花生組織抗氧化生理生化指標(biāo)快速測定方法

于 瑩王馨寧孫澤鑫蔣春姬趙新華于海秋王 婧

(沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院,遼寧 沈陽 110866)

植物組織感受到周圍環(huán)境變化時(shí),可通過調(diào)控自身的代謝水平,維持細(xì)胞正常生理功能[1]。測定生理生化指標(biāo)的變化是探討逆境下植物內(nèi)部生理特點(diǎn)變化的基礎(chǔ),也是確定植物分子機(jī)制的關(guān)鍵。如何快速而準(zhǔn)確地測定生理生化指標(biāo),對(duì)了解逆境下植物生理代謝變化具有重要意義,同時(shí)也可為確定植物對(duì)外界環(huán)境的響應(yīng)機(jī)制提供重要信息[2-9]。課題組前期測定花生葉片和根系組織超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、丙二醛(MDA)、可溶性蛋白(SP)等抗氧化生理生化指標(biāo)時(shí),均采用傳統(tǒng)方法;而在試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)該方法提取粗酶液的過程耗時(shí)、耗力,酶易失活,測定數(shù)據(jù)效率低、誤差較大。針對(duì)這些缺點(diǎn),對(duì)傳統(tǒng)測定方法進(jìn)行改進(jìn),例如,采用液氮凍樣,預(yù)冷組織研磨器,測定時(shí)等比例加入反應(yīng)液及酶液。另外,改用酶標(biāo)儀測定樣品吸光度,建立了SOD、POD、MDA、SP 等生理生化指標(biāo)的快速測定方法。本文檢測了花生葉片及根系在干旱逆境處理?xiàng)l件下生理生化指標(biāo)的變化,驗(yàn)證了新方法的可行性和準(zhǔn)確性,可在常規(guī)科研中使用。該測定方法具有節(jié)省材料、耗時(shí)短、準(zhǔn)確率高等優(yōu)點(diǎn),適合大批量花生組織的快速測定,為廣大科研工作者提供了改進(jìn)方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料培養(yǎng)

試驗(yàn)材料為花生,置于沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院幼苗培養(yǎng)室(光暗周期16 h/8 h,濕度60%,溫度晝28℃/夜23℃)進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2 植物組織預(yù)處理

花生幼苗培養(yǎng)至三葉一心期,用20%PEG-6000模擬干旱環(huán)境,分別在干旱脅迫后0、3、6、9、12、24 h進(jìn)行取樣。

1.2.1 快速測定方法

將花生葉片和根部組織各取0.2 g剪碎,立即裝入內(nèi)有1～2粒直徑0.2 mm 鋼珠的2.0 mL離心管中,標(biāo)好序號(hào)后放入-80℃超低溫冰箱中凍存。測定前將待測樣品從超低溫冰箱轉(zhuǎn)入液氮中至少0.5 h(圖1 a),裝入事先經(jīng)冷凍處理的組織研磨適配器中(48×2 mL)(圖1 b),利用高通量組織研磨器(SCIENTZ-48) 在60～70 Hz下研磨120～180 s(圖1 c)。研磨結(jié)束加入2 mL 4℃預(yù)冷的磷酸緩沖液(PBS,p H=7.8),利用旋渦震蕩儀(VETEX SHAKER QL-866)混勻(圖1 d),隨后在冷凍高速離心機(jī)(HEMA TGL-16R Refrigerated Centrifuge)13 000 r/min下離心15 min(圖1 e),上清液即為酶粗提液(圖1 f)。

