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    山梨醇對黑曲霉源α-L-鼠李糖苷酶(r-Rha1)熱穩(wěn)定性的影響

    2022-11-30 08:33:22葉家影李文靜李利君李清彪
    關(guān)鍵詞:山梨醇失活熱穩(wěn)定性

    葉家影, 孫 江, 李文靜, 倪 輝*,2,3, 李利君,2,3, 李清彪,2,3

    (1.集美大學(xué) 海洋食品與生物工程學(xué)院,福建 廈門 361021;2.集美大學(xué) 福建省食品微生物與酶工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福建 廈門 361021;3.集美大學(xué) 廈門市食品生物工程技術(shù)研究中心,福建 廈門 361021)

    酶在提高生物催化效率的應(yīng)用中發(fā)揮著重要作用,天然酶通常只能根據(jù)自身的需要進(jìn)化相應(yīng)的催化性能[1]。在工業(yè)上使用酶時(shí),需要探索提高其對工業(yè)相關(guān)底物活性的方法,也應(yīng)針對這些酶進(jìn)行工業(yè)反應(yīng)條件的優(yōu)化。高熱穩(wěn)定性一直是生物催化劑在工業(yè)應(yīng)用中的重要性能,也是限制酶工業(yè)化應(yīng)用的重要因素[2]。酶熱穩(wěn)定性的強(qiáng)弱決定著酶的利用率、生產(chǎn)效率和生產(chǎn)成本[3]等。因此,提高熱穩(wěn)定性是改善工業(yè)用酶屬性的重要目標(biāo)。

    催化過程中的熱環(huán)境會(huì)加速酶蛋白的變性,為提高酶蛋白的熱穩(wěn)定性,可根據(jù)其序列、結(jié)構(gòu)、功能及催化機(jī)理進(jìn)行理性設(shè)計(jì),以獲得具有良好特性的突變體酶或重組酶[4-7]。在以往的研究中,作者所在團(tuán)隊(duì)通過PoPMuSiC算法和α-L-鼠李糖苷酶表面賴氨酸-精氨酸突變提高了α-L-鼠李糖苷酶熱穩(wěn)定性[8-9]。多羥基化合物山梨醇價(jià)格低廉、儲量豐富,是美國能源部提出的可持續(xù)平臺化學(xué)品之一[10],在食品、化妝品和醫(yī)藥工業(yè)中有廣泛用途[11]。隨著研究的深入,山梨醇也被廣泛用作酶穩(wěn)定劑[12]。山梨醇作為外源添加劑在提高酶的穩(wěn)定性方面具有操作簡單、成本低及生物降解性良好等優(yōu)勢[13],Narayanan等研究發(fā)現(xiàn)添加山梨醇可緩解釀酒酵母伴侶蛋白突變體的溫度敏感性[14],Mohammadi等發(fā)現(xiàn)添加山梨醇可提高羧肽酶A的轉(zhuǎn)變溫度(Tm)、活性和穩(wěn)定性[15]。但目前對山梨醇影響黑曲霉源α-L-鼠李糖苷酶熱穩(wěn)定性機(jī)制仍不明確。

    α-L-鼠李糖苷酶是一種糖苷水解酶,主要作用于α-1,2、α-1,4、α-1,6糖苷鍵,能有效水解大多數(shù)糖苷末端的帶有鼠李糖基團(tuán)的黃酮類化合物,如橙皮苷、斛皮苷、柚皮苷及人工底物對硝基苯基-α-L-鼠李糖苷(p-nitrophenyl-α-L-rhamnoside,pNPR)等。α-L-鼠李糖苷酶在食品行業(yè)有廣泛應(yīng)用,如柑橘果汁的脫苦與澄清[16-17]、飲料香氣成分的改善[18]、紅酒風(fēng)味的改善[19]等;此外,在醫(yī)藥行業(yè)和化合物的前體合成也有重要應(yīng)用[20]。但已報(bào)道的大多數(shù)α-L-鼠李糖苷酶在較高溫度下熱穩(wěn)定性差[21-23],因而限制了其工業(yè)應(yīng)用。已有研究表明,添加山梨醇可增強(qiáng)土曲霉源α-L-鼠李糖苷酶的熱穩(wěn)定性[24]。作者以黑曲霉源α-L-鼠李糖苷酶r-Rha1為對象,通過熱失活動(dòng)力學(xué)、圓二色譜和熒光光譜的譜學(xué)分析,探討山梨醇對α-L-鼠李糖苷酶熱穩(wěn)定性影響,并從分子構(gòu)象及二級結(jié)構(gòu)變化方面研究山梨醇對α-L-鼠李糖苷酶的保護(hù)機(jī)理,促進(jìn)人們對山梨醇與α-L-鼠李糖苷酶相互作用的理解,同時(shí)為提高其他酶制劑產(chǎn)品穩(wěn)定性提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    1.1.1 菌種含pPIC9K-rha重組質(zhì)粒的畢赤酵母SMD1168由集美大學(xué)海洋食品與生物工程學(xué)院酶工程實(shí)驗(yàn)室保藏[25]。

