蠟樣芽孢桿菌NJSZ-13菌株誘導(dǎo)馬尾松抗松材線蟲病研究

吳佳雯，尹艷楠，談家金，郝德君

(南京林業(yè)大學(xué)，南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，南京林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，江蘇 南京 210037)

松材線蟲病又稱松樹萎蔫病，是世界上極具危險(xiǎn)性的林木病害之一[1]，其病原是一種移居性植物內(nèi)寄生線蟲——松材線蟲(Bursaphelenchusxylophilus)。松材線蟲生長速度快，繁殖力強(qiáng)，主要取食松樹薄壁細(xì)胞，使樹脂分泌停止，導(dǎo)致松樹迅速萎蔫直至失水死亡。松材線蟲病具有發(fā)病快、治理難度大等特點(diǎn)，在許多國家，特別是中國和日本，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，并威脅著松林生態(tài)系統(tǒng)[2]。

馬尾松(Pinusmassoniana)作為我國重要的木材和油樹脂資源，是感染松材線蟲病的主要樹種。一些控制措施，如就地藥物熏蒸或燒毀，噴灑殺蟲劑殺滅媒介天牛等化學(xué)防治措施，雖然能延緩松材線蟲病的傳播速度[3]，但會污染環(huán)境，破壞生態(tài)平衡，也會使害蟲逐漸產(chǎn)生抗藥性，導(dǎo)致防治效果逐漸減弱。因此，迫切需要尋求一種安全、有效、無污染的生物防治措施。

許多植物本身就具備抵抗外界傷害能力，能夠?qū)Χ喾N病害產(chǎn)生抗病能力，即系統(tǒng)抗病性能，屬于先天免疫。然而，有些植物當(dāng)受病原體的原發(fā)感染時(shí)，需要靠環(huán)境中的非生物或生物因子誘導(dǎo)才能激活其防御機(jī)制，這種誘導(dǎo)作用可以是多因素的。某些細(xì)菌引發(fā)植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性稱為ISR(ISR induced systemic resistance)現(xiàn)象。植物內(nèi)生細(xì)菌有助于植物適應(yīng)各種生態(tài)系統(tǒng)[4]。植物內(nèi)生細(xì)菌可長期穩(wěn)定地定殖于植物體，通過自身產(chǎn)生的拮抗物質(zhì)和酶類，與病原菌競爭營養(yǎng)物質(zhì)和生態(tài)位，滅活病菌萌發(fā)因子，降解毒素，誘導(dǎo)寄主植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性ISR及信號傳導(dǎo)來阻止病原菌的生長和入侵[5]。一般認(rèn)為ISR的抗性作用機(jī)制與病原體攻擊期間植物的超微結(jié)構(gòu)變化和細(xì)胞化學(xué)改變有關(guān)，包括組織木質(zhì)化增強(qiáng)，產(chǎn)生機(jī)械屏障和植保素，細(xì)胞壁增厚，改變宿主的生理和代謝反應(yīng)等。目前植物內(nèi)生細(xì)菌防治植物病害已得到廣泛應(yīng)用[6]。

筆者選用的蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)NJSZ-13菌株是南京林業(yè)大學(xué)松材線蟲病防治課題組從濕地松莖部分離得到的1株內(nèi)生細(xì)菌，前期研究結(jié)果表明NJSZ-13菌株對松材線蟲有較高殺線活性[1]，并且能夠在馬尾松根、莖等不同部位定殖[7]，本研究將進(jìn)一步探索該菌株能否誘導(dǎo)馬尾松抗松材線蟲病，為今后該菌株的研發(fā)和應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

馬尾松2年生幼苗，江蘇沂北園林苗木有限公司提供；蠟樣芽孢桿菌NJSZ-13菌株[1]和松材線蟲強(qiáng)毒蟲株AMA3[8]，均由南京林業(yè)大學(xué)森林病理實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌懸液的制備

用接種環(huán)在新鮮蠟樣芽孢桿菌NJSZ-13菌株菌落上取1環(huán)單菌落接入NB培養(yǎng)基中，置于28 ℃搖床上220 r/min震蕩培育48 h后獲得發(fā)酵液；然后將發(fā)酵液在10 000 r/min、4 ℃條件下離心10 min，將菌體沉淀用無菌水重懸制成菌懸液[9]。