圖1 快速測定方法的操作流程Fig.1 The procedure of rapid determination

1.2.2 傳統(tǒng)測定方法

將花生葉片和根部組織各取0.5 g裝入自封袋,做好標(biāo)記放入-80℃超低溫冰箱中凍存。測定各項(xiàng)目之前,將待測樣品從超低溫冰箱中轉(zhuǎn)入4℃預(yù)冷的研缽中,加入石英砂和2 mL磷酸緩沖液(PBS,p H=7.8)于冰盒上手動(dòng)研磨120 s,研磨成勻漿后倒入5 mL離心管中,并用3 mL磷酸緩沖液沖洗研缽,一同倒入離心管,利用高速落地冷凍離心機(jī)(Thermo Fisher SCIENTIFIC,LYNX4000)15 000 r/min離心20 min,上清液即為酶粗提液。

1.3 項(xiàng)目測定

1.3.1 超氧化物歧化酶(SOD)活性測定采用氮藍(lán)四唑(NBT)光化還原法[10]

反應(yīng)液的配制和顯色反應(yīng)過程,快速測定方法與傳統(tǒng)測定方法相同。

(1)測定步驟。

取50 mL小燒杯,加入顯色混合液2.95 mL,粗酶液0.05 mL,再取4個(gè)相同規(guī)格燒杯加入混合液2.95 mL和磷酸緩沖液0.05 mL,其中3個(gè)與樣品一同放入光照培養(yǎng)箱(照度6 000 lx)照光30 min,另外一個(gè)放入暗室作為對(duì)照,樣品照光30 min后取出放入暗室終止反應(yīng),以遮光的對(duì)照管作為空白調(diào)零,分別在560 nm 下測定各管吸光度值。

快速測定方法:每個(gè)樣品取0.3 mL 待測液加入酶標(biāo)板,于酶標(biāo)儀(Thermo SCIENTIFIC,MULTISKAN GO)中測定。

傳統(tǒng)測定方法:每個(gè)樣品取3 mL 待測液加入比色皿中,放進(jìn)紫外/可見分光光度計(jì)(PerkinElmer,Lambda 365)中進(jìn)行測定。

(2)兩種方法結(jié)果計(jì)算公式一致。

1.3.2 過氧化物酶(POD)活性測定采用愈創(chuàng)木酚法[10]

(1)反應(yīng)液的配制。

快速測定方法:0.1 mol/L pH=6.0的磷酸緩沖液50 mL加入燒杯中,加入愈創(chuàng)木酚28μL,水浴加熱搖勻直至愈創(chuàng)木酚完全溶解,測定前加入30%的過氧化氫19μL,充分溶解后,將反應(yīng)液分裝到2 mL離心管中,置于37℃溫浴器中5～8 min。

傳統(tǒng)測定方法:0.1 mol/L pH=6.0的磷酸緩沖液100 mL加入燒杯中,加入愈創(chuàng)木酚56μL,水浴加熱搖勻直至愈創(chuàng)木酚完全溶解,測定前加入30%的過氧化氫38μL,充分溶解后,置于37℃水浴鍋中待用。

(2)測定步驟。

快速測定方法:分別吸取0.005 mL酶粗提液并加入0.295 mL反應(yīng)液于酶標(biāo)板中,波長470 nm下,從反應(yīng)0 s開始,每30 s測定一次吸光度,共計(jì)6 個(gè)數(shù)值,即測定150 s終止,記錄150 s內(nèi)ΔA470變化。以0.295 mL 反應(yīng)液加0.005 mL緩沖液對(duì)照調(diào)零。

傳統(tǒng)測定方法:分別吸取0.05 mL酶粗提液并加入2.95 mL反應(yīng)液于比色皿中,波長470 nm下,從反應(yīng)0 s開始,每30 s測定一次吸光度,共計(jì)6 個(gè)數(shù)值,即測定150 s終止,記錄150 s內(nèi)ΔA470變化。以29.5 mL反應(yīng)液加0.05 mL 緩沖液對(duì)照調(diào)零。

(3)兩種方法結(jié)果計(jì)算公式一致。

1.3.3 丙二醛(MDA)含量測定采用硫代巴比妥酸比色法(TBA)[10]

