鹽脅迫下AMF對櫸樹幼苗生長和光合特性的影響

馬仕林，曹鵬翔，張金池*，劉 京，王金平，朱凌駿，袁鐘鳴

(1.南京林業(yè)大學林學院，南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210037；2.江蘇鹽城大豐林場，江蘇 鹽城 224111)

鹽漬土壤會對植物產(chǎn)生滲透及離子脅迫，造成水分虧缺及離子毒害，影響生理代謝過程，限制光合作用，抑制植物生長發(fā)育[1-2]，嚴重制約了沿海防護林的發(fā)展。目前鹽堿地治理措施主要集中在工程、化學、農藝、生物技術等領域[3]。為了更有效、經(jīng)濟和環(huán)保地治理，通過生物手段提高植物在鹽堿地中的生產(chǎn)力成為治理鹽堿地的熱點方向[4]。叢枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi，AMF)作為陸地生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，能與70%～90%的陸地植物建立共生體[5]，并能通過多種途徑影響植物生理代謝[6]，進而影響植物光合作用。研究表明，菌根聯(lián)合可以提高植物干物質積累[7]、養(yǎng)分吸收[8]、滲透調節(jié)[9]、葉綠素濃度[10]、水分利用[11]等，從而提升植物的耐鹽性以及在鹽堿地中的生產(chǎn)力。

光合作用與植物的生長密切相關[12-13]，而光響應曲線能直觀地反映出光合速率與光合有效輻射的關系，對研究植物光合能力、光合潛力及生態(tài)適應性具有重要意義[14]。

櫸樹(Zelkovaserrata)又叫光葉櫸，是榆科(Ulmaceae)櫸屬(Zelkova)硬闊葉喬木樹種，具有重要經(jīng)濟和景觀利用價值[15]。研究發(fā)現(xiàn)，過高的土壤鹽分(質量分數(shù)0.5%)會損傷櫸樹葉片，并限制植株生長[16]，而提高葉片的光合性能則是提升鹽堿地中櫸樹生產(chǎn)力的重要途徑。然而，現(xiàn)有研究主要集中于對鹽脅迫下櫸樹的生理生化特性及耐鹽性研究[17-19]，鮮有鹽脅迫下AMF對櫸樹光合特性影響的報道[20]，更是缺乏此條件下光響應模型適用性探究。而適宜的光響應模型所提供的準確的特征參數(shù)將有助于直接或間接反映植物光合生理過程[21]，對鹽堿地林業(yè)生產(chǎn)有重要指導意義。為此，本研究以櫸樹幼苗為研究對象，于溫室內接種不同AMF后，進行鹽脅迫盆栽試驗。通過對比分析不同處理間的差異，探索鹽脅迫下AMF對櫸樹生長和光合特性的影響，并評定5種光響應模型的適用性，以期為利用菌根聯(lián)合技術提高植物在鹽堿地中的生產(chǎn)力提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料及試驗地概況

供試櫸樹種子與濕沙(相對濕度60%左右)按體積比1∶3 攪拌均勻，在4 ℃冰箱內保存30 d。隨后用3 g/L的KH2PO4溶液浸種24 h，75%(體積分數(shù))的乙醇溶液浸種5 min。用無菌蒸餾水洗凈種子后，在25 ℃的恒溫培養(yǎng)箱完成催芽，并于滅菌基質土(珍珠巖與草炭土體積比1∶1混合)中培育限菌苗(無AMF侵染的幼苗)。選取苗高約10 cm、地徑約1 mm，長勢一致的櫸樹幼苗于南京林業(yè)大學下蜀實習林場(119°12′E，32°07′N)溫室中進行盆栽試驗。

供試菌株摩西球囊霉(Glomusmosseae)1號(分離自貴州畢節(jié))、摩西球囊霉2號(分離自云南楚雄)及扭形球囊霉(G.tortuosum)(分離自內蒙伊金霍洛旗)由北京市農林科學院植物營養(yǎng)與資源研究所提供。培育櫸樹幼苗的同時，以玉米和三葉草為寄主，滅菌后的黃沙為基質，在人工氣候室內進行AMF的擴繁。3個月后，保留含有孢子、菌絲及侵染根段的黃沙，作為接種菌劑。