1.2.2 滅活菌懸液的制備

以1.2.1同種方法制備菌懸液，再使用高壓滅菌鍋121 ℃滅菌20 min獲得滅活菌懸液。

1.2.3 松材線蟲的培養(yǎng)及接種

使用灰葡萄孢(Botrytiscinerea)對松材線蟲AMA3蟲株進(jìn)行培養(yǎng)，于25 ℃恒溫箱中培養(yǎng)7 d，再用貝爾曼漏斗法收集線蟲液，并將線蟲液濃度調(diào)至3 000條/mL。

選取長勢整齊的馬尾松幼苗6株進(jìn)行處理和12株為對照。灌根法施菌，施菌處理為處理Ⅰ[50 mL濃度為107CFU/mL(CFU/mL指的是每毫升樣品中含有的細(xì)菌菌落總數(shù))的菌懸液]、處理Ⅱ(50 mL滅活菌懸液)和CK(50 mL無菌水)。4 d后再進(jìn)行皮接法[10]接種松材線蟲處理，施菌的處理Ⅰ和處理Ⅱ分別接1 mL(3 000條/mL)線蟲接種液即為處理Ⅲ(處理Ⅰ+1 mL線蟲接種液)和處理Ⅳ(處理Ⅱ+1 mL線蟲接種液)，CK 1為水接1 mL無菌水(防止因刀切傷口過深導(dǎo)致幼苗死亡)，CK 2為水接1 mL線蟲接種液。

1.2.4 病情觀察與統(tǒng)計(jì)

接種松材線蟲后每7 d觀察1次馬尾松幼苗的發(fā)病情況直至CK 2全部死亡。參照談家金等[11]的方法進(jìn)行病情分級和病情指數(shù)的計(jì)算：

病情指數(shù)=∑(各病級株樹×病級代表值)×100/(總株樹×最高病級的代表值)；

防治效果=(對照病情指數(shù)-處理病情指數(shù))/對照病情指數(shù)×100%。

1.2.5 丙二醛含量與防御酶活性的測定

施菌前和施菌6、12、24、48和96 h后，分別取針葉做分析丙二醛(MDA)及防御酶的樣品，每處理3個(gè)重復(fù)，對照6個(gè)重復(fù)；接種松材線蟲前和接種1、7、14、21和28 d后，分別取針葉做分析防御酶的樣品，各設(shè)3個(gè)重復(fù)，重復(fù)間取樣部位基本保持一致。

粗酶液提取采用易龍等[12]的方法，丙二醛含量測定參照李合生[13]的方法；過氧化氫酶(CAT)活性測定參照王學(xué)奎等[14]的方法；過氧化物酶(POD)活性測定采用愈創(chuàng)木酚比色法[13]；超氧化物歧化酶(SOD)活性測定采用氮藍(lán)四唑還原法[13]；苯丙氨酸氧化酶(PAL)活性測定參照王學(xué)奎等[14]的方法；多酚氧化酶PPO活性測定參照雷東鋒等[15]的方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 NJSZ-13菌株誘導(dǎo)馬尾松抗松材線蟲病的防治效果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，處理Ⅲ和Ⅳ的馬尾松苗首次發(fā)病時(shí)間分別為接種線蟲后21和14 d，而CK 2馬尾松苗首次發(fā)病時(shí)間為接種后第7天，說明NJSZ-13推遲了松材線蟲病的發(fā)生時(shí)間。接種線蟲后 42 d，菌懸液處理Ⅲ的松苗發(fā)病較輕，部分松苗松針開始褪綠變黃，有的開始枯萎；滅活菌懸液處理Ⅳ的松苗發(fā)病較重，部分松苗松針褪綠變黃，有的開始枯萎，也有整株枯死的，松針變紅；而無菌水處理的CK 1生長性狀正常，接種線蟲的CK 2對照發(fā)病最重，全部松苗枯死，松針紅褐色(圖1)。由此可以看出，NJSZ-13菌株延緩了松材線蟲病的病情發(fā)展。菌懸液處理Ⅲ的防治效果為54%，滅活菌懸液處理Ⅳ的防治效果為33%(表1)。

