基于PI3K/Akt通路研究孕育丹糖漿防治大鼠多囊卵巢綜合征不孕癥的機制

徐云霞， 徐珺萍， 卞景新

(1.安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，安徽 合肥 230031；2.安徽中醫(yī)藥大學，安徽 合肥 230038)

多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)是一種發(fā)病多因性、臨床表現(xiàn)多態(tài)性的內(nèi)分泌疾病，患病率為8%～13%[1]，占無排卵不孕癥的80%[2]，具體發(fā)病機制尚未明確，其主要特征為高雄激素血癥、卵巢多囊樣改變、排卵功能異常等，而且疾病呈進行性發(fā)展，易致女性生育功能障礙[3]。磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信號通路是動物體內(nèi)基礎信號通路，通路中許多分子參與調(diào)節(jié)卵母細胞的生長、原始卵泡的發(fā)育、顆粒細胞的增殖和分化等過程[4-6]。

中醫(yī)古籍中并無“PCOS”這一病名，根據(jù)其臨床特征將其歸屬于“不孕”“閉經(jīng)”“癥瘕”等范疇[7]，其發(fā)病多與腎、脾、肝關系密切，單證型以腎虛證為主[8]。孕育丹糖漿是國家名老中醫(yī)徐志華教授以“腎藏精，主生殖”的中醫(yī)理論基礎為指導，以“溫腎暖宮，調(diào)補沖任”為治則，結合多年理論研究與臨床實踐創(chuàng)制的具有自主知識產(chǎn)權的特色醫(yī)院制劑，主治腎陽虛性不孕癥，臨床療效確切[9]。本實驗基于PCOS大鼠模型，觀察孕育丹糖漿對PI3K/Akt信號通路的調(diào)控作用，以期闡明其作用機制。

1 材料

1.1 動物 6周齡SPF級雌性SD大鼠60只，體質(zhì)量(180±20)g，由安徽醫(yī)科大學實驗動物中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK(皖)2017-001，飼養(yǎng)于安徽中醫(yī)藥大學動物房，飼養(yǎng)環(huán)境為室溫(22±2)℃，相對濕度 50%～70%，自由攝食飲水，適應性飼養(yǎng)7 d后開始實驗。本實驗經(jīng)過安徽中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會審查批準(審批號2022003)。

1.2 試劑與藥物 孕育丹糖漿(皖藥制字Z20050059)由熟地黃、鹽沙苑子、覆盆子、枸杞子、鹽菟絲子、茺蔚子、蛇床子、仙茅、炙淫羊藿、鹽補骨脂、肉蓯蓉、鎖陽、燙狗脊、當歸組成。枸櫞酸氯米芬(進口藥品注冊證號H20140688)購自塞浦路斯高特制藥有限公司；來曲唑(國藥準字H19991001)購自江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司。羧甲基纖維素溶液(carboxylmethtl cellulose,CMC,1%，批號130225)購自伊勢久(江蘇連云港)生物科技有限責任公司；促卵泡素(FSH)定量檢測試劑盒(貨號RX302805R)、黃體生成素(LH)定量檢測試劑盒(貨號RX303076R)、雌二醇(E2)定量檢測試劑盒(貨號RXJ302812R)、睪酮(T)定量檢測試劑盒(貨號RXJ302700R)均購自泉州市睿信生物科技有限公司；小鼠抗β-actin單克隆抗體(貨號ZA-09)、辣根酶標記山羊抗小鼠IgG(H+L)(貨號ZB-2305)、辣根酶標記山羊抗兔IgG(H+L)(貨號ZB-2301)均購自北京中杉金橋生物技術有限公司；兔抗Akt多克隆抗體(貨號AF6261)、兔抗p-Akt多克隆抗體(貨號AF0016)、兔抗PI3K p85 alpha多克隆抗體(貨號AF6241)、兔抗VEGF多克隆大鼠抗體(貨號AF5131)均購自美國Affinity Biosciences公司；PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒(貨號RR047A)購自日本TaKaRa公司；2×SYBR Green qPCR Master Mix(High ROX)試劑盒(貨號G3322)購自武漢賽維爾生物科技有限公司公司。

