固相萃取-液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜法測定靜寧燒雞中14種雜環(huán)胺含量

田鑄,陳敬敬,張丹,張珍,陳騁,師希雄*

1(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院,甘肅 蘭州,730070)2(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué),甘肅省干旱生境作物學(xué)重點實驗室,甘肅 蘭州,730070)

傳統(tǒng)燒雞風(fēng)味獨特、營養(yǎng)全面,深受當(dāng)?shù)叵M者的青睞。燒雞制作一般經(jīng)過生雞預(yù)處理、整形、油炸、鹵煮等工藝[1-2]。靜寧燒雞有別于傳統(tǒng)燒雞,作為甘肅百年老字號,其主要使用陳年老鹵湯鹵煮,鹵制過程中老湯賦予雞肉獨特的風(fēng)味[3]。由于鹵煮時間長,加之老湯重復(fù)使用,靜寧燒雞中可能會產(chǎn)生一定量的雜環(huán)胺(heterocyclic aromatic amines,HAAs)[4]。HAAs是由富含蛋白質(zhì)的食品經(jīng)過熱加工由蛋白質(zhì)、氨基酸熱解產(chǎn)生的一類具有多環(huán)芳香族結(jié)構(gòu)的致癌致突變化合物[5-6]。HAAs能夠誘導(dǎo)人體發(fā)生氧化應(yīng)激,以及細(xì)胞生物活性功能損害,最終增加人體慢性疾病發(fā)生的概率[7]。因此,有必要研究靜寧燒雞中HAAs的檢測方法。

肉制品中由于HAAs含量低(ng/g)、種類多,且成分復(fù)雜,因此準(zhǔn)確定量肉制品中的每種HAAs化合物及其困難[8]。此外,HAAs類化合物水溶性強,揮發(fā)性低,有部分HAAs缺乏紫外生色團結(jié)構(gòu),還有部分HAAs沒有熒光特性,如何快速、準(zhǔn)確、高效檢測并定量HAAs一直是近幾年研究的熱點[9-10]。目前,我國發(fā)布的關(guān)于食品中HAAs含量檢測標(biāo)準(zhǔn)僅有GB 5009.243—2016 《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 高溫烹調(diào)食品中雜環(huán)胺類物質(zhì)的測定》,其主要適用于烤魚、烤肉及其制品中5種HAAs的測定。2021年11月由中國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布的NY/T 3904—2021 《肉及肉制品中雜環(huán)胺檢測液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》主要適用于肉及肉制品中13種HAAs的測定。我國現(xiàn)階段對于食品中HAAs的限量標(biāo)準(zhǔn)還尚未建立,同時也缺乏對醬鹵肉制品中的HAAs專一的測定方法研究。

目前,食品中檢測HAAs的方法主要有氣相色譜(gas chromatography,GC)、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(gas chromatograph-mass spectrometer,GC-MS)、液相色譜(liquid chromatograph,LC)、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(liquid chromatograph mass spectrometer,LC-MS)等[11-13]。由于HAAs大多不具有揮發(fā)性,應(yīng)用GC或GC-MS方法檢測,須先將其衍生為揮發(fā)性物質(zhì)再進(jìn)行檢測,而目前衍生化技術(shù)操作繁瑣,檢測靈敏度較差,限制了上述檢測方法的普及[14]。LC-MS靈敏度高,選擇性強,是當(dāng)前用于測定HAAs的首選方法[15]。

李可等[7]采用LC-MS技術(shù)對醬鹵雞腿老湯中的HAAs進(jìn)行檢測。結(jié)果表明,10種HAAs標(biāo)準(zhǔn)品在2～200 μg/L線性范圍良好,在不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品的添加水平下回收率為55.6%～100.2%。魏晉梅等[16]建立了LC-MS快速檢測醬鹵肉制品中5種HAAs的方法,5種HAAs的加標(biāo)回收率為76.9%～127.7%,檢出限為0.01～0.1 μg/kg,定量限為0.025～0.25 μg/kg,能滿足醬鹵肉制品中HAAs的檢測需求。目前采用LC-MS檢測靜寧燒雞中HAAs的方法未見文獻(xiàn)報道。因此,本文旨在通過固相萃取-液相色譜/質(zhì)譜法(solid-phase extraction-liquid chromatography mass spectrometry,SPE-LC/MS)建立靜寧燒雞中14種HAAs的檢測方法,以便為HAAs控制研究奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