(1)反應(yīng)液的配制。

快速測定方法與傳統(tǒng)測定方法此步驟相同。

(2)測定步驟。

快速測定方法:選取新的2 mL離心管編號(hào),分別往新離心管中加入粗提取液0.3 mL和0.5%的TBA 0.3 mL,沸水浴15 min,迅速冷卻后離心(8 000 r/min,10 min),每個(gè)樣品吸取0.3 mL上清液加到酶標(biāo)板中,在波長532 nm、600 nm 下測定吸光度值。

傳統(tǒng)測定方法:選取新的5 mL離心管編號(hào),分別往新離心管中加入粗提取液1.5 mL和0.5%的TBA 1.5 mL,沸水浴15 min,迅速冷卻后離心(8 000 r/min,10 min),上清液移至比色皿中,在波長532 nm、600 nm 下測定吸光度值。

(3)兩種方法結(jié)果計(jì)算公式一致。

1.3.4 可溶性蛋白質(zhì)(SP)含量測定采用考馬斯亮藍(lán)染色法[10]

(1)反應(yīng)液的配置和標(biāo)準(zhǔn)曲線配制。

快速測定方法與傳統(tǒng)測定方法此步驟相同。

(2)測定步驟。

快速測定方法:分別吸取0.29 mL 考馬斯亮藍(lán)溶液和0.01 mL 酶粗提取液加入酶標(biāo)板中混勻,反應(yīng)2 min,595 nm 波長下比色,以0.29 mL考馬斯亮藍(lán)溶液加0.01 mL 磷酸緩沖液(0.05 mol/L pH=7.8)對(duì)照調(diào)零。

傳統(tǒng)測定方法:分別吸取2.9 mL 考馬斯亮藍(lán)溶液和0.1 mL 酶粗提取液置于比色皿中混勻,反應(yīng)2 min,595 nm 波長下比色,以2.9 mL考馬斯亮藍(lán)溶液加0.1 mL 磷酸緩沖液(0.05 mol/L pH=7.8)對(duì)照調(diào)零。

(3)兩種方法結(jié)果計(jì)算公式一致。

2 結(jié)果與分析

2.1 快速測定方法與傳統(tǒng)測定方法的測定數(shù)據(jù)對(duì)比分析

分別使用快速測定方法和傳統(tǒng)測定方法做重復(fù)性試驗(yàn),具體結(jié)果如表1、表2所示。

2.1.1 花生根系不同抗氧化指標(biāo)測定數(shù)據(jù)的差異顯著性分析

對(duì)兩種測定方法在花生根系中測定的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)分析,判斷兩種方法得到的數(shù)據(jù)是否存在顯著性差異(表1)。數(shù)據(jù)分析表明,SOD、POD、MDA 和SP指標(biāo)的t檢驗(yàn)概率事件數(shù)值分別為0.98,1.00,0.88和0.08,均大于0.05,說明快速測定方法與傳統(tǒng)測定方法測定的結(jié)果差異不顯著,快速測定方法可以代替?zhèn)鹘y(tǒng)方法測定花生組織中的抗氧化生理生化指標(biāo)。

表1 兩種方法測定根系抗氧化指標(biāo)的結(jié)果差異性比較Table 1 Comparison of the difference of antioxidant indexes in root with two methods

2.1.2 花生葉片不同抗氧化指標(biāo)測定數(shù)據(jù)的差異顯著性分析

對(duì)兩種測定方法在花生葉片中測定的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn),判斷兩種方法得到的數(shù)據(jù)是否存在差異顯著性(表2)。數(shù)據(jù)分析表明,SOD、POD、MDA 和SP指標(biāo)的t檢驗(yàn)概率事件的數(shù)值分別為0.81,0.96,0.85和0.97,均大于0.05,說明快速測定方法與傳統(tǒng)測定方法測定的結(jié)果差異不顯著,快速測定方法可代替?zhèn)鹘y(tǒng)方法測定花生組織中的抗氧化生理生化指標(biāo)。