表1 NJSZ-13菌株對松材線蟲病的防治效果

2.2 NJSZ-13菌株處理后馬尾松體內(nèi)MDA含量和CAT活性的變化

NJSZ-13菌株處理后，各處理和對照的馬尾松體內(nèi)丙二醛含量總體都呈先升后降的趨勢(圖2)。施菌后6 h，各處理和對照的MDA含量達(dá)到峰值，隨后MDA含量開始下降；施菌96 h后，處理和對照的MDA含量趨于相近。

從不同處理馬尾松體內(nèi)過氧化氫酶活性的變化情況可知，NJSZ-13處理后，在96 h內(nèi)馬尾松CAT 活性均低于對照(CK)，菌懸液處理Ⅰ和滅活菌懸液處理Ⅱ第48 h，馬尾松的CAT活性均最低，分別為53.29 U/g和46.35 U/g(圖2)，這一結(jié)果表明NJSZ-13對馬尾松體內(nèi)CAT有一定的抑制作用。

由接種松材線蟲后不同處理馬尾松體內(nèi)丙二醛含量的變化情況(圖3)可見：接種松材線蟲后，除CK 1接種后28 d的MDA含量恢復(fù)到接種前水平，其他所有處理和對照的MDA含量在不同時(shí)間均明顯增加(圖3)。菌懸液處理Ⅲ和滅活菌懸液處理Ⅳ的馬尾松體內(nèi)MDA含量的變化趨勢相同，隨時(shí)間先增加后減少，兩種處理MDA含量始終小于接蟲CK 2，并且菌懸液處理Ⅲ的馬尾松MDA含量始終小于滅活菌懸液處理Ⅳ。接蟲CK 2的馬尾松體內(nèi)MDA含量一直處于最高水平。菌懸液處理和滅活菌懸液處理能減少馬尾松體內(nèi)丙二醛的產(chǎn)生，可能是NJSZ-13菌株誘導(dǎo)馬尾松抗松材線蟲病的機(jī)制之一。

接種NJSZ-13菌株后再接種松材線蟲，處理Ⅲ、Ⅳ和接蟲CK 2馬尾松苗體內(nèi)CAT活性初期較高，后期持續(xù)降低，而接種CK 1馬尾松CAT活性一直保持最高水平。兩種接菌處理的變化趨勢相似，其中菌懸液處理Ⅲ的CAT活性始終高于滅活菌懸液處理Ⅳ。接種松材線蟲14 d后，兩種施菌處理的馬尾松體內(nèi)CAT活性開始高于接蟲(CK 2)處理(圖3)。

2.3 NJSZ-13菌株處理后馬尾松體內(nèi)POD和PAL活性變化

NJSZ-13菌株處理后，馬尾松體內(nèi)POD活性先升后降，其中前期菌懸液處理Ⅰ較滅活菌懸液處理Ⅱ的POD活性升高較快，后期兩種施菌處理的POD活性趨于與CK相近(圖4)。表明施菌前處理和CK的馬尾松POD活性差異不明顯，施菌后12 h，菌懸液處理Ⅰ和滅活菌懸液處理Ⅱ的馬尾松POD活性達(dá)到最高，分別為406.73和382.81 U/g，而此時(shí)CK的POD活性僅為212.48 U/g。

PAL是存在于高等植物中的一種不可缺少的防御酶。試驗(yàn)結(jié)果表明NJSZ-13能明顯提高馬尾松體內(nèi)PAL活性，并且菌懸液處理Ⅰ和滅活菌懸液處理Ⅱ兩者無明顯差異(圖4)。施菌后，處理和對照的PAL活性均呈先升后降的趨勢，施菌處理的PAL活性增加更快。施菌后12 h，菌懸液處理Ⅰ和滅活菌懸液處理Ⅱ的馬尾松針葉中PAL活性達(dá)到峰值，分別為175.64和182.81 U/g。而對照的PAL活性峰值出現(xiàn)在施菌后24 h，為161.07 U/g。