標(biāo)準(zhǔn)品:Harman(1-甲基-9 H-吡啶并[3,4-b]吲哚)、Norharman(9 H-吡啶并[3,4-b]吲哚)、PhIP(2-氨基-1-甲基-6-苯基咪唑并[4,5-b]吡啶)、Trp-P-1(3-氨基-1,4-二甲基-5 H-吡啶并[4,3-b]吲哚)、Trp-P-2(3-氨基-1,4-二甲基-5 H-吡啶[4,3-b]吲哚乙酸)、MeIQx(2-氨基-3,8-二甲基咪唑并[4,5-f]喹喔啉)、4,8-DiMeIQx(2-氨基-3,4,8-三甲基咪唑并[4,5 -f]喹喔啉)、AαC(2-氨基-9 H-吡啶并[2,3-b]吲哚)、IQ(2-氨基-3-甲基咪唑并[4,5-f]喹啉)、Glu-p-1(2-氨基-6-甲基二吡啶并[1,2-a:3′,2′-d]咪唑)、IQx(2-氨基-3-甲基咪唑并[4,5-f]喹喔啉)、7,8-DiMeIQx(2-氨基-3,7,8-三甲基咪唑并[4,5-f]喹喔啉)、DMIP(2-氨基-1,6-二甲基咪唑并[4,5-b]吡啶)、MeIQ(2-氨基-3,4-二甲基咪唑并[4,5-f]喹喔),純度均不低于99.9%,加拿大Toronto Research Chemicals公司;乙酸乙酯、甲醇、乙腈、甲酸、二氯甲烷均為色譜純,天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

樣品采集:靜寧燒雞購買自甘肅靜寧縣燒雞店。肉樣采集后,將雞胸部位雞肉與雞皮分開,分別用組織搗碎機搗碎成肉糜,在-18 ℃下保存待用。

LC-MS/MS Agilent 1290—6460液相色譜串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜儀,配有電噴霧離子源(electrospray ionization,ESI),美國安捷倫公司;RE-52C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,鄭州市亞榮儀器有限公司;FSH-2A型可調(diào)高速勻漿機,江蘇省金壇市友聯(lián)儀器研究所;TGL-16MC型冷凍離心機,湖南湘儀集團;KH3200B型超聲波清洗器昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司;Milli-Q超純水系統(tǒng),Millipore公司;固相萃取柱Cleanert PS(500 mg/6mL)、Cleanert MCX(500 mg/3mL)、Strata-X(500 mg/3mL)、Cleanert PRS(500 mg/3mL)、Cleanert S C18(500 mg/6mL),天津博納艾杰爾科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取14種HAAs標(biāo)準(zhǔn)品各5 mg,標(biāo)準(zhǔn)品用甲醇溶解,并在棕色容量瓶中定容至50 mL,配制成質(zhì)量濃度均為100 mg/L的單標(biāo)儲備液。按實際檢測要求,準(zhǔn)確移取相同體積的各儲備液制備成混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液,用甲醇將混標(biāo)液分別稀釋成10、20、50、100、500 μg/L。所有的標(biāo)準(zhǔn)溶液保存在-18 ℃。

1.2.2 樣品前處理方法

樣品前處理根據(jù)董學(xué)文[11]的方法稍作修改。稱取2 g肉樣與10 mL乙酸乙酯和2 mL 1 mol/L的NaOH混合,在冰浴條件下均質(zhì)30 s(10 000 r/min)后以6 000×g的轉(zhuǎn)速離心10 min。將上清液收集,沉淀按上述步驟重復(fù)提取2次并合并上清液。除去位于上清液下層的水溶液后,將上清液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮,濃縮完成后使用6 mL二氯甲烷重新溶解提取物。將5 mL二氯甲烷加入丙磺酸(propanesulfonic acid,PRS)柱使之活化,將提取物加入活化后的PRS柱中。隨后,依次加入4 mL 0.1 mol/L HCl,6 mL甲醇鹽酸混合液[V(甲醇)∶V(0.1 mol/L HCl)=1∶1]和2 mL蒸餾水洗脫PRS柱,收集含有非極性HAAs的部分。將收集的洗脫液加入0.26 mL氨水后,將其加入活化后的C18柱中(活化:2 mL甲醇、5 mL蒸餾水)。仍然留在PRS柱中的極性雜環(huán)胺使用20 mL 0.5 mol/L乙酸銨(pH 8.5)洗脫。最后,吸取溶液1.5 mL[V(甲醇)∶V(氨水)=19∶1]分別沖洗2個C18柱。將收集的3 mL洗脫液通過0.22 μm有機濾膜后收集,待LC-MS上機檢測。

