電針心經(jīng)/心包經(jīng)穴對MCAO/R 大鼠MeCP2磷酸化影響的研究

潘 江，曹 洋，2，陳 成，李賽群，章 薇*

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208）

腦缺血損傷后神經(jīng)功能的重建與修復(fù)一直以來都是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[1]，其中突觸可塑性是腦缺血損傷后康復(fù)的主要機(jī)制之一[2]。 DNA 甲基化通過甲基化CpG 結(jié)合蛋白2（methyl CpG binding protein 2, MeCP2）磷酸化修飾途徑調(diào)控目標(biāo)基因的表達(dá)變化，在神經(jīng)干細(xì)胞的自我更新、分化、可塑性調(diào)節(jié)中發(fā)揮關(guān)鍵作用[3]。 相關(guān)研究證實(shí)，MeCP2 磷酸化修飾及其信號途徑參與了腦缺血損傷后神經(jīng)細(xì)胞的分化與調(diào)節(jié)[4]。 針刺作為腦缺血疾病的一種重要的防治手段，被廣泛應(yīng)用于腦缺血疾病的不同臨床時(shí)期，并取得了良好的療效[5-8]。 本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，電針心經(jīng)/心包經(jīng)穴可以誘導(dǎo)神經(jīng)營養(yǎng)因子（nerve growth factor, NGF）的釋放[9]，但其效應(yīng)過程尚不明確。根據(jù)MeCP2 磷酸化修飾途徑在誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞特異性基因表達(dá)，促進(jìn)NGF 釋放、樹突發(fā)生和棘突成熟等方面發(fā)揮的重要作用[10]。 本研究通過觀察電針心經(jīng)/心包經(jīng)穴對中動脈先閉塞再灌注（middle cerebral artery occlusion/reperfusion, MCAO/R）大鼠神經(jīng)功能缺損以及腦組織中MeCP2 磷酸化修飾變化的影響，驗(yàn)證電針心經(jīng)/心包經(jīng)穴改善腦缺血損傷的作用與MeCP2 磷酸化修飾途徑密切相關(guān)，為“從心治腦”以及經(jīng)穴特異性提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及分組

健康雄性SPF 級SD 大鼠200 只，體質(zhì)量250～350 g，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，合格證號為SCXK（湘）2016-0002。所有動物均在SPF 級動物房喂養(yǎng)，自由攝食與飲水，飼養(yǎng)溫度為20～25 ℃，濕度為40%～60%。 本實(shí)驗(yàn)所有操作都通過了湖南中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)倫理要求（倫理審批號：ZYFY20160513），并嚴(yán)格遵照中華人民共和國科技部2006 年頒布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動物的指導(dǎo)性意見》中有關(guān)動物的使用及倫理學(xué)規(guī)定。

運(yùn)用隨機(jī)數(shù)字表法將200 只大鼠分為正常組（40 只）、假手術(shù)組（40 只）、造模組（120 只）。 造模后隨機(jī)將120 只造模組大鼠分為模型組、心經(jīng)穴組、心包經(jīng)穴組，每組40 只；再隨機(jī)將各組分為1 d、7 d、14 d、21 d 亞組，每亞組10 只。

1.2 主要儀器和試劑

SDZ-Ⅱ華佗電針治療儀、華佗牌針灸針0.16 mm×13 mm（蘇州醫(yī)療用品廠有限公司）；ABI 7500 定量PCR 儀（美國ABI 公司）；DYY-6C 電泳儀（北京六一儀器公司）；蛋白電泳及轉(zhuǎn)膜設(shè)備（美國Bio-Rad公司）；實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（7500Fast，美國Perkin Elmer 公司）；J2-21 高速離心機(jī)、J6-HC 離心機(jī)（美國Beckman 公司）；凝膠成像分析系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）；DU 80 紫外分光光度計(jì)（美國Beckman 公司）；定量PCR 試劑盒（廣州復(fù)能基因有限公司）；BCA蛋白定量檢測試劑盒（上海東寰生物科技）。

1.3 大鼠MCAO/R 模型的建立

采用大鼠大腦中動脈先閉塞再灌注法[11]構(gòu)建MCAO/R 模型。 造模后2 h 大鼠完全蘇醒后參照Longa 評分法[12]對大鼠神經(jīng)缺損進(jìn)行評分：無偏癱及神經(jīng)功能缺損為0 分；梗死對側(cè)前爪屈曲、伸直障礙為1 分；向偏癱側(cè)轉(zhuǎn)圈追尾為2 分；爬行時(shí)向偏癱側(cè)傾倒為3 分；意識喪失、不能行走為4 分。 將評分為1～3 分大鼠視為造模成功，納入實(shí)驗(yàn)觀察。實(shí)驗(yàn)過程中，線栓未能成功插入及死亡大鼠2 只，將其進(jìn)行剔除，所有剔除大鼠按實(shí)驗(yàn)要求進(jìn)行隨機(jī)補(bǔ)充。

