一種花生高效復(fù)合微生物菌劑及其應(yīng)用

張俊杰王 楠李 碩彭姍姍尚益民柴帥杰陳錦永陳文峰

(1.鄭州輕工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,河南 鄭州 450001;2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹(shù)研究所,河南 鄭州 450000;3.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)根瘤菌研究中心,北京 100193)

花生(ArachishypogaeaL.)屬豆科植物,是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物之一,也是河南省第一大油料作物,果實(shí)中不僅含有較豐富的蛋白質(zhì)和油脂,還具有藥用保健價(jià)值[1]。河南是我國(guó)農(nóng)業(yè)大省,花生種植面積和總產(chǎn)量常年居全國(guó)首位。長(zhǎng)期以來(lái),高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)一直是花生生產(chǎn)追求的目標(biāo)。但在傳統(tǒng)耕作時(shí)期,由于無(wú)機(jī)化肥具有價(jià)格低、施用方便和高效等特點(diǎn),農(nóng)民種植花生時(shí)過(guò)度依賴(lài)化肥,且施肥方法不科學(xué),使得產(chǎn)區(qū)花生的產(chǎn)量、品質(zhì)大大下降,同時(shí)土壤板結(jié)、酸化等問(wèn)題逐漸顯露出來(lái),嚴(yán)重制約了我國(guó)生態(tài)環(huán)境的改善[2]。農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展在我國(guó)仍面臨著重大挑戰(zhàn),減肥增效已成為我國(guó)走綠色農(nóng)業(yè)和農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展道路的必然選擇。

近年來(lái),微生物菌劑在提高農(nóng)作物產(chǎn)量、抗病蟲(chóng)害等方面已成為研究熱點(diǎn)。微生物菌劑是通過(guò)大量有益微生物的生命活動(dòng)和新陳代謝產(chǎn)物來(lái)改善土壤微生態(tài)環(huán)境,最終可以達(dá)到促進(jìn)作物生長(zhǎng)、減輕作物病害、改善作物產(chǎn)量和品質(zhì)等目的[3]。在農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的背景下,微生物菌劑以低成本來(lái)提高作物產(chǎn)量,有助于緩解無(wú)機(jī)化肥給環(huán)境帶來(lái)的破壞。大量研究表明,微生物菌劑已在大豆[4]、紫云英[5]、馬鈴薯[6]、玉米[7]等農(nóng)作物的種植過(guò)程中得到應(yīng)用,能顯著提高農(nóng)作物的產(chǎn)量及其他生長(zhǎng)指標(biāo)。近年來(lái),人們將根瘤菌和芽孢桿菌作為制作微生物菌劑的常用菌種?；ㄉ鼍赏ㄟ^(guò)與花生根系部位共生結(jié)瘤,提高植株生物量,從而達(dá)到增產(chǎn)目的[8]。芽孢桿菌可以釋放土壤中的鉀素,改善土壤肥力,并通過(guò)分泌激素、氨基酸等物質(zhì)來(lái)促進(jìn)農(nóng)作物的生長(zhǎng)[9]。目前,根瘤菌劑已向多功能的復(fù)合菌劑方向發(fā)展,將根瘤菌與有益菌株復(fù)合接種,更加利于豆科植物進(jìn)行共生結(jié)瘤和生長(zhǎng)。劉曄等[10]在華北地區(qū)土中篩選出一株產(chǎn)IAA的芽孢桿菌,分泌IAA量高達(dá)49.06 mg/m L,能夠顯著促進(jìn)花生的生長(zhǎng)?？诐萚11]研究發(fā)現(xiàn)將膠質(zhì)芽孢桿菌和根瘤菌復(fù)合接種紫花苜蓿,顯著提高了紫花苜蓿的產(chǎn)量指標(biāo),具有明顯協(xié)同作用。馬鳴超等[12]認(rèn)為復(fù)合接種膠質(zhì)類(lèi)芽孢桿菌和慢生大豆根瘤菌后,改善了大豆品質(zhì)和土壤微生物環(huán)境,并實(shí)現(xiàn)大豆增產(chǎn)9.3%。酵母菌在改善作物產(chǎn)量方面也有一定研究,李想等[13]研究發(fā)現(xiàn)在種植花生過(guò)程中施用粘紅酵母菌劑對(duì)花生生長(zhǎng)和產(chǎn)量存在促進(jìn)作用,同時(shí)也提高了土壤中細(xì)菌群落的豐富度和均勻度。由此可知,選用合適的復(fù)合菌劑對(duì)花生共生固氮和生長(zhǎng)是有必要的。目前關(guān)于芽孢桿菌、花生慢生根瘤菌單接種的微生物菌劑應(yīng)用較廣泛,但兩者復(fù)合接種、結(jié)合酵母菌在花生上的抗病性、促生性方面的研究則較少。