1.3 檢測條件

1.3.1 色譜條件

色譜柱:ZORBAX Eclipse XDB-C18色譜柱(150 mm×2.1 mm,5 μm),柱溫35 ℃,流動相A為0.1%(體積分?jǐn)?shù))甲酸水溶液,流動相B為甲醇-0.1%(體積分?jǐn)?shù))甲酸,流速0.3 mL/min,進(jìn)樣量2 μL,梯度洗脫程序見表1。

表1 十四種HAAs分離的梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program for 14 kinds of HAAs

1.3.2 質(zhì)譜檢測條件

質(zhì)譜檢測條件參考魏晉梅等[16]的方法并做修改。電噴霧離子源(ESI),正離子掃描、多反應(yīng)監(jiān)測(multiple reaction monitoring,MRM)模式;毛細(xì)管電壓+ 3.2 kV;錐孔電壓+1 kV;離子源溫度120 ℃;脫溶劑溫度350 ℃;噴霧氣為氮氣(0.31 MPa);載氣流速10 L/min,350 ℃;鞘氣流速11 L/min,350 ℃;脫溶劑氣流速500 L/h;錐孔反吹氣流速50 L/h;質(zhì)量掃描范圍(m/z):80～1 000;掃描時間0.05 ms,其他質(zhì)譜信息見表2。

表2 十四種HAAs優(yōu)化的特征離子與質(zhì)譜參數(shù)Table 2 MS parameters of the characterization of14 HAAs

1.4 方法學(xué)評價

本研究對LC-MS檢測方法線性范圍、檢測限(limit of detection,LODs)、定量限(limit of quantita- tion、LOQs)、加標(biāo)回收率、精密度等方法學(xué)參數(shù)進(jìn)行分析。HAAs加標(biāo)回收率:在靜寧燒雞空白樣品中添加20、50、100 μg/L 3個濃度的HAAs混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,按照1.2 和1.3節(jié)方法檢測分析,計算回收率和精密度。以3倍信噪比(S/N=3)和10倍信噪比(S/N=10)為該方法對各種HAAs的LODs和LOQs,單位為ng/g。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用儀器自帶的Agilent MassHunter軟件對LC- MS所得的數(shù)據(jù)進(jìn)行采集和峰面積積分處理。試驗數(shù)據(jù)使用SPSS 20.0試驗統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析(P<0.05),并使用Origin 2017作圖,每組試驗重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

取質(zhì)量濃度為1 μg/mL的14種HAAs標(biāo)準(zhǔn)品在LC-MS上以0.3 mL/min的流速進(jìn)樣,調(diào)節(jié)毛細(xì)管電壓和碰撞電壓,考察14種HAAs標(biāo)準(zhǔn)品最佳的質(zhì)譜條件。由于HAAs中含有氨基和亞氨基,根據(jù)其電離特性,本研究選擇正離子模式進(jìn)行檢測[17]。通過LC-MS自帶的Masslynx 4.1自動調(diào)諧功能進(jìn)行調(diào)諧,分別對14種HAAs的MRM參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。在MRM模式下,質(zhì)譜通常通過篩選目標(biāo)化合物的母離子和定量離子來定性并且定量待測化合物,以提高質(zhì)譜檢測的選擇性和靈敏度。因此,基于肉樣品基質(zhì)的復(fù)雜性,為更好地對靜寧燒雞中痕量HAAs進(jìn)行檢測,本研究通過比較各定性定量碎片離子所產(chǎn)生的質(zhì)譜信號的強弱,選擇相對豐度最高的離子碎片作為定量離子,14種HAAs的定性與定量特征離子及優(yōu)化的質(zhì)譜參數(shù)見表2。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

2.2.1 色譜柱的選擇

反相色譜柱是LC-MS/MS分析中最常用的柱子,實驗選取了ZORBAX Eclipse XDB-C18色譜柱,對比了兩種規(guī)格(150 mm×2.1 mm,5 μm)、(50 mm×2.1 mm,5 μm)對14種HAAs實際分離效果,結(jié)果表明,50 mm規(guī)格的色譜柱響應(yīng)值低、峰形不能區(qū)別開,150 mm的色譜柱具有良好的分離效果,可供檢測14種HAAs。