1.4 干預(yù)方法

正常組：捆綁處理，不予電針；假手術(shù)組：血管分離后不插線縫合，捆綁處理，不予電針；模型組：MCAO/R，捆綁處理，不予電針；心經(jīng)穴組：MCAO/R+電針心經(jīng)穴；心包經(jīng)穴組：MCAO/R+電針心包經(jīng)穴。

電針方法：根據(jù)2010 版《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[13]確定腧穴位置，按照經(jīng)脈“胸走手”的循行方向，選取癱瘓側(cè)肢體不同節(jié)段常用穴位，心包經(jīng)組取天泉、曲澤、內(nèi)關(guān)、大陵為代表穴，心經(jīng)穴組取極泉、少海、靈道、神門為代表穴。大鼠造模成功后第2 天開始針灸治療，15 mm、36 號一次性無菌針灸針刺入上述穴位3 mm左右后，分別連接電針儀的輸出端，予以電針刺激。電針連接方式：心包經(jīng)穴組曲澤與天泉相連，大陵與內(nèi)關(guān)相連；心經(jīng)穴組極泉與少海相連，靈道與神門相連。 電針刺激參數(shù)為連續(xù)波、20 Hz，強(qiáng)度以大鼠上肢輕微抖動為度，每次30 min，每日1 次。

1.5 檢測指標(biāo)及方法

1.5.1 大鼠神經(jīng)功能缺損評分 各組治療完成后第2 天采用改良神經(jīng)功能缺損評分[14-15]評估電針對大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)的影響?？偡譃?8分，分值越高，神經(jīng)功能損傷程度越重。

1.5.2 大鼠腦梗死體積百分比測定 將標(biāo)本放入腦槽中做冠狀切片，4 刀將大鼠腦分為5 片。 第1 刀于腦前極和視交叉連線的中點(diǎn)，第2 刀于大腦視交叉處，第3 刀于漏斗柄處，第4 刀于漏斗柄與尾極之間，每片厚約2 mm。 將腦片放入2% TTC 磷酸緩沖液中進(jìn)行染色，37 ℃避光恒溫箱孵育30 min，正常腦組織為紅色，而梗死部位呈白色。染色后進(jìn)行拍照處理，并采用多媒體彩色病理圖象分析系統(tǒng)測量每片的面積和梗死灶面積，然后乘以片厚（2 mm），即每片體積和梗死灶體積，腦梗死體積百分比即為梗死區(qū)體積與正常側(cè)大腦半球體積的比值，再進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析[16]。

1.5.3 大鼠海馬區(qū)MeCP2 mRNA 表達(dá)的檢測 取-80 ℃凍存的組織標(biāo)本30 mg 于裝有液氮中的研缽中研磨成粉末。采用Trizol-離心柱法提取總RNA，測定RNA 純度，計(jì)算RNA 溶液濃度，判斷RNA 提取質(zhì)量，則可以滿足后續(xù)RT-PCR 所需。 將提取到的總RNA 反轉(zhuǎn)錄后得到cDNA，-20 ℃保存。 利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 試劑盒配置擴(kuò)增體系，標(biāo)準(zhǔn)實(shí)時(shí)PCR 反應(yīng)體積為20 μL，實(shí)時(shí)PCR 條件為95 ℃1.5 min。 95 ℃15 s，60 ℃25 s，72 ℃30 s，以上3 步驟進(jìn)行40 個(gè)循環(huán)。以beta-actin 用作對照。引物由廣州復(fù)能基因有限公司合成，引物序列見表1。 使用2-△△Ct分析數(shù)據(jù)。

表1 引物序列

1.5.4 大鼠MCAO 大鼠海馬區(qū)MeCP2、PMeCP2 蛋白表達(dá)的檢測 取-80 ℃冰箱凍存的組織標(biāo)本100 mg于裝有液氮中的研缽中研磨成粉末。 加入RIPA 裂解，采用BCA 蛋白定量法測定蛋白濃度。 將蛋白樣品和maker 加入上樣孔，通過凝膠電泳制備樣品并電轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上。 在含有5%無脂乳的PBS 中封閉1 h 后，加入一抗GAPDH（1∶1000）、MeCP2（1∶1000）、pMeCP2（1∶1000）24 ℃搖床過夜。隔天洗膜后加入二抗Rabbit-HRP（1∶8000）室溫孵育2 h，洗膜后，放入化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)曝光，采用Image J 圖像分析處理系統(tǒng)將掃描后的圖像進(jìn)行灰度分析，以目的蛋白條帶與beta-actin 條帶灰度值的比作為目的蛋白的相對表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。 計(jì)量資料用“±s”表示，資料滿足正態(tài)分布，多組間比較采用方差分析；不滿足正態(tài)分布和方差齊性時(shí)采用Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)。 以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分的比較

