氣相色譜法測定豬肉餡中鴨肉摻雜比例

費英敏 潘 雷 倪 雪 張根生,

(1. 黑龍江民族職業(yè)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150066；2. 哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150028)

有關(guān)肉糜的摻雜鑒定，方法已有許多，其中基于不同肉樣中所含的蛋白質(zhì)、揮發(fā)性物質(zhì)、DNA組成不同進行鑒定的方法較為普遍，通常借助光譜、色譜等化學(xué)儀器進行分析鑒定[1-3]。Vasso等[4]研究發(fā)現(xiàn)基于雙鏈聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)—酶聯(lián)寡核苷酸測定法，在豬肉與牛肉或雞肉混合時，可以輕易地檢測到0.5%～1.5%的豬肉。Zheng等[5]通過近紅外光譜儀分析肉制品中摻雜鴨肉的情況，研究建立的最優(yōu)模型在一定的樣本范圍內(nèi)具有一定的適用性。Bilge等[6]通過激光誘導(dǎo)擊穿光譜法對摻雜肉樣進行鑒定，依據(jù)不同肉種之間的特異性組成元素進行分析，通過主成分分析法對豬肉中摻雜的牛肉進行定性分析。Juan等[7]研究的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)結(jié)合毛細管凝膠電泳(PCR-CGE-LIF)方法對于檢測熱處理肉混合物中的雞肉、火雞肉和豬肉具有可重復(fù)性和靈敏性。Wang等[8]通過電子鼻與氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對羊肉中摻雜鴨肉進行定性和定量分析，該分析方法操作時間短、準(zhǔn)確度高。Pavlidis等[9]運用液相微萃取與氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，對摻入牛肉中的豬肉進行摻雜鑒定。PCR技術(shù)由于在肉類產(chǎn)品中的高靈敏度[10]、特異性和特殊用途而被廣泛用于肉類樣品的判別[11]，而且檢測成本較低，對加工肉制品中的物種識別更準(zhǔn)確[12-15]。但是PCR技術(shù)在實際應(yīng)用中也存在PCR條件優(yōu)化困難、效率低等缺點。光譜學(xué)是一種快速、無損的肉樣鑒定技術(shù)[16-17]，其鑒定過程需要消耗大量時間且特異性低[18-19]。激光誘導(dǎo)擊穿光譜(LIBS)是一種能夠?qū)κ称窐悠愤M行快速多元分析的光學(xué)技術(shù)，但其在樣品制備、矩陣效應(yīng)、光譜預(yù)處理、模型校準(zhǔn)和儀器開發(fā)等方面仍存在挑戰(zhàn)[20-22]。肉類分析常用的色譜分析有氣相色譜(GC)[23]和高效液相色譜(HPLC)，色譜法能夠識別幾乎任何類型的分子，適合混合樣品的分析，對于氣相色譜來說，樣品需要高度揮發(fā)性[24-25]。

有研究者[26-29]根據(jù)不同植物油脂含有的脂肪酸種類不同建立了不同植物油脂摻雜鑒定以及品質(zhì)分析的方法，但目前根據(jù)脂肪酸的組成成分及含量來鑒定肉類摻雜還未見報道。豬前腿肉的肉質(zhì)緊實且含有豐富的筋膜，常被用來制作肉餡，為達到利益最大化，一些價格相對低廉的鴨肉常被摻入到豬肉制品中[2]。研究擬以豬前腿肉為研究對象，參考植物油脂摻雜的鑒定方法，根據(jù)不同肉類所含脂肪酸種類以及含量不同，建立一種方便準(zhǔn)確、高效快速的基于氣相色譜法分析豬肉餡中摻雜鴨肉的定性、定量鑒定方法，為肉類摻雜鑒定提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料與試劑

豬肉、鴨肉：豬前腿肉和鴨胸肉分5批次購買，市售；

氯化鈉、氫氧化鉀：分析純，天津大陸化學(xué)試劑廠；

甲醇、正己烷、無水乙醇、無水硫酸鈉：分析純，天津富宇精細化工有限公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：RE-52型，廣州天河儀器設(shè)備廠；