施菌后再接種松材線蟲，馬尾松POD活性變化較大(圖5)，處理和對照均呈現(xiàn)先升后降的趨勢，但兩種施菌處理的POD活性始終比未施菌接蟲對照高，其中菌懸液處理Ⅲ總體上比滅活菌懸液處理Ⅳ的POD活性高，且兩者差異在接種后前期表現(xiàn)明顯。接種松材線蟲后7 d，菌懸液處理Ⅲ的POD活性達(dá)到最高，為777.41 U/g，而滅活菌懸液處理Ⅳ和接蟲CK2的POD活性已開始下降，分別降為681.24和473.93 U/g，此時(shí)，無菌水CK1的POD活性已超過接蟲對照，達(dá)到組內(nèi)最高水平，為543.97 U/g。

僅接種松材線蟲CK2的馬尾松PAL活性先升后降，病害后期降至CK以下水平。接蟲前通過施菌處理，接蟲后的馬尾松PAL活性增加幅度較大，其中菌懸液處理Ⅲ較滅活菌懸液處理Ⅳ增加尤為明顯(圖5)。所有接蟲株的PAL活性總體上呈現(xiàn)先升后降的趨勢，而接無菌水CK2的活性相對穩(wěn)定。接種松材線蟲后7 d，菌懸液處理Ⅲ和接蟲CK2的PAL活性達(dá)到峰值，分別為387.41和273.93 U/g，而滅活菌懸液處理Ⅳ于接蟲后14 d的PAL活性達(dá)到峰值，為314.07 U/g。由此可見，NJSZ-13對馬尾松體內(nèi)PAL活性有明顯的誘導(dǎo)作用。

2.4 NJSZ-13菌株處理后馬尾松體內(nèi)SOD和PPO活性變化

馬尾松體內(nèi)SOD活性在NJSZ-13菌株處理后，處理和對照的SOD活性含量均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，其中施菌處理的SOD活性升高更快，并且菌懸液處理Ⅰ和滅活菌懸液處理Ⅱ兩者間無顯著差異。施菌后12 h，滅活菌懸液處理Ⅱ的SOD活性達(dá)到峰值，為781.48 U/g，菌懸液處理Ⅰ和CK的SOD活性在施菌后24 h達(dá)到峰值，分別為772.76和702.08 U/g。

研究結(jié)果顯示接種NJSZ-13能提高馬尾松PPO活性，其中總體上菌懸液處理Ⅰ較滅活菌懸液處理Ⅱ的效果好。菌懸液處理Ⅰ和滅活菌懸液處理Ⅱ的馬尾松在施菌96 h內(nèi)出現(xiàn)了2個(gè)峰值，而對照CK的PPO活性波動也較大(圖6)。

但僅接種松材線蟲的馬尾松SOD活性稍增加后，便急劇下降(圖7)。接蟲前通過施菌處理，接蟲后的馬尾松SOD活性增加幅度較大，呈現(xiàn)先升后降的趨勢，其中菌懸液處理Ⅲ較滅活菌懸液處理Ⅳ增加尤為明顯。而接無菌水對照CK1的SOD活性相對穩(wěn)定。接種松材線蟲后14 d，所有接蟲株的SOD活性均達(dá)到峰值，菌懸液處理Ⅲ和滅活菌懸液處理Ⅳ的SOD活性分別為1 093.46和892.24 U/g，此時(shí)接蟲CK2僅769.62 U/g，由此可見，菌株NJSZ-13對馬尾松體內(nèi)SOD活性有明顯的誘導(dǎo)作用。

所有接種松材線蟲的馬尾松PPO活性均為先升后降，而接無菌水對照(CK)馬尾松PPO活性相對穩(wěn)定。僅接種線蟲的馬尾松CK2 PPO活性于病害后期降至對照以下水平。兩個(gè)施菌處理Ⅲ的PPO活性均增加，其中通過菌懸液處理Ⅲ的PPO活性后期增加幅度明顯，而滅活菌懸液處理Ⅳ的PPO活性變化趨勢和接蟲對照相近(圖7)。接種松材線蟲后1d，滅活菌懸液處理Ⅳ和接蟲對照CK2的PPO活性達(dá)到峰值，分別為285.73和216.13 U/g，而菌懸液處理(Ⅲ)于接蟲后7 d的平均PPO活性達(dá)到峰值。由此可見，菌株NJSZ-13對馬尾松體內(nèi)PPO活性有誘導(dǎo)作用。