與正常組及假手術(shù)組比，模型組、心經(jīng)穴組、心包經(jīng)穴組神經(jīng)功能缺損在1 d、7 d、14 d、21 d 的評分明顯升高（P＜0.01），提示造模成功。與模型組比，心經(jīng)穴組在14 d、21 d的評分明顯降低（P＜0.01）；心包經(jīng)穴組在7 d、14 d 的評分降低（P＜0.05），21 d的評分也顯著降低（P＜0.01）。心經(jīng)穴組、心包經(jīng)穴組兩組之間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。 詳見表2。

表2 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分的比較（±s，分，n=10）

表2 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分的比較（±s，分，n=10）

注：與正常組比較，★★P＜0.01；與假手術(shù)組比較，●●P＜0.01；與模型組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

組別正常組假手術(shù)組模型組心經(jīng)穴組心包經(jīng)穴組1 d 0.00±0.00 0.00±0.00 7.50±0.81★★●●7.40±0.51★★●●7.50±0.62★★●●7 d 0.00±0.00 0.00±0.00 7.10±0.82★★●●6.70±0.45★★●●6.50±0.68★★●●▲14 d 0.00±0.00 0.00±0.00 6.70±0.99★★●●5.30±1.27★★●●▲▲5.70±1.35★★●●▲21 d 0.00±0.00 0.00±0.00 6.10±0.85★★●●4.80±0.73★★●●▲▲4.60±0.67★★●●▲▲

2.2 各組大鼠腦梗死體積百分比的比較

與正常組、假手術(shù)組比較，模型組、心經(jīng)穴組、心包經(jīng)穴組在1 d、7 d、14 d、21 d 的腦梗死體積百分比均明顯升高（P＜0.01），說明造模成功。 模型組、心經(jīng)穴組、心包經(jīng)穴組腦梗死體積百分比各組組間比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。 詳見表3。

表3 各組大鼠腦梗死體積百分比（±s，%，n=3）

表3 各組大鼠腦梗死體積百分比（±s，%，n=3）

注：與正常組比較，★★P＜0.01。 與假手術(shù)組比較，●●P＜0.01。

組別正常組假手術(shù)組模型組心經(jīng)穴組心包經(jīng)穴組1 d 0.00±0.00 0.00±0.00 21.14±2.05★★●●20.35±2.16★★●●21.23±3.08★★●●7 d 0.00±0.00 0.00±0.00 21.18±3.04★★●●20.75±2.38★★●●21.41±3.76★★●●14 d 0.00±0.00 0.00±0.00 20.15±3.61★★●●20.54±3.67★★●●20.17±4.54★★●●21 d 0.00±0.00 0.00±0.00 19.67±5.10★★●●19.84±4.76★★●●20.36±6.13★★●●

2.3 各組大鼠海馬區(qū)MeCP2 mRNA 表達(dá)的比較

與正常組及假手術(shù)組比較，模型組、心經(jīng)穴組、心包經(jīng)穴組在7 d、14 d、21 d 的MeCP2 mRNA 表達(dá)均升高（P＜0.01）；與模型組比較，心經(jīng)穴組在14 d、21 d 的MeCP2 mRNA 均下降（P＜0.01）；心包經(jīng)穴組 在7 d、14 d、21 d 的MeCP2 mRNA 表 達(dá) 下 降（P＜0.05，P＜0.01）。 與心經(jīng)穴組比較，心包經(jīng)穴組在14 d 時(shí)高于心經(jīng)穴組（P＜0.05），在21 d 時(shí)低于心經(jīng)穴組（P＜0.05）。 詳見表4。

表4 各組大鼠海馬區(qū)MeCP2 mRNA 表達(dá)的比較（±s，n=5）

表4 各組大鼠海馬區(qū)MeCP2 mRNA 表達(dá)的比較（±s，n=5）

注：與正常組比較，★★P＜0.01；與假手術(shù)組比較，●●P＜0.01；與模型組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；與心經(jīng)穴組比較，◇P＜0.05。