表2 兩種方法測定葉片抗氧化指標(biāo)的結(jié)果差異性比較Table 2 Comparison of the difference of antioxidant index in leaves with two methods

2.2 快速測定方法與傳統(tǒng)測定方法的用時(shí)對(duì)比

表3可見,快速測定方法和傳統(tǒng)測定方法研磨樣品及測定時(shí)所需的理論時(shí)間差異,其中快速測定方法研磨70個(gè)樣品所需時(shí)間120～300 s(圖2 a),當(dāng)天測定4個(gè)生理生化指標(biāo)理論耗時(shí)約2.0～2.5 h;傳統(tǒng)測定方法研磨1個(gè)樣品的時(shí)間為120 s(圖2 b),研磨70個(gè)樣品所需時(shí)間約8 400 s,當(dāng)天測定4個(gè)生理生化指標(biāo)理論耗時(shí)約7.0～8.1 h。

圖2 快速測定方法和傳統(tǒng)測定方法研磨樣品用時(shí)及樣品數(shù)量對(duì)比Fig.2 Comparison of required ground time and sample number between rapid measurement method and traditional measurement method

表3 快速測定方法和傳統(tǒng)測定方法的理論用時(shí)對(duì)比Table 3 Comparison of theoretical required time between rapid measurement method and traditional measurement method

但在實(shí)際操作中,使用快速測定方法當(dāng)天檢測4個(gè)生理生化指標(biāo)時(shí),研磨過程可在5 min內(nèi)完成,加上配制反應(yīng)液等步驟,大約耗時(shí)10～12 h。

而傳統(tǒng)測定方法往往耗時(shí)更久,研磨過程主要在冰盒上完成,不僅樣品易失活而且耗費(fèi)人力。當(dāng)天檢測70個(gè)樣品的4個(gè)生理生化指標(biāo),需耗時(shí)24～30 h。而且在指標(biāo)測定過程中,需要及時(shí)清洗比色皿,逐步進(jìn)行不同項(xiàng)目的測定,等待軟件運(yùn)行,消耗更多時(shí)間。因此,可以看出快速測定方法的用時(shí)約為傳統(tǒng)測定方法的一半;另外,快速測定方法研磨出的樣品勻漿液的均勻度高于傳統(tǒng)測定方法,可降低同一批次數(shù)據(jù)誤差 (圖3)。

圖3 快速測定方法(左)和傳統(tǒng)測定方法(右)樣品均一度對(duì)比Fig.3 Uniformity comparison of grinding sample between rapid measurement method (left)and traditional measurement method (right)

3 討論

本文介紹的花生組織抗氧化生理生化指標(biāo)測定方法快速直接,與傳統(tǒng)測定方法相比具有以下優(yōu)點(diǎn):

①減少樣品用量。傳統(tǒng)測定方法通常選取0.5 g樣品,設(shè)三個(gè)重復(fù)進(jìn)行測定;而實(shí)際操作中往往遇到試驗(yàn)材料數(shù)量有限、樣品量不足的問題?？焖贉y定方法僅需0.2 g樣品,三個(gè)重復(fù)可在24 h內(nèi)同時(shí)測定出SOD、POD、MDA、SP等多個(gè)生理生化指標(biāo)的數(shù)值,測定時(shí)吸取的酶液僅為傳統(tǒng)測定方法的1/10左右,反應(yīng)液用量也按比例減少,降低了樣品和反應(yīng)液的使用量;相比傳統(tǒng)方法在節(jié)約樣品的同時(shí)也節(jié)省了試驗(yàn)費(fèi)用(圖3)。由于取樣量較常規(guī)方法減少一半,相對(duì)增加了組織特異性誤差,可在實(shí)際操作中增加樣品取樣分布點(diǎn),增加生物學(xué)重復(fù)及技術(shù)性重復(fù),平衡樣品取樣量較少的問題。

