水稻組織中可培養(yǎng)內(nèi)生細菌的分離鑒定及功能分析

黃博聞， 王 亞， 葛 靜， 孫 星， 王冬蘭， 余向陽

(1.江蘇大學環(huán)境與安全工程學院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013； 2.省部共建國家重點實驗室培育基地——江蘇省食品質(zhì)量安全重點實驗室/江蘇省農(nóng)業(yè)科學院，江蘇 南京 210014)

內(nèi)生細菌是指可以在植物內(nèi)部組織中定殖的，不會造成任何直接的、明顯的負面影響的細菌[1-2]。內(nèi)生細菌廣泛分布于植物的各個組織中，如根、莖、葉、種子等的細胞或細胞間隙[3]，甚至在植物的根瘤中也存在[4]。

內(nèi)生菌參與調(diào)控水稻眾多生理活動[5]。利用內(nèi)生菌促進植物生長、增強作物抗病能力、減輕污染脅迫是實現(xiàn)水稻優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的有效方法[6]。Feng等[7]發(fā)現(xiàn)施用含促生與有機污染物降解功能的內(nèi)生菌可顯著提高水稻生物量，同時減少水稻對有機污染物的富集。研究結果表明，植物內(nèi)生菌可通過分泌次生代謝物誘導水稻自身抗性的形成[8]或直接應對病原體[9]。Haruna等[10]發(fā)現(xiàn)Sphingomonasmelonis通過產(chǎn)生鄰氨基苯甲酸干擾水稻種子病原菌Burkholderiaplantarii的σ因子RpoS，從而抑制毒力因子合成。此外，一些有益內(nèi)生菌還可以通過水稻種子跨代傳播[11]，它們在促進植物種子萌發(fā)、根毛形成、誘導水稻幼苗抗病性等方面發(fā)揮重要作用[12]。

水稻內(nèi)生細菌群落分布與組成受環(huán)境因子[13]、水稻品種與生長期[14]等因素影響。研究結果表明，分蘗期的水稻內(nèi)生菌多樣性豐富，分布均勻[14]。因此，研究不同地區(qū)不同品種水稻分蘗期的內(nèi)生菌分布，有助于了解水稻與內(nèi)生菌互作關系，有利于更好地將內(nèi)生菌應用于農(nóng)業(yè)，實現(xiàn)減少化肥施用、減少農(nóng)藥施用、修復土壤環(huán)境等目標[15]，推動農(nóng)業(yè)的綠色可持續(xù)發(fā)展。目前，有關江蘇省主要水稻品種中內(nèi)生菌群落分布的研究尚無報道，對不同品種水稻內(nèi)生菌菌種庫的構建也鮮有報道。本研究對江蘇33個水稻品種分蘗期的根和莖葉中的內(nèi)生菌進行分離、鑒定和分析，初步構建了不同品種水稻內(nèi)生菌菌種資源庫，為挖掘水稻微生物資源，促進水稻育種發(fā)展提供了資源和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

試驗藥品：胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB)與瓊脂(青島海博生物技術有限公司產(chǎn)品)，次氯酸鈉(AR，天茂化工有限公司產(chǎn)品)；95%乙醇(南京壽德生物有限公司產(chǎn)品)。

儀器：上海知楚ZQZY-90F振蕩培養(yǎng)箱，Eppendorf Centrifuge 5804R高速離心機，蘇凈SW-CJ-1D超凈工作臺。

1.2 試驗材料

分蘗期水稻植株采自江蘇省農(nóng)業(yè)科學院糧食作物研究所試驗田，所采集樣品來自同一片區(qū)域，樣品取回后儲存于4 ℃冰箱中，于2 d內(nèi)完成樣品處理。

水稻品種：豐粳3227、滬軟1212、華粳5、華粳8號、淮粳5號、金粳818、金香玉2號、連粳11、連粳15、南粳45、南粳46、南粳47、南粳49、南粳5055、南粳9108、寧粳8號、日本晴、蘇滬香粳、蘇香粳100、蘇香粳2號、蘇秀867、皖墾粳11036、武育粳3號、武育粳80號、武運粳27號、武運粳29號、徐稻3、鹽粳16、揚粳3012、揚粳3491、揚粳4227、揚育粳2號、鎮(zhèn)稻18號、鎮(zhèn)稻99。