1.2 試驗設計

2017年6月，將供試幼苗分別接種摩西球囊霉1號(GM1)、摩西球囊霉2號(GM2)及扭形球囊霉(GO)，以不接種AMF為對照(處理N)，每種處理24盆，每盆基質約2.5 kg。盆栽基質由下蜀實習林場林地5～30 cm的表層土、黃沙以及蛭石等體積混合而成，混合基質在高溫高壓滅菌后于溫室內放置至少2周。在溫室中培育1 a作為AMF侵染期及植物生長期，期間每2個月澆Hoagland(減磷)營養(yǎng)液1次(每次每盆300 mL)，并適當補充無菌蒸餾水。溫室的環(huán)境條件：溫度18～35 ℃，相對濕度40%～80%，晝夜光周期14 h/10 h，光照強度 700～1 000 μmol/(m2·s)。

2018年6月底，檢測櫸樹根系菌根侵染狀況，確認AMF與櫸樹樹種根系已形成良好的共生關系后，進行鹽脅迫處理。GM1、GM2、GO及N 4種處理分別分成2組(每組12盆)，進行鹽脅迫處理，以非鹽脅迫為CK對照；鹽脅迫處理每周每盆澆300 mL濃度為100 mmol/L的NaCl溶液，非鹽脅迫處理以無菌蒸餾水代替NaCl溶液。試驗共進行2個月，期間定期補充Hoagland(減磷)營養(yǎng)液。2018年9月，每種處理選取3盆進行光合特性測定；采集對應根樣，進行菌根侵染率測定。

1.3 測定方法

1.3.1 菌根侵染率的測定

將存放于標準固定液中的細根洗凈后，剪成約1 cm長的根段。用10% KOH(質量分數(shù))溶液在90 ℃下漂洗60 min后，用0.05%(質量分數(shù))曲利苯藍溶液在70 ℃下染色。每個樣隨機選30個根段，在半自動數(shù)碼顯微鏡(Leica DM5000B，Wetzlar，德國)下觀察菌根侵染程度，拍照，按下列公式計算菌根侵染率[22]：

菌根侵染率=(有AMF侵染的根段數(shù)/檢查總根段數(shù))×100%。

1.3.2 生長指標的測定

于2018年6月鹽脅迫前和2018年9月鹽脅迫結束后用卷尺和電子游標卡尺分別測定幼苗的苗高和地徑，每個處理選取3株，計算苗高凈增長量和地徑凈增長量。

1.3.3 光合特性測定與光響應曲線繪制

在晴朗天氣的9:00—11:00，每個處理選取3株長勢一致的櫸樹，使用Li-6400型便攜式光合作用測定系統(tǒng)(Li-COR Inc，USA)進行光合特性測定。設定測定時的葉室溫度為(31±0.8)℃，葉室相對濕度為(6.3±4.4)%，光合有效輻射(photosynthetic active radiation，PAR)設置0、50、100、200、300、400、600、800、1 000、1 200、1 400、1 600、1 800及2 000 μmol/(m2·s)共計14個梯度，測定14個光合有效輻射下的葉片凈光合速率，不同光合有效輻射下的測定時間為180 s。

儀器自動記錄凈光合速率[net photosynthetic rate，Pn,μmol/(m2·s)]、蒸騰速率[transpiration rate，Tr,mmol/(m2·s)]、胞間CO2濃度[intercellular CO2concentration，Ci,μmol/mol]等氣體交換參數(shù)；計算氣孔限制值(Ls)來表示光合作用的氣孔限制(Ls=1-Ci/Ca，式中：Ci表示胞間CO2濃度，Ca表示大氣CO2濃度)；計算水分利用效率(water use efficiency，EWUE,mmol/mol)來表示櫸樹葉片的水分利用效率(EWUE=Pn/Tr)[23-24]。整合處理上述數(shù)據(jù)，最終選取平均數(shù)進行分析，并繪制光響應曲線(Pn-PAR曲線)。光響應模型及其理論公式的模型擬合見表1。