    1.1.2 試劑pNPR與甲醇(GR):Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品;山梨醇(AR):阿拉丁上海有限公司產(chǎn)品;甘油、葡萄糖、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉:國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品;胰蛋白胨、酵母粉:廣東環(huán)凱微生物科技有限公司產(chǎn)品;生物素、無氨基酸酵母氮源(yeast nitrogen base without amino acids,YNB):北京索萊寶生物公司產(chǎn)品。

    酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基 (yeast extract peptone dextrose medium,YPD):20 g胰蛋白胨、20 g葡萄糖、10 g酵母粉溶解于1 L去離子水中,調(diào)節(jié)pH至6.0,高壓滅菌。

    緩沖甘油-復(fù)合培養(yǎng)基 (buffered glycerolcomplex medium,BMGY):20 g胰蛋白胨、10 g酵母粉溶解于700 mL去離子水中,高壓滅菌,冷卻后加入100 mL磷酸鹽緩沖液(pH 6.0)、100 mL 10×YNB、100 mL甘油、2 mL 0.02 g/dL生物素B。

    緩沖甲醇-復(fù)合培養(yǎng)基 (buffered methanolcomplex medium,BMMY):20 g胰蛋白胨、10 g酵母粉溶解于700 mL去離子水中,高壓滅菌,冷卻后加入100 mL磷酸鹽緩沖液(pH 6.0)、100 mL 10×YNB、100 mL甲醇、2 mL 0.02 g/dL生物素B。

    1.2 儀器與設(shè)備

    DK-8D數(shù)顯恒溫水浴鍋:常州國華電器有限公司產(chǎn)品;FE20 pH計(jì):瑞士Mettler Toledo公司產(chǎn)品;Avanti J-26S XP立式高速冷凍離心機(jī):美國Beckman公司產(chǎn)品;Infiniti M200 PRO酶標(biāo)儀:奧地利Tecan公 司 產(chǎn) 品;Sephacryl S-200柱:美 國Amersham Bioscience公司產(chǎn)品;圓二色譜儀:英國Applied Photophsics公司產(chǎn)品;熒光分光光度計(jì):美國PerkinElmer公司產(chǎn)品。

    1.3 實(shí)驗(yàn)方法

    1.3.1 α-L-鼠李糖苷酶酶液的制備、分離和純化參照劉小琴等的實(shí)驗(yàn)方法[26],將含pPIC9K-rha重組質(zhì)粒的畢赤酵母SMD1168以1%(體積分?jǐn)?shù))接種量接入30 mL YPD培養(yǎng)基中。培養(yǎng)14~16 h后,以1%(體積分?jǐn)?shù))接種量接入100 mL BMGY培養(yǎng)基中,于30℃、180 r/min條件下培養(yǎng)。當(dāng)OD600為2~5時(shí),離心收集菌體,轉(zhuǎn)移至100 mL BMMY培養(yǎng)基中。培養(yǎng)期間每隔24 h添加體積分?jǐn)?shù)為0.5%的甲醇,作為碳源并誘導(dǎo)菌體表達(dá)。誘導(dǎo)表達(dá)7 d后,4℃、5 000 r/min離心15 min取上清液,即α-L-鼠李糖苷酶的粗酶液。將上清液進(jìn)行超濾濃縮(相對分子質(zhì)量50 000微孔濾膜)后,上樣至以20 mmol/L磷酸鈉緩沖液(pH 7.0)平衡的Sephacryl S-200柱中,收集α-L-鼠李糖苷酶組分,于4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.3.2 酶活力測定參照楊巖的實(shí)驗(yàn)方法[27],以20 mmol/L pNPR為底物測定α-L-鼠李糖苷酶酶活性。在20 mmol/L檸檬酸-磷酸鹽緩沖液(pH 4.0)中,60℃條件下,以每分鐘釋放1 μmol pNP所需的酶量為1個(gè)酶活力單位。60 μL pNPR與120 μL緩沖液在60℃孵育5 min后,加入20 μL酶液,繼續(xù)在60℃下反應(yīng)10 min,加入1 mol/L Na2CO3終止反應(yīng),于410 nm處測定釋放的pNP。