海爾冰柜：TG350-BQ-1型，青島海爾電器廠；

中藥粉碎機：500A型，泰斯特儀器有限公司；

恒溫水浴鍋：HH511型，上海躍進醫(yī)療機械廠；

電熱干燥箱：202型，余姚市東方電工儀器廠；

氣相色譜儀：GC7900型，上海天美儀器有限公司；

數(shù)控超聲波清洗器：KQ-500DE型，昆山市超聲儀器有限公司；

電子分析天平：ALC-2100.2型，塞多利斯貿(mào)易有限公司；

臺式高速離心機：TG16-WS型，上海盧湘儀儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品制備 將5個批次豬前腿肉和鴨胸肉于-20 ℃ 凍藏。取不同批次豬前腿肉和鴨胸肉各100 g，分別切成薄片于60 ℃烘至恒重，粉碎，裝入自封袋，冷藏備用。并取粉碎后的豬肉與鴨肉進行混合，制成摻雜肉樣。

1.2.2 甲酯化處理 向經(jīng)前處理后的豬肉樣品中加入6.8 mL 濃度為0.4 mol/L的KOH-CH3OH作為酯化劑，69.5 ℃甲酯化處理19.6 min。

1.2.3 氣相色譜條件 選用DB-FastFAM色譜柱(固定相為氰丙基)，進樣量1 μL，初始溫度140 ℃，持續(xù)5 min，以5 ℃/min升至220 ℃，保持15 min。

1.2.4 精密性、穩(wěn)定性試驗 在1.2.2色譜條件下連續(xù)進樣5次獲得脂肪酸圖譜，記錄豬肉中棕櫚酸(C16:0)、硬脂酸(C18:0)、油酸(C18:1)的保留時間以及峰面積。

1.2.5 重復(fù)性試驗 按前處理條件在相同氣相色譜條件下對5組樣品進行氣相色譜分析，計算油酸的保留時間以及峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差值(RSD)。

1.2.6 指紋圖譜的建立 依據(jù)氣相色譜圖的保留時間定性，對照37種脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)圖譜確定脂肪酸的種類，以面積歸一化法定量每種肉樣的脂肪酸含量。鑒于肉類脂肪酸指紋圖譜匹配和共有峰確定的手動操作，采用手動建立標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜時，直接采用峰面積和保留時間作為指標(biāo)[30]。以每種樣品中比較穩(wěn)定且峰面積比較大的峰進行定位、匹配和確定共有峰，共有峰的選擇依據(jù)各肉樣的共有峰率來進行選擇，以共有峰率≥70%為參考指標(biāo)。

向1 g豬肉樣品粉末中加入6.8 mL NaOH-CH3OH溶液(0.4 mol/L)和10 mL正己烷，69.5 ℃水浴回流19.6 min。冷卻后加入15 mL蒸餾水進行超聲波處理(250 W，5 min)，3 000 r/min離心10 min。再通過人工匹配以及所有峰共有率的考察，確定豬肉脂肪酸組成以及各脂肪酸的含量，建立豬肉標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。并采取同樣方法建立鴨肉脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。

1.2.7 豬肉、鴨肉脂肪酸組成顯著性差異分析及特征脂肪酸的確定 應(yīng)用SPSS 17.0軟件分析兩種肉樣的脂肪酸含量。

1.2.8 豬肉樣品摻雜后氣相色譜圖的變化及特征脂肪酸的選定 分別檢測豬肉中各摻雜10%，30%，50%，70%的鴨肉，觀察摻雜后的氣相色譜圖，分析摻雜樣品的脂肪酸的含量變化及兩種肉樣的脂肪酸組成，結(jié)合SPSS 17.0軟件分析豬肉區(qū)別于鴨肉的特征脂肪酸，根據(jù)得到的脂肪酸含量變化趨勢，選定豬肉—鴨肉的特征脂肪酸。

1.2.9 摻雜模型的建立及驗證 分別向豬肉中摻入0%，10%，30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%，100%的鴨肉，建立摻雜試驗?zāi)Ｐ停^察脂肪酸含量變化，繪制特征脂肪酸含量的變化趨勢圖，根據(jù)摻雜量與特征脂肪酸含量的變化建立回歸預(yù)測模型，根據(jù)氣相色譜儀的響應(yīng)值及信噪比計算檢測限。