表1 光響應模型理論公式及參數(shù)設置

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2016和Origin 8.5進行數(shù)據(jù)的整理以及繪圖。單因素方差分析(Duncan檢驗)、雙因素方差分析及光響應模型曲線擬合采用SPSS 21.0進行。

2 結果與分析

2.1 鹽脅迫下菌根真菌對櫸樹生長的影響

苗高、地徑凈增長量可直觀反映櫸樹在接菌及鹽脅迫后的生長情況(表2)。雙因素分析顯示，鹽脅迫顯著降低了櫸樹苗高及地徑凈增長量(P< 0.05)，而接菌處理及其與鹽脅迫的交互作用未能顯著影響櫸樹苗高及地徑凈增長量。AMF對櫸樹苗高的促進作用主要表現(xiàn)在非鹽脅迫條件下，CK-GM2處理下櫸樹苗高凈增長量顯著高于CK-N處理(P< 0.05)，增幅為46.88%；而AMF對地徑的促進作用主要體現(xiàn)在鹽脅迫下，Salt-GM1及Salt-GM2處理下櫸樹地徑凈增長量顯著高于Salt-N處理(P< 0.05)，增幅分別為49.18%和51.37%。此外，鹽脅迫顯著降低了GM1及GO的侵染率(P< 0.05)，降幅分別為17.64%和19.65%，而鹽脅迫對GM2的侵染率影響并不顯著(表2，圖1)。

表2 AMF對櫸樹生長影響及菌根侵染率

2.2 鹽脅迫下菌根真菌對櫸樹光合特性的影響

凈光合速率、胞間CO2濃度、氣孔限制值和水分利用效率可直觀反映不同處理下櫸樹光合特性之間的差異(圖2)。本研究中，不接種情況下，鹽脅迫大幅度降低櫸樹葉片凈光合速率，同時提高了氣孔限制值，降低胞間CO2濃度，小幅度降低了水分利用效率。非鹽脅迫下，接菌處理能小幅提高櫸樹葉片凈光合速率，其中，GM1處理的提升最大。鹽脅迫下，3種接菌處理均能提升櫸樹葉片凈光合速率、氣孔限制值和水分利用效率，并能降低櫸樹葉片胞間CO2濃度，其中，GM2和GO處理較未接菌處理變化幅度最大。

2.3 鹽脅迫下5種模型的光響應曲線擬合

5種模型的光響應曲線擬合結果如圖3所示。模型擬合的精度可以通過相關指數(shù)(決定系數(shù))R2的大小來判定。當R2越接近1時，該模型擬合的精度越高，其參考價值也越高。非鹽脅迫條件下，5種模型均能較好地擬合櫸樹的光響應曲線，R2均達到0.970以上，其中葉子飄模型擬合效果最好，指數(shù)模型擬合效果最差。鹽脅迫條件下只有葉子飄模型擬合中Salt-N、Salt-GM1、Salt-GM2處理的R2高于0.900，分別為0.974、0.971、0.978，擬合效果較好；其余4種模型擬合中各處理的R2均低于0.900，擬合效果較差。

3 討 論

世界范圍內，鹽分對樹木的消極影響廣泛存在且代價昂貴[30]，這也體現(xiàn)在本研究中鹽脅迫對櫸樹幼苗的苗高、地徑凈增長量的顯著抑制作用上。針對這一問題，通過接種AMF提高植物在鹽堿地中的生產(chǎn)力成為治理鹽堿地的研究熱點。研究發(fā)現(xiàn)，接種AMF的植物一般會比不接種植物生長得更好[31]，菌根苗在鹽脅迫下比非菌根苗有更高的地上部和地下部生物量[32]，這與AMF根外菌絲擴大宿主植物根系的營養(yǎng)和水分吸收范圍高度相關[33]。本研究中，鹽脅迫下接種AMF對櫸樹生長的影響主要體現(xiàn)在提升地徑凈增長量方面，這可能是因為鹽脅迫下離子滲透及脅迫嚴重，根系汲水汲養(yǎng)困難，AMF主要通過改善植物根系形態(tài)，促進地下根系生長[34]，提高植物在鹽脅迫下的生產(chǎn)力。