    實(shí)驗(yàn)組為酶液與等體積山梨醇混合,山梨醇終濃度分別為0.6 mol/L和1.2 mol/L;對照組為酶液與等體積去離子水混合。

    1.3.3 熱穩(wěn)定性與熱失活分析作者所在實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn),濃度為1.2 mol/L的山梨醇是α-L-鼠李糖苷酶酶活力增強(qiáng)的關(guān)鍵拐點(diǎn),也是其酶活力的最大峰值處[28]。為了研究山梨醇對α-L-鼠李糖苷酶熱穩(wěn)定性的具體影響,分別測定并繪制了添加1.2 mol/L山梨醇后α-L-鼠李糖苷酶的熱穩(wěn)定性曲線與熱失活曲線的一級動(dòng)力學(xué)模型。

    熱穩(wěn)定性曲線:以添加1.2 mol/L山梨醇的酶液為實(shí)驗(yàn)組,于60、65、70、75、80℃溫育10 min后,按照1.3.2方法測定殘余酶活力,以最高酶活力為100%,計(jì)算相對酶活力,并繪制熱穩(wěn)定性曲線。

    熱失活曲線的一級動(dòng)力學(xué)模型:根據(jù)熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選取合適溫度,按照1.3.2方法測定酶液在不同溫度下孵育不同時(shí)間的殘余酶活力,以ln(At/A0)作圖(At為殘余酶活力×100,A0為最高酶活力),并進(jìn)行線性擬合,繪制熱失活曲線的一級動(dòng)力學(xué)模型。得到的線性斜率即為該溫度下的熱失活常數(shù)(K),由熱失活常數(shù)可計(jì)算出該溫度下的半衰期(t1/2)。

    按照1.3.2方法測定殘余酶活力,以測得最高酶活力為100%,待殘余酶活力降至50%以下,停止測定。60℃下對照組每隔2 h取樣測定殘余酶活力,實(shí)驗(yàn)組每隔1 d取樣測定殘余酶活力;65℃下對照組每隔10 min取樣測定殘余酶活力,實(shí)驗(yàn)組隔1 h取樣測定殘余酶活力;70℃下對照組每隔2 min取樣測定殘余酶活力,實(shí)驗(yàn)組每隔10 min取樣測定殘余酶活力。

    1.3.4 圓二色譜分析將分別添加0.6、1.2 mol/L山梨醇的酶液在70℃下溫育20 min作為實(shí)驗(yàn)組1(0.6 mol/L)、實(shí)驗(yàn)組2(1.2 mol/L),未添加山梨醇未溫育為對照組,蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為0.13 mg/mL,掃描范圍為185~260 nm,掃描速率為1 nm/s,分辨率為1 nm。分別記錄山梨醇分別添加1.2、0.6 mol/L和未添加時(shí)的圓二色譜,最后用Dichrowed分析二級結(jié)構(gòu),并計(jì)算4個(gè)二級結(jié)構(gòu):α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲的相對含量。

    1.3.5 熒光光譜分析內(nèi)源熒光分析:蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為0.04 mg/mL,測量溫度為25℃,激發(fā)波長為295 nm,掃描速度為100 nm/min,激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為10 nm,波長掃描范圍為300~500 nm。分別記錄α-L-鼠李糖苷酶在不同溫育時(shí)間及不同山梨醇添加量的條件下的熒光光譜。

    表面疏水活性分析:8-苯胺-1-萘磺酸(8-aniline-1-naphthalenesulfonic acid,ANS)為熒光探針,蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL,測量溫度為25℃,激發(fā)波長為375 nm,掃描速度為100 nm/min,激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為10 nm,波長掃描范圍為400~700 nm。分別記錄α-L-鼠李糖苷酶在不同溫育時(shí)間及不同山梨醇添加量的條件下的表面疏水活性。

    樣品處理:將分別添加0.6、1.2 mol/L山梨醇的酶液在70℃下溫育20 min作為實(shí)驗(yàn)組1(0.6 mol/L)、實(shí)驗(yàn)組2(1.2 mol/L),未添加山梨醇未溫育為對照組,不添加山梨醇但溫育為未添加組,對α-L-鼠李糖苷酶進(jìn)行熒光掃描。

    1.3.6 數(shù)據(jù)處理每組實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)平行,取平均值,采用GraphPad Prism 8、Excel 2019、Dichrowed軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及相關(guān)圖表繪制。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 熱穩(wěn)定性曲線