制備豬肉—鴨肉摻雜肉樣驗證組，摻雜肉樣比例分別為4%，8%，16%，32%，64%，按照超聲波輔助提取結(jié)合優(yōu)化的堿法甲酯化方法，在同一氣相色譜條件下分別測定不同比例的摻雜肉樣，根據(jù)氣相色譜圖得到特征脂肪酸的含量，并與回歸方程中的結(jié)果進行比較，計算RSD值以及回收率，驗證預(yù)測模型的準(zhǔn)確度以及精密度。

2 結(jié)果與分析

2.1 精密性及穩(wěn)定性試驗結(jié)果

由表1和表2可知，豬肉樣品中棕櫚酸(C16:0)、硬脂酸(C18:0)及油酸(C18:1)保留時間的RSD分別為0.158%，0.124%，0.119%，符合指紋圖譜保留時間的要求(RSD<1%)；其峰面積的RSD分別為1.446%，1.944%，3.021%，符合指紋圖譜峰面積的要求(RSD<5%)，表明氣相色譜儀的精密性及穩(wěn)定性均符合試驗要求。

表1 精密性及穩(wěn)定性試驗結(jié)果(脂肪酸的保留時間)

表2 精密性及穩(wěn)定性試驗結(jié)果(脂肪酸的峰面積)

2.2 重復(fù)性試驗結(jié)果

由表3、表4可知，豬肉樣品中棕櫚酸(C16:0)、硬脂酸(C18:0)及油酸(C18:1)保留時間的RSD分別為0.062%，0.090%，0.079%，符合指紋圖譜保留時間的要求(RSD<1%)；其峰面積的RSD分別為2.983%，2.670%，1.522%，符合指紋圖譜峰面積的要求(RSD<5%)，表明試驗重復(fù)性符合要求。

表3 重復(fù)性試驗結(jié)果(脂肪酸的保留時間)

表4 重復(fù)性試驗結(jié)果(峰面積)

2.3 豬肉脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的建立

豬肉氣相色譜標(biāo)準(zhǔn)指紋圖見圖1，脂肪酸種類及相對含量見表5。

圖1 豬肉脂肪酸氣相色譜圖Figure 1 GC chromatograms of pork fatty acid

表5 豬肉脂肪酸種類及相對含量

2.4 鴨肉脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的建立

鴨肉氣相色譜標(biāo)準(zhǔn)指紋圖見圖2，脂肪酸種類及相對含量見表6。

圖2 鴨肉脂肪酸GC色譜圖Figure 2 GC chromatograms of fatty acids in duck meat

表6 鴨肉脂肪酸種類以及相對含量

2.5 豬肉、鴨肉脂肪酸組成的顯著性差異分析

豬肉、鴨肉脂肪酸組成顯著性差異分析見表7。

表7 豬肉、鴨肉脂肪酸組成顯著性差異分析?

2.6 豬肉摻雜后各脂肪酸的變化及特征脂肪酸的確定

由圖1、圖2及表8可知，豬肉中摻入鴨肉后，脂肪酸的種類及含量均發(fā)生了很大變化。豬肉樣品中的主要脂肪酸為C18:1、C18:0、C16:0、C16:1、C18:2TT和C12:0，其中油酸含量最高。鴨肉中的主要脂肪酸為C18:1、C16:0、C18:0、C18:2TT，與任志偉[31]的研究結(jié)果相似。豬肉中的多數(shù)脂肪酸含量均高于鴨肉，而鴨肉中的C18:2TT含量明顯高于豬肉，C16:0含量略高于豬肉。當(dāng)豬肉中摻入鴨肉時，C12:0和C18:0含量隨摻雜量的增加逐漸減少，C18:2TT含量隨摻雜量的增加而增加，C22:0為鴨肉中特有的脂肪酸，而豬肉中不含有。為確保試驗結(jié)論的可靠性，在豬肉中摻雜雞肉后發(fā)現(xiàn)， C22:1為雞肉中特有的脂肪酸，且雞肉特征脂肪酸中不含有C22:0。此外，牛肉[32]和羊肉[33]的特征脂肪酸中也不含有C22:0，因此可以根據(jù)豬肉餡摻雜樣品中是否含有C22:0來判定是否摻雜了鴨肉。綜上，選定C12:0、C18:0、C18:2TT和C22:0作為豬肉—鴨肉的特征脂肪酸進行后續(xù)研究。