菌根侵染率是反映AMF侵染植物情況的重要指標[35]，其取決于AMF菌種和寄主植物物種組合[36-37]，本研究中，無論脅迫與否，GM1對櫸樹根系侵染率均顯著高于接種GO，這也證實了上述結論。此外，前人研究認為鹽脅迫會降低AMF對寄主植物的侵染率[38]，本研究也顯示鹽脅迫對GM1和GO處理的菌根侵染率均有顯著降低作用，這可能是由于鹽分抑制了AMF菌絲生長、產(chǎn)孢和孢子的萌發(fā)[39]。然而，本研究中GM2處理的菌根侵染率并未受到鹽脅迫的顯著影響，一方面可能是AMF菌株的鹽耐受性差異導致[40]，另一方面可能與AMF菌種和寄主植物的親和力有關[41]。

鹽分過量地進入植物葉片會損害光合結構，減少葉片光合色素含量，進而導致植物生長變慢、生物量積累下降[42]。而接種AMF被認為能夠通過提高葉片氣孔交換能力、光合色素含量、光合系統(tǒng)PSⅡ的光化學和非光化學作用，進而增強植物光合作用[43-44]。本研究中，鹽脅迫大幅度降低櫸樹凈光合速率，并伴隨著胞間CO2濃度的下降，氣孔限制明顯，可能是由于鹽脅迫導致葉片氣孔關閉，葉肉細胞胞間CO2的消耗速率大于供應速率，從而造成胞間CO2濃度的降低，這與前人的研究結果相一致[45]。此外，本研究結果顯示，鹽脅迫下接種AMF降低了櫸樹葉片胞間CO2濃度，并伴有氣孔限制值的增加，這可能是過高的土壤鹽分對櫸樹葉片氣孔生理損傷嚴重，光合作用氣孔限制明顯，超過了AMF對氣孔導度的調節(jié)能力。然而，盡管胞間CO2濃度降低，氣孔限制值增加，鹽脅迫下接種AMF卻使櫸樹獲得了更高的凈光合速率，這可能是接種AMF有效提升了植物體CO2同化率，進而促進單位光合速率[46]。水分利用效率是反映植物物質積累與耗水量之間關系的重要生理生態(tài)參數(shù)，可用于估算環(huán)境因素對植物的影響[47-48]。本研究中水分利用效率均隨光合有效輻射的增加呈現(xiàn)先上升后下降趨勢。此外，接種AMF均有效提升了鹽脅迫下櫸樹葉片的水分利用效率，這可能是AMF通過增加植物體側根數(shù)量[49]、調節(jié)水勢[50]和根外菌絲汲水，有效改善了植株的水分利用情況。

光響應曲線模型能反映出光合速率與光合有效輻射的關系，然而不同植物最適用的光響應曲線模型不同[51]。筆者研究發(fā)現(xiàn)鹽脅迫下葉子飄模型對櫸樹光響應曲線的擬合效果最好，R2的均值達到0.953，而其余模型R2均低于0.900，擬合效果較差。前人研究發(fā)現(xiàn)直角雙曲線模型、非直角雙曲線模型、指數(shù)模型都是沒有極值的函數(shù)，無法直接獲得植物的最大凈光合速率和飽和光強等指標，而這一問題在葉子飄模型下得到了解決[52-53]。因而，在鹽脅迫及接種AMF條件下，應用光響應模型時，應該以葉子飄模型為主，這將有助于利用諸如暗呼吸速率、光飽和點、光補償點等特征參數(shù)直接或間接反映櫸樹的光合生理過程，對研究櫸樹鹽堿地生態(tài)適應性具有重要意義。

綜上，本研究結果表明鹽脅迫對植物生長及光合特性有抑制作用；接種AMF可以促進植物生長，提升植物葉片凈光合速率，緩解鹽脅迫對植物生長及光合特性的抑制作用；綜合AMF對櫸樹生長，光合特性的影響，GM2較為突出，為鹽堿地林業(yè)生產(chǎn)推薦選用菌株；5種光響應模型擬合中，葉子飄模型的擬合效果最好，為探究鹽脅迫下AMF對櫸樹凈光合速率影響的最優(yōu)模型。