1.3 儀器 RT-6100酶標分析儀、RT-3100全自動洗板機均購自美國Rayto公司；EPS300電泳儀、VE-180電泳槽、VE-186轉(zhuǎn)膜儀均購自上海天能科技有限公司；JW-3021HR高速冷凍離心機購自安徽嘉文儀器裝備有限公司；Master-S30 UF純水機購自上海和泰儀器有限公司；JS-M6P自動曝光儀購自上海培清科技有限公司；PTC-200普通PCR儀購自美國Bio-Rad公司；StepOne Plus熒光定量PCR儀購自美國Thermo公司；OD1000+超微量分光光度計購自南京五義科技有限公司。

2 方法

2.1 模型建立 隨機選取10只大鼠為正常組，其余50只大鼠建立PCOS模型。參照文獻[10]報道，正常組大鼠灌胃1% CMC，造模大鼠灌胃來曲唑1 mg/kg(溶于1% CMC)，每天1次，連續(xù)21 d，最后5天進行陰道涂片，灌胃第21天禁食后眼眶后靜脈采血。

2.2 模型驗證 造模最后5 d，每天早上在7：00至8：00收集大鼠陰道分泌物制作陰道涂片，瑞氏染色后在顯微鏡下觀察細胞形態(tài)及數(shù)量比例。圖1～2顯示，造模大鼠陰道涂片無周期性改變，基本維持在動情間期，顯微鏡下陰道涂片可見大量點狀白細胞及少許片狀角質(zhì)化細胞；血清T水平較正常組升高(P<0.01)，表明造模成功。

2.3 給藥方法 造模成功后，造模大鼠隨機分為模型組、枸櫞酸氯米芬組(0.45 mg/100 g)及孕育丹糖漿低、中、高劑量組(1.0、2.0、4.0 mL/100 g)，每組10只，而正常組、模型組大鼠灌胃給予生理鹽水1 mL/100 g，各給藥組大鼠灌胃給予相應劑量藥物，連續(xù)12 d，給藥最后5 d內(nèi)每天進行陰道涂片。給藥結束后，進行腹主動脈采血。

2.4 ELISA法檢測大鼠血清性激素水平 取材前1 d20：00禁食，大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉，取腹主動脈血5 mL，4 000 r/min離心20 min，取上層血清，采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法檢測大鼠血清促卵泡生成素(FSH)、促黃體生成素(LH)水平，酶聯(lián)免疫競爭法檢測血清雌二醇(E2)、睪酮(T)水平。

2.5 HE染色觀察大鼠卵巢組織病理學改變 取血后處死大鼠，摘取卵巢組織，4%多聚甲醛固定，脫水，石蠟包埋，制作切片，常規(guī)HE染色，在普通光學顯微鏡下觀察卵泡的形態(tài)改變并拍照。

2.6 RT-qPCR法檢測大鼠卵巢組織中PI3K、Akt、VEGFmRNA表達 提取大鼠卵巢組織中總RNA，逆轉(zhuǎn)錄反應后得到cDNA，采用實時熒光定量PCR技術檢測PI3K、Akt、VEGFmRNA表達，2-△△CT法計算各基因的相對表達量，引物序列見表1。

表1 引物序列

2.7 Western blot法檢測大鼠卵巢組織中PI3K、Akt、p-Akt蛋白表達 取大鼠卵巢組織適量，加入NP-40細胞裂解液(含PMSF)裂解，12 000 r/min離心15 min，取上清，即得總蛋白，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)模、孵育一抗二抗、顯影后，采用Image J軟件測定各蛋白質(zhì)條帶的吸光度值，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白β-actin的吸光度值比值表示目的蛋白的相對表達量。