1.3 樣品收集與表面消毒

將采集的水稻植株用蒸餾水洗凈，每個品種隨機取3～5株。用剪刀將水稻分為根與莖葉兩部分并立即進行表面消毒，方法參照文獻[5]：采用75%酒精浸沒樣品2 min，采用3%次氯酸鈉浸沒2 min，每次棄去溶液后用無菌水潤洗3次。最后1次滅菌水涂布于LB固體平板，驗證滅菌效果。向裝有經(jīng)過消毒的水稻組織樣品的離心管中加入2顆滅菌磁珠，然后使用往復式震蕩機在750 r/min頻率下研磨20 min獲得組織勻漿液。

1.4 菌種分離純化與保存

取0.5 ml勻漿液用無菌水進行4倍稀釋，并移取100 μl 稀釋液涂布于TSB固體平板，每個品種3次重復，并置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱。挑選平板中的單菌落進行平板劃線直至獲得純化菌種。

20%甘油菌液制備：吸取0.5 ml 純化菌種菌液與40%甘油凍存于-80 ℃冰箱。

1.5 菌種鑒定與數(shù)據(jù)處理

正向引物25F:5′-AACTGAAGAGTTTGATCCTGGCTC-3′；反向引物1492R:5′-TACGGCTACCTTGTTACGACT-3′。PCR反應條件參照文獻[16]。擴增產(chǎn)物送南京通用生物公司測序，所得序列拼接后在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行比對，將菌株序列相似度>98%的歸為同一種。

采用Origin pro繪圖，采用Excel統(tǒng)計數(shù)據(jù)；不同品種水稻的抗病能力及親本信息參考https://www.ricedata.cn/。

2 結果與分析

2.1 可培養(yǎng)內(nèi)生細菌

經(jīng)測序鑒定后，從33個水稻品種中共獲得119株可培養(yǎng)內(nèi)生細菌，其中根中分離出的內(nèi)生細菌77株，莖葉中分離出的內(nèi)生細菌39株，3株未定義，共涉及19個屬，從分類水平看，根部分離出的內(nèi)生菌數(shù)量明顯高于莖葉部(P<0.05)。

2.2 不同品種水稻優(yōu)勢內(nèi)生菌

為探究不同品種中優(yōu)勢內(nèi)生菌，對分離出的119株內(nèi)生菌進行屬水平分類，共可分為18個菌屬：不動桿菌屬(Acinetobacter)、氣單胞菌屬(Aeromonas)、農(nóng)桿菌屬(Agrobacterium)、 節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、貪銅菌屬(Cupriavidus)、纖維菌屬(Cellulosimicrobium)、腸桿菌屬(Enterobacter)、微小桿菌屬(Exiguobacterium)、假芽孢桿菌屬(Fictibacillus)、沙雷氏菌屬(Serratia)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、乳球菌屬(Lactococcus)、賴氨酸芽孢桿菌屬(Lysinibacillus)、微桿菌屬(Microbacterium)、類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)、根瘤菌屬(Rhizobium)、地桿菌屬(Terrabacter)。其中，Bacillus、Aeromonas和Exiguobacterium在水稻組織中出現(xiàn)頻次最高，分別占26%、19%和16%。屬水平統(tǒng)計結果顯示，芽孢桿菌屬在水稻內(nèi)生菌屬中占比最高。對該屬中32株細菌進行菌種分析發(fā)現(xiàn)，巨大芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌是主要菌種，分別占總芽孢桿菌菌群的19%、13%和6%。