    酶的熱穩(wěn)定性易受到反應(yīng)溫度、反應(yīng)體系及其他條件的影響。在作者所在團(tuán)隊(duì)前期的研究中發(fā)現(xiàn)黑曲霉源α-L-鼠李糖苷酶r-Rha1的最適溫度為60℃[25],分別在60、65、70、75、80℃下測定有無山梨醇條件下該酶的熱穩(wěn)定性曲線,結(jié)果如圖1所示。在60℃和65℃下,實(shí)驗(yàn)組與對照組的相對酶活力無明顯差別,在70℃下對照組的相對酶活力僅為13%,而實(shí)驗(yàn)組仍可保留98%的相對酶活力。由此可說明山梨醇可有效提高α-L-鼠李糖苷酶的熱穩(wěn)定性,這與Pazhang等發(fā)現(xiàn)添加山梨醇可提高胰蛋白酶穩(wěn)定性[12]的研究結(jié)果一致。

    圖1 熱穩(wěn)定性曲線Fig.1 Thermal stability curve

    2.2 熱失活曲線

    酶的熱失活是最重要的酶失活形式,熱失活曲線反應(yīng)的酶失活規(guī)律是控制與設(shè)計(jì)工業(yè)酶催化反應(yīng)的必要條件。圖2分別為60、65、70℃下的一級熱力學(xué)模型圖。根據(jù)圖2可計(jì)算出α-L-鼠李糖苷酶在不同條件下的熱失活常數(shù)K和半衰期t1/2,結(jié)果如表1所示。在60、65、70℃下未添加山梨醇的α-L-鼠李糖苷酶的半衰期分別為8.08 h、46.52 min、4.34 min,由此可說明α-L-鼠李糖苷酶對于溫度十分敏感。山梨醇通過維持蛋白質(zhì)構(gòu)象而提高酶的熱穩(wěn)定性,延長半衰期,在60、65、70℃下實(shí)驗(yàn)組的半衰期分別是對照組的29、25、10倍。60℃下α-L-鼠李糖苷酶本身已具有較好的熱穩(wěn)定性,65℃下對半衰期的提高效果不如60℃,這符合隨著溫度的升高酶蛋白半衰期逐步下降的基本規(guī)律,也表明山梨醇能有效提高α-L-鼠李糖苷酶的半衰期,這與Ge等發(fā)現(xiàn)添加山梨醇可延長曲霉源α-L-鼠李糖苷酶半衰期的結(jié)果一致[24]。

    表1 酶失活一級動(dòng)力學(xué)模型參數(shù)Table 1 Parameters of the first-level kinetic model for enzyme inactivation

    圖2 熱失活曲線的一級動(dòng)力學(xué)模型Fig.2 One-level kinetic model of thermal deactivation curve

    2.3 圓二色譜分析

    圓二色譜可反映蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)變化[29],結(jié)果如圖3、表2所示,實(shí)驗(yàn)組較對照組在192 nm處有較強(qiáng)的正吸收峰,α-螺旋相對含量增加,β-折疊相對含量則相應(yīng)降低,無規(guī)則卷曲相對含量變化小。α-螺旋靠氫鍵維持穩(wěn)定,具有一定的剛性,其比例的增加使α-L-鼠李糖苷酶的結(jié)構(gòu)更加剛性。加入山梨醇可保護(hù)酶蛋白在變性過程中α-螺旋不被破壞,使α-螺旋、β-折疊和β-轉(zhuǎn)角維持合適比例和穩(wěn)定的空間構(gòu)象,從而提高α-L-鼠李糖苷酶的熱穩(wěn)定性。

    圖3 圓二色譜圖Fig.3 Circular dichroism spectrum

    表2 二級結(jié)構(gòu)相對含量Table 2 Secondary structure content table %

    2.4 熒光光譜分析

    熒光光譜普遍用于蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)研究,因?yàn)槠鋬?nèi)部Trp和Tyr的熒光吸收對各類擾動(dòng)十分敏感,有研究者就采用熒光光譜法對外源物質(zhì)與蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)變化進(jìn)行分析研究[30-31]。當(dāng)Trp和Tyr所處的非極性環(huán)境轉(zhuǎn)向極性環(huán)境時(shí),多肽鏈和氨基酸發(fā)生去折疊而舒展,酶構(gòu)象發(fā)生改變,引起紅移與熒光強(qiáng)度降低。內(nèi)源熒光結(jié)果如圖4(a)所示,對照組最大吸收波長為342 nm,實(shí)驗(yàn)組中添加1.2 mol/L山梨醇最大吸收波長為344.5 nm,小于未添加及添加量為0.6 mol/L山梨醇的347 nm,紅移程度有所下降。表面疏水活性分析結(jié)果如圖4(b)所示,添加山梨醇的最大吸收波長從488 nm移至486 nm,發(fā)生輕微藍(lán)移,熒光強(qiáng)度高于對照組。根據(jù)前期實(shí)驗(yàn),α-L-鼠李糖苷酶中山梨醇的最佳用量為1.2 mol/L[28],但添加0.6 mol/L山梨醇的熒光強(qiáng)度卻高于添加1.2 mol/L山梨醇的熒光強(qiáng)度。