組別正常組假手術(shù)組模型組心經(jīng)穴組心包經(jīng)穴組1 d 1.00±0.02 1.33±0.90 1.44±1.17 1.40±1.12 1.92±1.79 7 d 1.00±0.01 5.31±3.05 27.65±12.06★★●●23.79±11.35★★●●21.93±14.38★★●●▲14 d 1.00±0.00 4.81±2.27 26.89±6.43★★●●13.76±2.96★★●●▲▲16.48±3.00★★●●▲▲◇21 d 1.00±0.01 1.91±0.96 21.37±1.26★★●●11.43±5.22★★●●▲▲5.94±3.01★★●●▲▲◇

2.4 各組大鼠海馬區(qū)MeCP2、pMeCP2 蛋白表達(dá)的比較

與正常組及假手術(shù)組比，模型組、心經(jīng)穴組、心包經(jīng)穴組在7 d、14 d、21 d MeCP2 蛋白表達(dá)均升高（P＜0.01）。與模型組比，心經(jīng)穴組在7 d 時(shí)MeCP2蛋白表達(dá)增高（P＜0.01）；心包經(jīng)穴組7 d 時(shí)MeCP2蛋白表達(dá)增高（P＜0.01），在21 d 時(shí)降低（P＜0.05）。與心經(jīng)穴組比較，心包經(jīng)穴組在7 d 時(shí)MeCP2 蛋白表達(dá)增高（P＜0.05）。 詳見圖1、表5。

表5 各組大鼠海馬區(qū)MeCP2 蛋白表達(dá)的比較（±s，n=5）

表5 各組大鼠海馬區(qū)MeCP2 蛋白表達(dá)的比較（±s，n=5）

注：與正常組比較，★★P＜0.01；與假手術(shù)組比較，●●P＜0.01；與模型組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；與心經(jīng)穴組比較，◇P＜0.05。

組別正常組假手術(shù)組模型組心經(jīng)穴組心包經(jīng)穴組1 d 1.00±0.01 0.85±0.80 1.35±0.61 1.86±0.59 1.43±0.42 7 d 1.00±0.02 2.56±1.57 26.89±10.93★★●●33.09±14.72★★●●▲45.56±10.94★★●●▲▲◇14 d 1.00±0.01 2.08±1.47 27.58±3.02★★●●29.41±4.29★★●●28.84±4.81★★●●21 d 1.00±0.03 0.83±0.54 22.37±4.57★★●●21.25±4.66★★●●19.06±6.73★★●●▲

與正常組及假手術(shù)組比，模型組、心經(jīng)穴組、心包經(jīng)穴組在7 d、14 d、21 d 的pMeCP2 蛋白表達(dá)均升高（P＜0.01）；與模型組比，心經(jīng)穴組、心包經(jīng)組在7 d、14 d、21 d 的pMeCP2 蛋白表達(dá)升高（P＜0.01）。與心經(jīng)穴組比較，心包穴經(jīng)組在7 d、14 d、21 d 的pMeCP2 蛋白表達(dá)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。詳見圖1、表6。

表6 各組大鼠海馬區(qū)pMeCP2 蛋白表達(dá)的比較（±s，n=5）

表6 各組大鼠海馬區(qū)pMeCP2 蛋白表達(dá)的比較（±s，n=5）

注：與正常組比較，★★P＜0.01；與假手術(shù)組比較，●●P＜0.01；與模型組比較，▲▲P＜0.01。

組別正常組假手術(shù)組模型組心經(jīng)穴組心包經(jīng)穴組1 d 1.00±0.01 1.02±1.11 2.75±1.91 2.43±1.81 2.45±1.94 7 d 1.00±0.00 1.27±0.60 19.30±5.40★★●●28.41±5.80★★●●▲▲29.39±4.88★★●●▲▲14 d 1.00±0.02 1.05±1.43 12.76±3.21★★●●25.47±6.33★★●●▲▲24.32±7.11★★●●▲▲21 d 1.00±0.01 1.59±0.76 11.52±10.92★★●●25.24±10.31★★●●▲▲25.16±12.23★★●●▲▲