本研究以河南地區(qū)主栽花生品種遠(yuǎn)雜9102為試驗(yàn)材料,以花生慢生根瘤菌ZB15、芽孢桿菌1C-6和酵母菌1-103為研究對(duì)象,在實(shí)驗(yàn)室條件下,通過(guò)盆栽試驗(yàn)探究不同菌株單接種、復(fù)合接種對(duì)花生生長(zhǎng)指標(biāo)和光合作用的影響,以期獲得最優(yōu)菌劑組合,為開(kāi)發(fā)花生復(fù)合菌劑提供理論依據(jù)和技術(shù)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

花生品種為遠(yuǎn)雜9102,由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花油料作物研究所提供。花生慢生根瘤菌ZB15(產(chǎn)IAA值為82.585 mg/L)、芽孢桿菌1C-6(產(chǎn)IAA值為37.15 mg/L)和廣譜生防酵母菌1-103(抗花生尖孢鐮刀菌)均為鄭州輕工業(yè)大學(xué)微生物資源挖掘與應(yīng)用研究室篩選獲得的優(yōu)良菌株。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法

1.2.1 供試菌株的培養(yǎng)

參考黃曉娜等[14]的方法,將保存在鄭州輕工業(yè)大學(xué)微生物資源挖掘與應(yīng)用研究室的優(yōu)勢(shì)菌株的花生慢生根瘤菌ZB15、芽孢桿菌1C-6、廣譜生防酵母菌1-103分別接種于YMA 固體培養(yǎng)基、LB固體培養(yǎng)基和YEPD 固體培養(yǎng)基上,28℃恒溫培養(yǎng)7、2、3 d,并挑取單菌落到Y(jié)MA 液體培養(yǎng)基、LB液體培養(yǎng)基和YEPD 液體培養(yǎng)基中[15],于28℃、180 r/min 搖床中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,OD600值統(tǒng)一調(diào)為0.8。

1.2.2 盆栽實(shí)驗(yàn)

挑選顆粒飽滿(mǎn)、大小適當(dāng)且表面完整的花生種子,在無(wú)菌環(huán)境下對(duì)種子進(jìn)行消毒,消毒處理為:95%乙醇浸泡30 s,加入0.2%升汞溶液浸泡5 min,無(wú)菌水清洗種子7次[16]。消毒后的種子擺在0.8%水瓊脂培養(yǎng)基上,置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)3 d,待花生種子根長(zhǎng)長(zhǎng)至2 cm 左右即可栽種。無(wú)菌條件下,將已滅菌的蛭石裝進(jìn)上層缽體(已滅菌)中,以距離上層缽體口1～2 cm為宜,挑選芽長(zhǎng)2 cm 左右的花生栽種在上層缽體中的蛭石中,根部朝下,待上層缽體中種子種植后即可在下層缽體(已消毒)補(bǔ)充適量水分[17]。

試驗(yàn)共設(shè)7個(gè)處理,具體處理如表1所示。單接種T1、T2、T3時(shí)分別吸取菌液1 mL加至花生根部,復(fù)合接種T4、T5、T6時(shí)分別吸取0.5 mL菌液至花生根部,封口膜封住上層缽口,每處理6次重復(fù)。將各處理組置于人工氣候培養(yǎng)箱(25℃光照16 h,濕度60%;20℃黑暗8 h,濕度40%)中,期間適當(dāng)向下層缽體中補(bǔ)充水分,45 d(初花期)后收獲并測(cè)定生長(zhǎng)指標(biāo)[17]。

表1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Experiment design

1.3 測(cè)定項(xiàng)目與方法

1.3.1 葉綠素的測(cè)定

按照參考文獻(xiàn)[18]的方法測(cè)定花生葉片的葉綠素相對(duì)含量,采用SPAD-502 Plus便攜式葉綠素測(cè)定儀,選取花生主枝頂端下左側(cè)第2片葉片進(jìn)行測(cè)定,求其平均值。

1.3.2 根瘤的測(cè)定與觀察

對(duì)花生植株的根瘤進(jìn)行計(jì)數(shù),觀察根瘤的形狀與根瘤橫切面的顏色[16]。

1.3.3 生長(zhǎng)指標(biāo)的測(cè)定

測(cè)量花生的莖基部到頂端的長(zhǎng)度為株高,而根長(zhǎng)則是從莖基部到主根根尖[19]。將植株的地上部與地下部從莖基部剪開(kāi),將同一處理植株的地上部、地下部分別置于70℃烘箱中烘至恒質(zhì)量,稱(chēng)量地上部與地下部的干質(zhì)量。每組處理選5株花生植株,求出平均值,并計(jì)算花生植株的根冠比,計(jì)算公式如下[20]:

1.3.4 促生性綜合評(píng)價(jià)