2.8 免疫熒光組織化學染色檢測卵巢組織中PI3K、Akt、p-Akt 蛋白的表達和定位 取“2.5”項下大鼠卵巢組織切片適量，經(jīng)常規(guī)脫蠟、水化后牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA) 封閉，滴加兔抗VEGF多克隆抗體(1∶100)，在4 ℃下孵育過夜，次日洗滌后滴加FITC標記的山羊抗兔IgG(1∶400)，室溫避光孵育50 min，DAPI復染細胞核，漂洗后甘油封片，熒光顯微鏡下觀察并拍照，以平均熒光強度為指標進行半定量分析。

3 結果

3.1 陰道涂片檢查 給藥后，正常組大鼠動情周期基本規(guī)律；模型組大鼠動情周期紊亂，基本維持在動情間期，顯微鏡下陰道涂片可見大量點狀白細胞及少許片狀角質(zhì)化細胞；孕育丹糖漿各劑量組和枸櫞酸氯米芬組大鼠動情周期大部分恢復規(guī)律，并呈周期性變化，動情前期可見有核上皮細胞及少量角化細胞；動情期可見大量外形不規(guī)則的角化上皮細胞，有少量有核上皮細胞；動情后期可見不規(guī)則角化上皮細胞，有核上皮細和白細胞均可見,且比例相當。見圖3。

3.2 孕育丹糖漿對PCOS大鼠血清性激素水平的影響 與正常組比較，模型組大鼠血清FSH、LH、T水平升高(P<0.01)，E2水平降低(P<0.01)。與模型組比較，孕育丹糖漿低劑量組FSH、LH、T水平有降低趨勢，E2水平有升高趨勢，但差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；孕育丹糖漿中劑量組FSH、LH、T水平降低(P<0.05，P<0.01)，E2水平升高(P<0.05)；孕育丹糖漿高劑量組及枸櫞酸氯米芬組FSH、LH、T水平降低(P<0.01)，E2水平升高(P<0.01)，見表2。

表2 各組大鼠血清性激素水平

3.3 孕育丹糖漿對PCOS大鼠卵巢組織病理變化的影響 正常組大鼠卵巢組織形態(tài)和細胞結構清晰,可見不同發(fā)育階段的卵泡、多個黃體；模型組大鼠卵巢組織可見大小不等的囊腔，卵泡顆粒細胞層數(shù)較正常組明顯減少，各級卵泡與黃體稀少；與模型組比較，孕育丹糖漿各劑量組大鼠卵巢組織病理變化得到改善，可見各級卵泡及黃體，顆粒細胞層厚度增加且排列整齊，其中高劑量組卵巢改善最明顯；枸櫞酸氯米芬組大鼠卵巢組織內(nèi)可見成熟卵泡，體積較大，卵泡液較多，顆粒細胞層厚度增加但排列較紊亂。見圖4。

3.4 孕育丹糖漿對PCOS大鼠卵巢組織PI3K、Akt、VEGFmRNA表達的影響 與正常組比較，模型組大鼠卵巢組織PI3K、AktmRNA表達降低(P<0.01)，VEGFmRNA表達升高(P<0.01)；與模型組比較，孕育丹糖漿各劑量組和枸櫞酸氯米芬組大鼠卵巢組織PI3K、AktmRNA表達升高(P<0.01)，VEGFmRNA表達降低(P<0.01)，見圖5。

3.5 孕育丹糖漿對PCOS大鼠卵巢組織PI3K、Akt、p-Akt、VEGF蛋白表達的影響 與正常組比較，模型組大鼠卵巢組織PI3K、Akt、p-Akt蛋白表達降低(P<0.01)，VEGF蛋白表達升高(P<0.01)；與模型組比較，孕育丹糖漿各劑量組和枸櫞酸氯米芬組大鼠卵巢組織PI3K、Akt、p-Akt蛋白表達升高(P<0.05，P<0.01)，VEGF蛋白表達降低(P<0.05，P<0.01)，見圖6。