2.3 水稻不同器官優(yōu)勢內(nèi)生菌屬

對各品種水稻組織中分離出的菌屬進行統(tǒng)計，從水稻根部分離得到16種菌屬，其中優(yōu)勢菌屬(占比>10%)依次為Bacillus(31%)、Aeromonas(17%)和Exiguobacterium(15%)；從水稻莖葉部分離得到10種菌屬，優(yōu)勢菌屬依次為Aeromonas(28%)、Bacillus(20%)、Exiguobacterium(18%)和Microbacterium(13%)。其中，根與莖葉中共有菌屬6種，分別為Bacillus、Aeromonas、Exiguobacterium、Microbacterium、Arthrobacter和Enterobacter。

2.4 親本水稻品種內(nèi)生菌與后代水稻品種內(nèi)生菌的關系

33個品種中有8個品種存在親緣關系，分析發(fā)現(xiàn)，親本水稻品種(鎮(zhèn)稻99、徐稻3號、南粳46、武育粳3號)與各自的雜交后代水稻品種(揚粳3491、揚育粳2號、滬軟1212、淮粳5號)至少存在1種或2種共有內(nèi)生菌。其中，在母本鎮(zhèn)稻99與后代品種揚粳3491之間發(fā)現(xiàn)共有內(nèi)生菌Microbacteriumlaevaniformansstrain；在父本徐稻3號與后代品種揚育粳2號間發(fā)現(xiàn)共有內(nèi)生菌Microbacteriumlaevaniformansstrain，在父本南粳46與后代品種滬軟1212間發(fā)現(xiàn)共有內(nèi)生菌Bacilluscereusstrain，在母本武育粳3號與后代品種淮粳5號間發(fā)現(xiàn)共有內(nèi)生菌Exiguobacteriumsp.和Bacillussp.。

2.5 不同品種水稻中抗病菌屬分布

水稻中已被廣泛報道的具有抗病能力的內(nèi)生細菌屬主要為Bacillus、Lysinibacillus和Pseudomonas。蘇滬香粳中分離出了最多數(shù)量的Bacillus內(nèi)生菌，這可能在一定程度上與其優(yōu)良的抗葉枯病和抗稻瘟病的特性相關。其他17個品種中都分離出1～2種可能與抗病相關的菌屬，Bacillus在18個品種中分布相比其他抗病菌屬更廣。

3 討 論

3.1 33個水稻品種中內(nèi)生菌組成的多樣性

研究結果顯示，33個水稻品種中的內(nèi)生菌共涉及4個菌門：變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、放線菌門(Actinobacteria)和擬桿菌門(Bacteroidetes)。其中，2種核心菌門(厚壁菌門與變形菌門)在各品種中共存。這與相關研究結果[17-18]一致，符合水稻組織中常見菌群組成規(guī)律。本研究中，多個品種中厚壁菌門占比高于變形菌門。厚壁菌門被認為具有降解大分子有機物(如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、纖維素等)的功能[19]，這與水稻樣品收集區(qū)域大規(guī)模施用有機肥有密切關系，厚壁菌門的升高有助于土壤中有機質(zhì)的分解利用[20]。變形菌門主要參與固氮，較高的豐度有助于水稻土壤肥力的保持[21]。

從屬水平看，本研究發(fā)現(xiàn)同一區(qū)域內(nèi)不同品種中優(yōu)勢內(nèi)生細菌具有相似性。在長期的自然選擇中，具有優(yōu)異功能的內(nèi)生菌更容易被不同品種選擇[22]，這些內(nèi)生菌通過增加植物的養(yǎng)分攝入量及影響植物激素的釋放[23]，在與植物的互作中占據(jù)有利生態(tài)位，從而避免在根際土與葉際等外部環(huán)境與其他微生物競爭[24]。其中，Bacillus、Aeromonas和Exiguobacterium作為常見優(yōu)勢菌群在南京33個水稻品種中廣泛分布，這與菌屬自身具有的有益功能密不可分。Bacillus被廣泛報導具有抗逆、促生以及良好的生防功能[25-26]。從分布看，芽孢桿菌在水稻根內(nèi)分布更廣，這與相關報導[27]一致。本研究結果表明，分離出的芽孢桿菌菌種主要包括枯草芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌和巨大芽孢桿菌?？莶菅挎邨U菌具有生防特性[26]，能夠降解塑化劑等有機污染物[28]；蠟狀芽孢桿菌兼具解鉀促生功能[29]，可促進水稻營養(yǎng)代謝；巨大芽孢桿同時具備溶磷功能[30]，后兩者可能是水稻根部營養(yǎng)吸收的重要菌群，而前者為水稻抗病提供了保障。Exiguobacterium被認為具有耐受寒冷與鹽堿[31]等極端環(huán)境的特性，擁有還原鉻、砷等具有毒性的重金屬離子的能力[32]，具有降解農(nóng)藥、苯及其同系物等有機化合物的活性。Exiguobacterium的協(xié)同作用會使Bacillus反硝化能力顯著提高。Aeromonas是常見的耐鹽菌屬[33]，具有反硝化和除磷功能[34]，從分布看，Aeromonas傾向于定殖于水稻葉內(nèi)，在多種水稻品種中占比達28%?？傊?種菌屬對水稻生長發(fā)揮了巨大作用，且菌屬之間存在協(xié)同效應，是水稻生產(chǎn)中最有應用潛力的菌屬。