接種菌劑對(duì)花生促生能力的評(píng)價(jià)是參考文獻(xiàn)[21-22]中的方法,應(yīng)用模糊數(shù)學(xué)中的隸屬函數(shù)值法,對(duì)測(cè)定的各指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià),隸屬函數(shù)值計(jì)算公式如下:

式中:X為測(cè)量不同處理組花生植株各指標(biāo)的平均值,Xmin和Xmax分別為測(cè)量花生植株各指標(biāo)的最小值和最大值。隸屬函數(shù)值公式(2)適用于測(cè)量花生指標(biāo)與促生能力呈正相關(guān),否則適用公式(3)。將每個(gè)處理的7個(gè)指標(biāo)隸屬函數(shù)值相加,求平均值,隸屬函數(shù)值的平均值越大,表明該處理對(duì)花生的促生能力越強(qiáng)[22]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2010 和SPSS 19 對(duì)所測(cè)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析及顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 接種不同菌株對(duì)花生葉片葉綠素含量的影響

葉綠素含量與豆科植物光合作用和吸收養(yǎng)分緊密聯(lián)系[23]。由圖1可以看出,接菌處理的花生植株葉片的葉綠素含量均高于不接菌的葉綠素含量,且構(gòu)成顯著差異(P＜0.05)。接菌處理的花生植株葉片SPAD 值在37.16～50.13 之間,以復(fù)合接種T6 處理的花生植株葉片SPAD 值最高,達(dá)50.13,是不接菌處理的1.77 倍,其次為T(mén)5、T4處理,分別是不接菌處理葉片SPAD 值的1.68、1.58倍。

圖1 接種不同菌株對(duì)花生葉片葉綠素含量的影響Fig.1 Inoculation of different strains on chlorophyll content of peanut leaves

2.2 接種不同菌株對(duì)花生植株生長(zhǎng)特性的影響

2.2.1 對(duì)株高的影響

植株株高反映出在不同菌株處理?xiàng)l件下對(duì)花生植株生長(zhǎng)的影響。由圖2可以看出,接菌處理對(duì)花生植株的株高有不同程度的促進(jìn)作用。與不接菌處理相比,所有接菌的花生株高增幅范圍在5.03～11.60 cm 之間,差異顯著(P＜0.05)。其中,復(fù)合接種T6處理對(duì)花生植株株高生長(zhǎng)的促進(jìn)效果最佳,高達(dá)38.53 cm,較不接菌處理增加了43.06%。單接種T3 處理和復(fù)合接種T5 處理的植株株高次之,分別高于不接菌植株株高41.10%、39.85%,但三者差異不顯著。

圖2 接種不同菌株對(duì)花生植株株高的影響Fig.2 Inoculation of different strains on the height of peanut plant

2.2.2 對(duì)根長(zhǎng)的影響

從圖3看出,接種不同菌株處理對(duì)花生植株根長(zhǎng)生長(zhǎng)的影響差異顯著(P＜0.05)。所有接種菌株處理的花生植株根長(zhǎng)都高于不接菌處理,增幅范圍在15.10%～62.28%之間。其中,復(fù)合接種T6處理的花生植株根長(zhǎng)最長(zhǎng),比不接菌處理的長(zhǎng)62.28%,復(fù)合接種T5、T4處理次之。單接種T1處理對(duì)花生植株根長(zhǎng)的生長(zhǎng)促進(jìn)效果不明顯,僅比不接菌根長(zhǎng)長(zhǎng)1.6 cm,與單接種T2處理的根長(zhǎng)無(wú)顯著差異。

圖3 接種不同菌株對(duì)花生植株根長(zhǎng)的影響Fig.3 Inoculation of different strains on the root length of peanut plant

2.2.3 對(duì)生物量的影響

表2可知,接種菌株處理對(duì)花生植株生物量有較明顯的促進(jìn)作用,各處理花生地上部生物量、地下部生物量和根冠比之間差異顯著(P＜0.05)。與不接菌處理相比,所有接菌處理的花生植株地上部生物量明顯增加,增幅為27.67%～92.99%。其中,復(fù)合接種T6處理植株地上部生物量最大,復(fù)合接種T5處理次之。所有接菌處理的花生植株地下部生物量比不接菌處理提高了57.54%～152.83%,其中地下部生物量增幅高于100%的處理組有復(fù)合接種T6、復(fù)合接種T4、單接種T3,以復(fù)合接種T6處理地下部生物量增幅最大。接種菌株處理的植株根冠比與不接菌處理相比提高了6.34%～49.20%,其中以單接種T1處理根冠比為最大,其次為單接種T3、復(fù)合接種T4 和單接種T2處理。

表2 接種不同菌株對(duì)花生植株生物量及根冠比的影響Table 2 Effect of inoculation with different strains on the biomass and root-shoot ratio of peanut plant