2.2.2 流動相的選擇

流動相的比例能夠在一定程度影響目標(biāo)化合物在色譜柱上的分離和保留行為。14種HAAs大多為弱堿性化合物,其在流動相中的分離能力和溶解性因流動相的變化而變化。在流動相中添加有機酸類溶液如甲酸、甲酸銨和乙酸銨等能夠提高HAAs的離子化效率,改善峰形,提高檢測的靈敏度[10]。根據(jù)LC-MS儀器自身條件的局限,本研究分別考察了甲醇、乙腈、0.1%甲酸水、甲酸銨(2.5、5、10 mmol/L)對14種HAAs分離效果的影響,同時還對有機相中添加甲酸進(jìn)行研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn),0.1%甲酸水和甲醇-0.1%甲酸作為流動相進(jìn)行梯度洗脫時,色譜峰峰形尖銳,對稱性好,在12 min內(nèi)能夠完全快速分離HAAs,因此,本研究選取0.1%甲酸水和甲醇-0.1%甲酸作為流動相條件。

2.2.3 柱溫的選擇

柱溫箱能夠通過調(diào)控溫度維持色譜柱的穩(wěn)定性,有利于色譜峰分離的程度,確保待測化合物檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性。為此,本研究考察了不同的柱溫箱溫度(25、30、35、40 ℃)對14種HAAs標(biāo)準(zhǔn)品的分離效果。結(jié)果表明在35 ℃條件下,14種HAAs混標(biāo)峰形尖銳,分離度好,并且具有較高的響應(yīng)值,因此,本研究將柱溫箱溫度設(shè)定為35 ℃進(jìn)一步研究。

2.3 樣品前處理條件的優(yōu)化

2.3.1 固相萃取柱的選擇

不同的提取溶劑所得的提取液往往會產(chǎn)生不同程度的基質(zhì)干擾,影響定量的準(zhǔn)確性。因此,在優(yōu)化提取方法的同時,必須選擇與之配套的固相萃取條件[18]。如圖1所示,基于檢測樣品可能存在的基質(zhì)差異,本研究分別對比了PS、MCX、Strata-X、PRS 4種固相萃取柱與C18固相萃取柱串聯(lián)使用來選擇回收率最高的固相萃取柱。結(jié)果表明,當(dāng)PRS固相萃取柱與C18柱串聯(lián)使用其加標(biāo)回收率顯著高于其他3種串聯(lián)使用的固相萃取柱,這可能是由于PRS柱中的填料丙磺酸鍵合硅膠對弱堿性化合物HAAs具有良好的保留能力。因此本研究選用PRS柱(60 mg/3mL)與C18柱進(jìn)行富集、凈化。

圖1 固相萃取柱種類對HAAs回收率的影響Fig.1 Influences of different solid phase extraction columns on recoveries of HAAs注:不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)

2.3.2 提取溶劑的選擇

HAAs屬于堿性有機化合物,其親水性或疏水性取決于所處介質(zhì)的酸堿性,當(dāng)pH <3時,HAAs上的氨基帶正電荷,使其表現(xiàn)為親水性,隨后,HAAs隨著所處介質(zhì)pH的升高逐漸表現(xiàn)出疏水性[11]。因此在靜寧燒雞肉樣提取HAAs的過程中先用NaOH堿化處理后,再通過有機溶劑進(jìn)行提取。HAAs化合物在有機溶劑和水中均可以溶解,如圖2所示,本研究考察了二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇及乙腈作為提取溶劑并加入NaOH溶液(1 mol/L)進(jìn)行提取時的加標(biāo)回收率。結(jié)果表明,二氯甲烷由于密度較大,與肉樣均質(zhì)混合離心后分層效果不明顯,乙腈提取回收率較低且不易揮發(fā),用乙酸乙酯提取時大部分HAAs化合物的回收率顯著高與其他的提取溶劑,且在濃縮時揮發(fā)速度快,對人體危害較小。因此,本試驗確定乙酸乙酯作為HAAs的提取溶劑。

圖2 提取溶劑種類對HAAs回收率的影響Fig.2 Influences of different extraction solvents on recoveries of HAAs

2.3.3 PRS柱洗脫液比例的選擇

本研究主要是檢測靜寧燒雞中的HAAs,而靜寧燒雞中主要在100 ℃以下的鹵湯中熟制,其主要存在非極性HAAs,因此本試驗對非極性HAAs的洗脫過程進(jìn)行優(yōu)化。PRS柱作為強陽離子極性交換柱,乙酸乙酯將HAAs溶解后通過該固相萃取柱,從而將HAAs吸附在丙基磺酸鈉中,此時為正相萃取模式,而試驗中的非極性HAAs要想被洗脫下來必須在反相洗脫條件下,因此要先用鹽酸淋洗轉(zhuǎn)換洗脫模式,再以甲醇/鹽酸洗脫得到非極性HAAs[11]。本試驗分別采用2、3、4、6 mL鹽酸(0.1 mol/L)以及3、5、6、9 mLV(甲醇)∶V(鹽酸)=1∶1對固相萃取柱進(jìn)行洗脫,對比其回收率,如圖3所示。結(jié)果表明,洗脫液為4 mL鹽酸和6 mL甲醇/鹽酸時HAAs的回收率達(dá)到最高,隨著添加比例加大,部分HAAs的回收率反而有所降低,這可能是由于洗脫液體積過多,導(dǎo)致在C18柱中洗脫時不能很好保留而被損失。因此本試驗在洗脫過程以4 mL鹽酸和6 mL甲醇/鹽酸對PRS柱進(jìn)行洗脫,以便進(jìn)一步優(yōu)化。