3.2 親本水稻品種內(nèi)生菌與雜交后代水稻品種內(nèi)生菌的關聯(lián)

植物利用種子作為載體，通過垂直傳播保留部分具有重要生態(tài)學功能的內(nèi)生菌，使后代繼承由內(nèi)生菌賦予的優(yōu)勢[35]。本研究發(fā)現(xiàn)，后代水稻品種中分離出的內(nèi)生菌可以追溯到1個親本中的1種或2種，這與相關研究結果[36]一致。Liu等[37]研究了分蘗期超級雜交稻與其親本間內(nèi)生菌群落組成發(fā)現(xiàn)，3種水稻內(nèi)生菌群落組成與結構雖然存在差異，但后代水稻品種中優(yōu)勢菌屬與親本保持一致。Hardoim等[38]研究發(fā)現(xiàn)，在第二代種子中發(fā)現(xiàn)了來自第一代水稻種子中45%的細菌群落。垂直傳播的種子內(nèi)生菌對作物抗性組成、環(huán)境適應性與生長具有重大影響[39]。本研究中Microbacteriumlaevaniformansstrain的垂直傳播在水稻品種中多次被發(fā)現(xiàn)，它具有耐金屬、耐硝酸鹽和適應低pH值的特性，有助于后代水稻品種更快地適應當?shù)丨h(huán)境。Liu等[40]發(fā)現(xiàn)，來自種子中的內(nèi)生菌可隨水稻生長定殖于植物根部并通過分泌次生代謝物提高水稻對鎘污染的抗性。禾本科的一些垂直傳播真菌內(nèi)生菌可以賦予宿主特殊生物堿阻止食草動物的采食或增加營養(yǎng)成分[41-42]。已有研究結果表明，內(nèi)生菌通過垂直傳播的方式從親本植物傳遞到后代會使后代具有比水平傳播模式更高的環(huán)境適應潛力，因為在水平傳播模式下，植物需要從環(huán)境中重新招募相關微生物[39]。后代水稻品種可從種子中獲得來自親本的優(yōu)勢菌屬，也可從土壤中再次選擇性招募相似菌屬[11]。相關研究結果表明，即使在不同地點重新培養(yǎng)后，許多相似的內(nèi)生菌群仍然存在于后代水稻品種中[36]。這表明，在長期的協(xié)同進化中，來自親本的生物信息或資源可能有助于內(nèi)生菌在其后代中的形成[39]，促使后代水稻品種從土壤中招募相似的有益內(nèi)生菌。

盡管水稻內(nèi)生細菌組成受到基因型、發(fā)育階段等諸多因素影響，但是同一區(qū)域內(nèi)不同品種水稻中仍然存在一些核心內(nèi)生菌， 本試驗33個水稻品種中常見核心內(nèi)生菌群為Aeromonas、Exiguobacterium、Bacillus和Microbacterium。至于這些內(nèi)生菌如何與水稻互作發(fā)揮功能仍有待進一步研究。本研究結果豐富了水稻內(nèi)生菌菌種庫。