圖1 各組大鼠海馬區(qū)pMeCP2、MeCP2 蛋白條帶圖

3 討論

腦血管疾病因其高發(fā)病率、高死亡率、高致殘率及高復(fù)發(fā)率等特點(diǎn)越來越受到人們重視[17]。 針灸療法作為腦缺血疾病的一種重要的防治手段已被公認(rèn)，其作用機(jī)制一直都是研究的熱點(diǎn)[18-19]。曹香玲等[20]采用電針曲池、足三里，黃金等[21]采用電針神庭、百會，均證實(shí)了電針的療效。本研究干預(yù)思路源于中醫(yī)經(jīng)典原創(chuàng)理論“心主血脈、心主神明”，選取與心、腦密切相關(guān)的心經(jīng)穴、心包經(jīng)穴治療腦缺血疾病，有“從心治腦”一說[22]，目前兩經(jīng)對比的研究報(bào)道尚少見。為更好代表經(jīng)脈特異性，本研究選穴依據(jù)具有以下特點(diǎn)：均為腕肘肩關(guān)節(jié)或其附近的特定穴，均是本經(jīng)本臟臨床治療中的常用穴，均位于肢體相同的神經(jīng)節(jié)段處。 本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果證實(shí)，電針心經(jīng)穴與心包經(jīng)穴均能有效改善神經(jīng)功能缺損癥狀，療效確切，且其作用呈現(xiàn)時(shí)間效應(yīng)。 但是其腦梗死率改變不明顯，考慮其可能與腦梗死區(qū)恢復(fù)期較長，且梗死損傷的不可逆相關(guān)。

腦缺血損傷后神經(jīng)功能重建與修復(fù)是治療該病的關(guān)鍵。 突觸可塑性理論是腦損傷后神經(jīng)修復(fù)的重要學(xué)說[2]。 諸多研究證實(shí)，電針可以調(diào)節(jié)腦缺血損傷后突觸結(jié)構(gòu)的可塑性以及突觸的功能可塑性[2,23-24]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，電針心包經(jīng)穴也具有此效應(yīng)[25-26]，但是其具體作用途徑及機(jī)制尚不明確。 MeCP2 磷酸化修飾途徑調(diào)控目標(biāo)基因的表達(dá)，從而影響神經(jīng)干細(xì)胞的分化及可塑性改變可能是其發(fā)揮作用的關(guān)鍵。 MeCP2 具有轉(zhuǎn)錄激活子和抑制子的雙重身份，通過組蛋白乙?；虳NA 甲基化調(diào)節(jié)多個(gè)基因的表達(dá)水平[27]。 研究證實(shí)，MeCP2 特異性結(jié)合甲基化DNA參與神經(jīng)發(fā)育的多個(gè)階段[28]，在神經(jīng)突的形成和發(fā)育中扮演著重要角色。 MeCP2 對神經(jīng)細(xì)胞的生物學(xué)調(diào)節(jié)作用與自身磷酸化狀態(tài)（磷酸化或脫磷酸化）密切相關(guān)[27]。 李攀等[4]發(fā)現(xiàn)腦缺血誘導(dǎo)的MeCP2 磷酸化修飾及其介導(dǎo)的胞核-胞質(zhì)轉(zhuǎn)位在缺血性卒中后神經(jīng)干細(xì)胞的分化調(diào)節(jié)中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。 本研究也發(fā)現(xiàn)，缺血損傷急性期MeCP2 mRNA、MeCP2蛋白、pMeCP2 蛋白的表達(dá)增加，這一結(jié)果證實(shí)缺血損傷可誘導(dǎo)機(jī)體的應(yīng)激反應(yīng)，促使自身MeCP2 磷酸化機(jī)制的產(chǎn)生[29-30]。

此外，本研究發(fā)現(xiàn)心經(jīng)穴、心包經(jīng)穴電針刺激后，兩經(jīng)穴組均可在一定時(shí)間段先促進(jìn)MeCP2、pMeCP2 表達(dá)，加速M(fèi)eCP2 磷酸化的轉(zhuǎn)變過程，延緩pMeCP2 下降，心包經(jīng)穴比心經(jīng)穴可以更早（7 d）、更強(qiáng)（14 d、21 d）地發(fā)揮延緩MeCP2 減少的作用。pMeCP2 腦損傷后開始增多，7 d 到達(dá)峰值后，逐步下降，而電針心經(jīng)穴、心包經(jīng)穴延緩其下降的作用大致相當(dāng)。 綜上所述，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)電針心經(jīng)穴、心包經(jīng)穴可以促進(jìn)MeCP2 磷酸化，延緩其下降過程，改善腦缺血損傷大鼠的神經(jīng)功能缺損癥狀，兩經(jīng)效果大體相當(dāng)。 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為臨床運(yùn)用心經(jīng)、心包經(jīng)穴治療腦缺血提供了一定的理論依據(jù)與實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，但電針心經(jīng)、心包經(jīng)穴對MeCP2 磷酸化與突觸可塑性以及神經(jīng)修復(fù)之間的關(guān)系，以及具體的作用機(jī)制還需要進(jìn)一步深入研究。