蛋白與蛋白之間的相互作用實(shí)現(xiàn)，這種相互作用包括蛋白之間的直接物理作用和間接的生物學(xué)功能相關(guān)性，因此PPI網(wǎng)絡(luò)中某一蛋白尤其是核心蛋白的異常會(huì)引起級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而產(chǎn)生疾病。本研究構(gòu)建了腦泰方與腦缺血相關(guān)的靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)，通過拓?fù)浞治稣页龊诵陌悬c(diǎn)，結(jié)果顯示，VEGFA、TNF、CREB1、IL6、CASP3、BDNF、MAPK1擁有最多的蛋白相互作用，可能是腦泰方主要通過調(diào)控炎癥、血管生成、G蛋白偶聯(lián)受體信號(hào)通路、類固醇代謝和腺苷酸環(huán)化酶活性、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子和重組人有絲分裂原激活蛋白激酶1的表達(dá)而發(fā)揮藥效作用。KEGG富集結(jié)果進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)MAPK signaling pathway，Neurotrophin signaling pathway等屬于前20條信號(hào)通路。

為了驗(yàn)證網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的預(yù)測結(jié)果，首先從行為學(xué)結(jié)果進(jìn)行了探討，神經(jīng)功能評(píng)分結(jié)果顯示給予腦泰方干預(yù)后，腦缺血大鼠在的神經(jīng)功能評(píng)分降低(P<0.05)，這說明腦泰方能顯著改善腦缺血后大鼠的神經(jīng)功能缺損體征，接著對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行探討。作為MAPK家族中關(guān)鍵組成部分，細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK1/2)是一類絲/蘇氨酸殘基的蛋白激酶。ERK表達(dá)廣泛，涉及細(xì)胞內(nèi)包括細(xì)胞存活、細(xì)胞周期進(jìn)入、細(xì)胞增殖和分化等一系列生命活動(dòng)過程的調(diào)節(jié)。正常情況下ERK在胞漿中表達(dá)，而激活后轉(zhuǎn)移至胞核，通過磷酸化(p-ERK1/2)可以調(diào)節(jié)核內(nèi)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子CREB的表達(dá)而產(chǎn)生細(xì)胞效應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，腦缺血增強(qiáng)了大鼠海馬部位ERK蛋白的磷酸化水平(P<0.05)，而給予腦泰方干預(yù)后p-ERK1/2的蛋白表達(dá)增加(P<0.05)，這提示腦缺血后本身的應(yīng)激可能增強(qiáng)了上游ERK信號(hào)分子的表達(dá)，而通過腦泰方的治療可增加大鼠海馬部位的ERK1/2磷酸化水平。CREB 可在不同信號(hào)通路的激酶作用下實(shí)現(xiàn)ser133磷酸化而活化，在學(xué)習(xí)記憶過程中發(fā)揮重要作用，且受到理化因素刺激后發(fā)生磷酸化(p-CREB)而被激活，促進(jìn)其下游效應(yīng)蛋白腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)的表達(dá)。BDNF作為神經(jīng)營養(yǎng)因子，可改善神經(jīng)再生的微環(huán)境。腦缺血后BDNF的表達(dá)上調(diào)能促進(jìn)腦梗死周圍部位的神經(jīng)再生[31]。p-CREB和BDNF在大腦皮層和海馬的過表達(dá)可發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[32]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與腦缺血模型組比較，腦泰方組大鼠海馬的p-CREB和BDNF蛋白表達(dá)均升高，這說明腦泰方通過促進(jìn)腦缺血大鼠海馬p-CREB和BDNF蛋白的表達(dá)而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

綜上所述，本研究通過網(wǎng)路藥理學(xué)確定腦泰方的抗腦缺血的化學(xué)活性成分、作用靶點(diǎn)及信號(hào)通路，且基于行為學(xué)和蛋白免疫印跡技術(shù)初步驗(yàn)證了腦泰方可通過MAPK/ERK信號(hào)通路發(fā)揮抗腦缺血的作用。