表8 摻入不同比例鴨肉后豬肉脂肪酸種類及其相對含量

2.7 摻雜豬肉餡脂肪酸組成的變化趨勢及回歸預(yù)測模型建立

由圖3可知，隨著鴨肉摻入量的增加，摻雜肉樣中月桂酸、硬脂酸含量逐漸下降，反亞油酸、山崳酸酸含量逐漸上升。由表7可知，豬肉中月桂酸、硬脂酸含量分別為1.648%，15.13%，鴨肉中月桂酸、硬脂酸含量分別為0.841%，12.959%，豬肉中兩種脂肪酸含量均高于鴨肉中的，隨著鴨肉摻入量的增加，豬肉在摻雜肉樣中的比例逐漸減少，月桂酸、硬脂酸含量逐漸下降，豬肉中反亞油酸含量為4.041%，鴨肉中反亞油酸含量為12.525%，鴨肉中的反亞油酸含量明顯高于豬肉中的。隨著鴨肉摻入量的增加，樣品中反亞油酸含量逐漸升高，山崳酸作為鴨肉中特有的脂肪酸，未在豬肉中檢測到，因此可以根據(jù)摻雜肉樣中是否含有山崳酸來判斷豬肉中是否摻入了鴨肉，且隨著鴨肉摻入量的增加，山崳酸含量逐漸增加。

圖3 摻雜肉樣中脂肪酸組成隨鴨肉摻入量的變化

根據(jù)鴨肉摻入量對豬肉脂肪酸組成影響趨勢不同，以及是否可以檢測出山崳酸，選定月桂酸、硬脂酸、反亞油酸、山崳酸作為特征脂肪酸用于鑒定豬肉中摻雜鴨肉。經(jīng)回歸分析，建立如表9所示的回歸預(yù)測模型，定量分析豬肉中鴨肉的摻入量。

由表9可知，4個回歸方程的R2值均>0.99，表明摻雜肉樣中所選定的4種特征脂肪酸含量與鴨肉摻入量具有良好的線性關(guān)系，與應(yīng)美蓉等[34]的研究結(jié)果類似。根據(jù)氣相色譜儀的響應(yīng)值及信噪比，豬肉中摻雜鴨肉檢出限為0.5%，具有較高的靈敏度。

表9 鴨肉摻入量與摻雜肉樣脂肪酸含量的回歸預(yù)測模型

2.8 模擬摻雜肉樣的結(jié)果驗證

豬肉中摻雜鴨肉的預(yù)測值以及回收率見表10。

表10 鴨肉摻入量預(yù)測值以及回收率

由表10可知，當(dāng)鴨肉摻入量為4%，8%，16%，32%，64%時，鴨肉摻入量預(yù)測值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.31%～9.52%，RSD值均<10%，回收率為101.00%～104.25%，表明鴨肉摻入量≥4%時，根據(jù)選定的月桂酸、硬脂酸、反亞油酸、山崳酸4種特征脂肪酸所建立的回歸預(yù)測模型有很好的準(zhǔn)確度和精密度。

3 結(jié)論

對基于氣相色譜法檢測在豬肉餡中摻雜鴨肉的鑒定方法進行了研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)月桂酸、硬脂酸、反亞油酸和山崳酸可作為豬肉—鴨肉混合摻雜肉餡的特征脂肪酸，不同摻入量的摻雜肉餡的特征脂肪酸的預(yù)測回歸模型的R2值均>0.99，摻雜肉樣的最低檢出限為0.5%，說明通過此方法建立的摻雜預(yù)測模型有很好的準(zhǔn)確度和精密度。后續(xù)可對其他種類的摻雜肉樣進行研究，并對試驗方法進一步優(yōu)化，以期降低摻雜肉樣的最低檢出限。