3 討 論

前期研究表明，蠟樣芽孢桿菌NJSZ-13菌株對松材線蟲有殺線活性[1]，即該菌株本身就對線蟲有毒殺和抑制作用。為了進(jìn)一步證明該菌株是否對馬尾松具有誘導(dǎo)抗病的作用，對菌懸液進(jìn)行滅活處理，以排除細(xì)菌自身進(jìn)入樹體內(nèi)對線蟲的殺線作用。結(jié)果顯示，施用滅活的菌懸液后，馬尾松發(fā)病速度也有減緩，從而表明該菌具有誘導(dǎo)馬尾松抗病因子。Romeiro等[16]證明蠟樣芽孢桿菌UFV-101菌株的發(fā)酵上清液產(chǎn)生的蛋白類物質(zhì)能誘導(dǎo)番茄葉片對黃瓜褐斑病(Corynesporacassiicola)的抗性，本研究中發(fā)現(xiàn)不管是菌懸液還是滅活的菌懸液，對松材線蟲病都具有一定的防治效果，說明本試驗(yàn)中菌株NJSZ-13誘抗因子是非蛋白類物質(zhì)。而菌懸液的防病效果要好于滅活的菌懸液，可能是由于菌懸液里的菌種在馬尾松根部定殖，起到直接抑制和長期誘導(dǎo)相結(jié)合的作用，但滅活的菌懸液只能起到短期的誘導(dǎo)作用。說明NJSZ-13可能既能通過其生理活性定殖馬尾松體內(nèi)直接抑制松材線蟲的生長，同時(shí)又能誘導(dǎo)馬尾松防御反應(yīng)來抵抗松材線蟲的侵染。

MDA含量常常可反映植物體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度和細(xì)胞損傷的程度，是植物衰老和抗性生理中常用的指標(biāo)。試驗(yàn)表明接種NJSZ-13菌株能明顯降低接蟲馬尾松體內(nèi)MDA含量。CAT活性的高低影響到植物體內(nèi)H2O2的積累水平。H2O2有雙重作用，少量的H2O2能激活病程相關(guān)蛋白的表達(dá)，過多又會對植物細(xì)胞造成傷害。隋麗等[17]研究發(fā)現(xiàn)，放線菌769的發(fā)酵液能夠抑制水稻過氧化氫酶活性，對水稻具有誘導(dǎo)抗性。本試驗(yàn)中，施菌處理后馬尾松體內(nèi)CAT活性明顯低于無菌水對照，而接蟲后期又高于接蟲對照，說明菌株NJSZ-13于接蟲前期可誘導(dǎo)馬尾松產(chǎn)生抗性。

POD可以催化酚類物質(zhì)的氧化，并參與木質(zhì)素(木質(zhì)素具有限制病原菌正常進(jìn)出細(xì)胞，抑制病原菌的生長等作用)的合成，還參與乙烯的生物合成和氧自由基的消除反應(yīng)。SOD可以調(diào)節(jié)植物體氧化與抗氧化關(guān)系，使它們達(dá)到動態(tài)平衡，能保護(hù)細(xì)胞免受超氧陰離子自由基對細(xì)胞的損傷。PAL能催化苯丙氨酸的脫氨反應(yīng)，是苯丙烷代謝的關(guān)鍵酶，其活性與植物抗病性呈正相關(guān)，是抗病性的一個(gè)生化指標(biāo)。PPO不僅能催化木質(zhì)素的合成，構(gòu)成保護(hù)細(xì)胞的機(jī)械屏障，還能氧化合成對病原菌有毒的醌類物質(zhì)，抑制病原菌的生長和入侵。經(jīng)NJSZ-13菌株菌懸液和滅活菌懸液處理后，馬尾松體內(nèi)的這4種酶活性均表現(xiàn)出明顯的增加，接種松材線蟲后也始終比對照高，說明NJSZ-13菌株能誘導(dǎo)馬尾松抗松材線蟲病。