    圖4 熒光光譜Fig.4 Fluorescence chromatogram

    作者所在實(shí)驗(yàn)室前期對底物pNPR與α-L-鼠李糖苷酶進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬,發(fā)現(xiàn)pNPR結(jié)合環(huán)附近的Trp253和Trp640對于底物結(jié)合十分重要[32],在α-L-鼠李糖苷酶催化結(jié)構(gòu)域的(α/α)6桶狀結(jié)構(gòu)域內(nèi)部所含Trp和Tyr數(shù)量也較多。一般認(rèn)為,山梨醇可改善酶的熱穩(wěn)定性是由于增強(qiáng)了酶蛋白的疏水作用和氫鍵數(shù)量[33],且涉及催化結(jié)構(gòu)域周圍的氨基酸的氫鍵對酶和底物之間的接觸貢獻(xiàn)最大[34]。由內(nèi)源熒光光譜與表面疏水活性分析推斷,添加1.2 mol/L山梨醇的紅移程度小于添加量為0.6 mol/L山梨醇,是由于山梨醇的羥基可與水分子、Trp和Tyr側(cè)鏈形成大量氫鍵,使疏水氨基酸向內(nèi)卷曲,扭轉(zhuǎn)Trp和Tyr向更親水的環(huán)境轉(zhuǎn)移,穩(wěn)定蛋白質(zhì)構(gòu)象,進(jìn)而降低紅移程度。山梨醇可在α-L-鼠李糖苷酶分子周圍形成致密水化層,減小酶蛋白在熱變性過程中的構(gòu)象變化,維持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。而過量山梨醇會(huì)與α-L-鼠李糖苷酶活性中心相互作用,進(jìn)而阻礙酶與底物的結(jié)合,故添加0.6 mol/L山梨醇的熒光強(qiáng)度高于添加1.2 mol/L山梨醇的熒光強(qiáng)度。

    山梨醇的優(yōu)先水合作用降低了酶蛋白與水分子的直接相互作用,增強(qiáng)非極性基團(tuán)間的疏水作用,營造疏水環(huán)境[35],從而提高α-L-鼠李糖苷酶熱穩(wěn)定性[36-37],其機(jī)理圖如圖5所示。圓二色譜與熒光光譜結(jié)果顯示山梨醇對α-L-鼠李糖苷酶熱穩(wěn)定性產(chǎn)生了影響,與其他研究人員證實(shí)山梨醇可通過改變酶蛋白的微環(huán)境來提高纖維素酶[37]、β-甘露聚糖酶[38]、α-淀粉酶[39]和β-葡萄糖苷酶[40]等的穩(wěn)定性結(jié)果一致。

    圖5 山梨醇提高α-L-鼠李糖苷酶熱穩(wěn)定性機(jī)理圖Fig.5 Mechanism of sorbitol to improve the thermal stability of α-L-rhamnosidase

    3 結(jié)語

    通過分析經(jīng)山梨醇處理的α-L-鼠李糖苷酶殘余酶活力及結(jié)構(gòu)的變化,探究山梨醇對α-L-鼠李糖苷酶熱穩(wěn)定性的影響。熱穩(wěn)定性及熱失活動(dòng)力學(xué)分析表明,在60~70℃下,加入山梨醇提高了α-L-鼠李糖苷酶的熱穩(wěn)定性;在60、65、70℃下,加入1.2 mol/L山梨醇可分別將半衰期提高29、25、10倍。圓二色譜和熒光光譜分析表明,山梨醇可增強(qiáng)α-L-鼠李糖苷酶的表面疏水活性和結(jié)構(gòu)剛性,從而提高其熱穩(wěn)定性。作者解釋了山梨醇提高α-L-鼠李糖苷酶熱穩(wěn)定性的分子作用及結(jié)構(gòu)變化機(jī)制,為深入理解山梨醇提高酶蛋白穩(wěn)定性的機(jī)理提供了參考;同時(shí)進(jìn)一步驗(yàn)證了山梨醇對增強(qiáng)酶類熱穩(wěn)定性的普遍適用性,為提高酶熱穩(wěn)定性提供了參考方法。

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