2∶3、3∶5、4∶6、6∶9為鹽酸∶甲醇/鹽酸(體積比)圖3 PRS柱洗脫液比例對HAAs回收率的影響Fig.3 Influences of different eluent ratio of PRS solid phase extraction column on recoveries of HAAs

2.3.4 C18柱洗脫液種類的選擇

洗脫液是影響凈化效果和回收率的重要因素,如圖4所示,本研究考察了二氯甲烷-氨水、甲醇-氨水、二氯甲烷以及甲醇對HAAs回收率的影響,結(jié)果表明,氨水作為堿性溶液與甲醇結(jié)合用作洗脫液洗脫后的雜質(zhì)較少,且回收率顯著高于其他3種洗脫液。因此,本研究以V(甲醇)∶V(氨水)=19∶1作為C18固相萃取柱的洗脫液。

圖4 C18柱洗脫液種類對HAAs回收率的影響Fig.4 Influences of different C18 solid phase extraction column eluent on recoveries of HAAs

2.4 方法學(xué)評價

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線、方法的檢出限和定量限

以各種HAAs的濃度為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,其線性關(guān)系如表3。結(jié)果顯示,各HAAs標(biāo)準(zhǔn)曲線的決定系數(shù)r2均大于0.999,各組化合物在1～500 μg/L范圍內(nèi)線性良好,可以滿足定量分析的需要。

表3 十四種HAAs的線性范圍、回歸方程、決定系數(shù)及檢測限Table 3 Linear ranges,regression equations,correlation coefficients(r2),limits of detection and quantitation of 14 HAAs

2.4.2 回收率和精密度

回收率采用在不含待測組分的空白肉樣中添加測定,添加3個質(zhì)量濃度水平(20、50、100 μg/L)100 μL體積混合標(biāo)準(zhǔn)液,每個水平重復(fù)測6次,結(jié)果見表4,結(jié)果表明,14種HAAs的加標(biāo)回收率為83.04%～103.78%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均低于10%,精密度良好,能夠滿足靜寧燒雞中HAAs含量的檢測要求。

表4 十四種HAAs的回收率和精密度(n=6)Table 4 Recoveries and precisions of14 HAAs in meat samples(n=6)

2.5 實際樣品分析

采用上述優(yōu)化出來的HAAs檢測方法對3家燒雞店靜寧燒雞中的HAAs進(jìn)行檢測,結(jié)果如表5所示。結(jié)果表明,靜寧燒雞中共檢測出9種HAAs,3家燒雞的HAAs總量為8.38～12.35 ng/g。李可等[7]通過檢測市售傳統(tǒng)肉制品中4種HAAs的含量發(fā)現(xiàn),醬鹵雞肉HAAs總量在2.53～3.65 ng/g,邵斌[19]采用優(yōu)化后的HAAs檢測方法對國內(nèi)6種燒雞中的HAAs進(jìn)行檢測,結(jié)果表明HAAs總含量高達(dá)108.84 ng/g。本試驗結(jié)果與上述研究報道相近,靜寧燒雞中HAAs含量的生成可能是由于鹵煮過程中鹵湯的反復(fù)使用以及添加醬油導(dǎo)致的。

表5 不同購買來源靜寧燒雞中HAAs的含量 單位:ng/g

3 結(jié)論

以靜寧燒雞中雞皮和雞肉作為檢測樣本,優(yōu)化和選擇了SPE-LC/MS對14種HAAs檢測的儀器參數(shù)和樣品前處理方法。該方法線性關(guān)系良好,加標(biāo)回收率為83.04%～103.78%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.42%～7.66%,且前處理提取HAAs操作簡單,用時較短,安全性較高,檢測儀器LC-MS的靈敏性強,定量準(zhǔn)確,應(yīng)用范圍廣,能夠滿足靜寧燒雞中HAAs的檢測要求,可為靜寧燒雞中HAAs的形成規(guī)律以及控制等相關(guān)研究提供理論基礎(chǔ)。