2.2.4 對(duì)結(jié)瘤的影響

評(píng)價(jià)植株結(jié)瘤效率的重要指標(biāo)之一是單株結(jié)瘤數(shù),結(jié)瘤數(shù)越多,花生固氮能力越強(qiáng)。圖4可見(jiàn),不接菌處理、單接種T1和單接種T2處理不能與花生形成結(jié)瘤,表明單接種芽孢桿菌和酵母菌不能與花生結(jié)瘤。單接種T3處理和復(fù)合接種T4、T5、T6處理均能與花生形成根瘤,且為粉紅色、圓形的有效根瘤?；ㄉ鷨沃杲Y(jié)瘤數(shù)以T6處理最多,高達(dá)82個(gè),這表明復(fù)合接種ZB15+1C-6+1-103能促進(jìn)花生根部根瘤的形成,且效果優(yōu)于其他處理。

圖4 接種不同菌株對(duì)花生植株結(jié)瘤數(shù)的影響Fig.4 Inoculation of different strains on the root nodule number of peanut plant

2.3 不同菌株處理對(duì)花生綜合指數(shù)效應(yīng)的隸屬函數(shù)分析

隸屬函數(shù)分析是將所測(cè)植株葉綠素含量和一些生長(zhǎng)指標(biāo)作為綜合指標(biāo),以此來(lái)分析不同菌株處理對(duì)花生植株的促生能力影響的大小。綜合評(píng)價(jià)值越大,其促生能力就越強(qiáng)。表3可知,復(fù)合接種T6處理的綜合評(píng)價(jià)值最高,為0.561,其次為復(fù)合接種T4處理,單接種T3處理再次之。這表明了復(fù)合接種ZB15+1C-6+1-103處理對(duì)花生植株的生長(zhǎng)具有良好的促生作用。

表3 花生植株的生長(zhǎng)指標(biāo)及葉綠素含量的平均隸屬函數(shù)值Table 3 Average membership function value of growth indicators and chlorophyll content of peanut plant

3 討論

微生物菌劑替代無(wú)機(jī)化肥,是順應(yīng)我國(guó)綠色農(nóng)業(yè)發(fā)展的潮流,已成為我國(guó)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的迫切要求。施加微生物菌劑能促進(jìn)花生生長(zhǎng),有助于花生根部根瘤的形成和共生固氮[3]。諸多研究表明,豆科植物的葉綠素含量與氮素、光合作用三者之間緊密相連,葉綠素含量的大小影響植株光合產(chǎn)物的形成與積累,從而影響作物產(chǎn)量[24]。施用復(fù)合菌劑能夠顯著增加大豆的葉綠素含量,Chl a/b比值低于單接種菌劑,意味著兩種菌劑能夠互利共生,改善土壤根際環(huán)境,提高土壤有機(jī)質(zhì)含量,促進(jìn)了根對(duì)氮素的吸收[25]。本研究表明,接種不同菌劑后提高了花生葉片的葉綠素含量,其中以根瘤菌ZB15、芽孢桿菌1C-6和酵母菌1-103三者復(fù)合接種處理花生的葉綠素含量最高,這與趙丹丹[26]研究發(fā)現(xiàn)在番茄生長(zhǎng)過(guò)程中接種微生物菌劑后葉綠素含量升高,提升了光合作用的結(jié)果相似。本研究發(fā)現(xiàn),與對(duì)照相比,復(fù)合接種T6處理的花生地上部生物量、地下部生物量、株高和根長(zhǎng)分別提高了92.99%、150.83%、28.44%、62.28%,這與Atieno[27]和李想[13]分別在大豆、花生上的研究結(jié)果一致。接種單一菌株對(duì)豆科植物的作用效果明顯弱于復(fù)合菌株組合接種,但目前復(fù)合菌劑對(duì)植物的作用機(jī)理還有待深入研究。

本研究表明,復(fù)合接種芽孢桿菌、根瘤菌、酵母菌對(duì)花生生長(zhǎng)有一定的促進(jìn)作用,各處理的促進(jìn)效果排序?yàn)門(mén)6＞T4＞T5＞T3＞T1＞T2,其中以復(fù)合接種ZB15+1C-6+1-103對(duì)花生植株生長(zhǎng)的促進(jìn)作用最優(yōu),該處理下花生結(jié)瘤數(shù)、根長(zhǎng)、株高、生物量和葉綠素含量均為最高,表明復(fù)合菌種可以顯著促進(jìn)花生的生長(zhǎng)。因此,篩選合適的復(fù)合微生物菌劑的菌種組合對(duì)綠色農(nóng)業(yè)的發(fā)展十分重要,同時(shí)也為復(fù)合菌劑對(duì)河南主產(chǎn)區(qū)花生產(chǎn)量和品質(zhì)的提升給予了一定的數(shù)據(jù)參考。