②節(jié)省研磨樣品時(shí)間。傳統(tǒng)測定方法試驗(yàn)過程操作繁瑣,耗時(shí)長,僅研磨組織樣品這一環(huán)節(jié)就需花費(fèi)大量時(shí)間,平均手工研磨一個(gè)樣品需要2 min。雖全程在冰盤上操作,但周圍環(huán)境溫度不穩(wěn)定,且研磨過程中產(chǎn)生的熱量可使樣品中酶的活性發(fā)生改變進(jìn)而影響最終測定結(jié)果,因此傳統(tǒng)方法測定結(jié)果受外界因素影響較大。而快速方法取樣前已在離心管中加入鋼珠,采集的花生組織也在極短時(shí)間內(nèi)裝入離心管并凍存于超低溫冰箱中;研磨時(shí)將離心管直接放進(jìn)預(yù)冷的適配器中,5 min即能夠完成70個(gè)樣品的研磨工作,操作簡單快捷,節(jié)省人工 (圖1,圖2,表3)。

③研磨更加徹底。傳統(tǒng)測定方法操作中采用人工研磨樣品,導(dǎo)致樣品間存在較大差異,且有些樣品如生育后期的根系、莖稈具有一定的韌性,不易磨碎,增加了試驗(yàn)人員的操作難度,對(duì)測定結(jié)果造成很大影響;而快速檢測方法利用液氮及預(yù)冷的組織研磨儀對(duì)樣品進(jìn)行冷凍研磨,每個(gè)離心管中放入相同數(shù)量及大小(0.2 mm)的鋼珠,研磨環(huán)境相同,研磨時(shí)間相同,減少了樣品間在磨樣過程中產(chǎn)生的操作誤差,且與人工研磨相比,更加均勻徹底(圖3)。通常在樣品數(shù)量大的情況下,試驗(yàn)人員使用傳統(tǒng)方法檢測時(shí)需要提前一天將所有樣品研磨完畢,然后放入4℃冰箱進(jìn)行保存。由于抗氧化酶系統(tǒng)的酶類物質(zhì)從細(xì)胞釋放出來后對(duì)溫度比較敏感,傳統(tǒng)方法的操作流程會(huì)因?yàn)槊傅幕钚韵陆刀绊懺囼?yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。而快速檢測方法能在短時(shí)間內(nèi)解決大量樣品的研磨問題,可在當(dāng)天檢測研磨出的樣品,減少試驗(yàn)誤差。此外,通過對(duì)測定結(jié)果的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,證明了兩種方法獲得的數(shù)據(jù)差異不顯著 (表1,表2)。

手工研磨樣品,利用分光光度計(jì)測定樣品吸光度是當(dāng)前植物組織生理試驗(yàn)中普遍使用的方法,但該方法操作復(fù)雜,效率較低。本文對(duì)傳統(tǒng)測定方法進(jìn)行了改進(jìn),在保證測定結(jié)果合理、準(zhǔn)確的同時(shí),優(yōu)化了樣品用量和試劑使用量,降低了科研工作者的工作強(qiáng)度,契合降本控費(fèi)、提質(zhì)增效的理念。此外,數(shù)據(jù)經(jīng)過t檢驗(yàn)證明兩種方法測得的數(shù)據(jù)差異不顯著。同時(shí)該快速測定方法也可用于單雙子葉作物等微量組織的生理生化指標(biāo)測定。因此,快速測定方法可代替?zhèn)鹘y(tǒng)測定方法廣泛應(yīng)用于植物組織生理生化指標(biāo)的測定。

致謝:感謝沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)大豆研究所姚興東老師在快速測定方法建立過程中提供的幫助,感謝杜琪(現(xiàn)任職河北省農(nóng)林科學(xué)院,濱海農(nóng)業(yè)研究所)博士期間對(duì)傳統(tǒng)測定方法的驗(yàn)證。