3.6 孕育丹糖漿對PCOS大鼠卵巢細胞中VEGF表達的影響 正常組大鼠卵巢細胞中VEGF表達較少；與正常組比較，模型組大鼠卵巢細胞中VEGF表達增加，呈現(xiàn)明亮的綠色熒光；與模型組比較，孕育丹糖漿各劑量組、枸櫞酸氯米芬組大鼠卵巢細胞中VEGF表達有不同程度的降低，綠色熒光減弱，以枸櫞酸氯米芬組最明顯，見圖7。

4 討論

PCOS以生殖障礙、內(nèi)分泌異常、代謝紊亂和精神問題為特征,其發(fā)病機制尚未闡明[11]。近年來多項研究表明PCOS與PI3K/Akt信號通路密切相關，該通路是調(diào)控細胞增殖、抑制細胞凋亡的重要信號通路[12-13]，其與卵巢功能密切相關，尤其影響顆粒細胞的增殖與凋亡、卵母細胞的成熟[14]。顆粒細胞主要為卵母細胞的生長發(fā)育提供營養(yǎng)，是卵泡成熟的物質(zhì)支持細胞[15]。PCOS患者的卵巢病理改變常為顆粒細胞層萎縮變薄，增殖低下[16]。趙帥等[17]認為激活PI3K/Akt信號通路以增強顆粒細胞的增殖能力，降低其凋亡率，有助于改善PCOS排卵障礙。本研究發(fā)現(xiàn)，PCOS大鼠卵巢中PI3K/Akt信號通路關鍵蛋白及基因的表達較正常大鼠降低，且顆粒細胞層菲薄、紊亂；給予孕育丹糖漿治療后，PI3K/Akt通路相關因子表達升高，顆粒細胞層病理損傷明顯修復，說明激活PI3K/Akt信號通路可以上調(diào)顆粒細胞的增殖能力，明顯改善卵巢病理改變。與孕育丹糖漿比較，氯米芬的作用效果更佳，但氯米芬存在自身局限性，首先，其本質(zhì)是抗雌激素藥物[18]，易致宮頸黏液變稠，子宮內(nèi)膜容受性差，不利于受精及著床；其次，大約15%～40%女性對氯米芬不敏感，出現(xiàn)氯米芬抵抗[19]。前期研究表明，臨床治療PCOS時聯(lián)合應用孕育丹糖漿可提高排卵率、妊娠率[20]。

《周易》有云：“天地氤氳，萬物化醇，男女媾精，萬物化生”，說明受孕關鍵在于腎中精氣充盛。腎陰為卵泡發(fā)育成熟的物質(zhì)基礎，腎陽是鼓動卵子排出的動力來源?！半硽杵凇奔础敖?jīng)間排卵期”，為陰陽二氣相接之際，癸水充盛，腎陽充旺，由此可見，腎精充足，陽氣旺盛，重陰轉(zhuǎn)陽順利，乃可排出卵子。徐志華教授認為PCOS主因臟腑功能失調(diào)，其中尤以腎虛為關鍵，治療時以溫補腎陽為主，輔以益陰。孕育丹糖漿由熟地黃、鹽沙苑子、覆盆子、枸杞子、鹽菟絲子、茺蔚子、蛇床子、仙茅、炙淫羊藿、鹽補骨脂、肉蓯蓉、鎖陽、燙狗脊、當歸組成，共奏溫腎助陽、調(diào)補沖任之功。方中重用補腎溫陽之品，同時選用少量滋養(yǎng)腎陰的藥物，溫而不燥，陰陽俱顧。孕育丹糖漿通過補益腎中陰陽，使卵泡成熟化生有源，卵子排出得以鼓動，其補陽之力尤甚，保證了氤氳期重陰轉(zhuǎn)陽的順利運行。

綜上所述，孕育丹糖漿防治PCOS的機制可能是通過補益腎中陽氣以激活PI3K/Akt信號通路，改善卵巢功能，修復顆粒細胞層損傷，從而提高卵泡質(zhì)量，增加排卵率，最終達到提高妊娠率的目標。