假儉草EoNLA基因克隆與其轉(zhuǎn)基因擬南芥在不同磷水平下的表型鑒定

何青青，劉傳強(qiáng)，李建建，王晶晶，姚 祥，周圣浩，陳 英*，王浩然*

(1. 南京林業(yè)大學(xué)楊樹種質(zhì)創(chuàng)新與品種改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210037；2. 江蘇省中國科學(xué)院植物研究所，江蘇 南京 210014；3. 江蘇省泰興市農(nóng)村能源技術(shù)開發(fā)服務(wù)站，江蘇 泰興 225400)

假儉草(Eremochloaophiuroides)植株低矮、抗逆性強(qiáng)，是蜈蚣草屬中唯一可用作草坪草的一個(gè)種[1]，也是世界公認(rèn)起源于中國的最好的暖季型草坪草，有“中國草坪草”的美譽(yù)[2]。假儉草可粗放管理，是建植各類綠地草坪及高速公路邊坡草坪、堤壩護(hù)埂、固土護(hù)坡、綠化建設(shè)、治理水土流失的理想材料[3]。其廣泛分布于我國長江流域及其以南地區(qū)[4]，是我國南方酸土區(qū)的一些極度缺磷貧瘠的強(qiáng)酸性土壤上重要的優(yōu)勢種及建群種。磷元素作為植物必需的大量營養(yǎng)元素，是植物細(xì)胞內(nèi)核酸和細(xì)胞膜脂質(zhì)的結(jié)構(gòu)組成部分，參與植物體內(nèi)各種代謝過程，在植物的生長發(fā)育中發(fā)揮著重要作用[5]。雖然在包括磷匱乏的酸性土壤在內(nèi)的大多數(shù)類型土壤中，磷元素的實(shí)際總含量水平不低；但是由于土壤中的磷素流動(dòng)性低且易被鋁固定為非有效態(tài)磷，往往造成實(shí)際能夠被植物吸收利用的有效磷含量偏低，因而磷素是最難以被植物吸收利用的營養(yǎng)元素之一，成為限制植物生長發(fā)育的重要因素[6-8]。因此，探索假儉草這類天然適應(yīng)低磷土壤條件植物的磷素調(diào)控相關(guān)分子機(jī)制，對磷高效定向育種具有重要的指導(dǎo)意義。

植物對磷的吸收和利用均依賴于磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(phosphate transporters，PTs)[9-10]。以往的研究表明，一系列具有磷轉(zhuǎn)運(yùn)活性的蛋白參與了植物根系對磷素的吸收以及磷素在細(xì)胞器、細(xì)胞或組織器官間的運(yùn)輸分配。有多種機(jī)制調(diào)控這些磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其中泛素化是在蛋白水平上調(diào)控磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的重要過程[9]。泛素化是一種主要由泛素介導(dǎo)的蛋白降解機(jī)制，參與許多細(xì)胞事件的調(diào)控，如信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)等[11-12]。其中，可以特異性識(shí)別靶蛋白的泛素連接酶(E3)則是泛素化途徑中最關(guān)鍵的一類酶。NLA(nitrogen limitation adaptation)蛋白作為一種RING型E3泛素連接酶參與關(guān)鍵蛋白的泛素化，在調(diào)節(jié)植物磷素平衡方面起著至關(guān)重要的作用[9,13]。NLA分別位于質(zhì)膜和細(xì)胞核兩個(gè)不同的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中，包含4個(gè)不同的域：①RING域，介導(dǎo)質(zhì)膜上磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的降解；②SPX域，促進(jìn)NLA與磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的相互作用；③位于RING和SPX域之間的鏈接器域；④C末端結(jié)構(gòu)域，與接頭區(qū)域一樣，其功能未知[12]。有研究表明，NLA編碼蛋白質(zhì)的N末端SPX結(jié)構(gòu)域，可調(diào)節(jié)酵母中磷的感應(yīng)和攝取[14-16]。根據(jù)對模式植物擬南芥的研究，NLA蛋白是RING-HCa-Type E3泛素連接酶家族的成員[17]，其SPX域在磷酸鹽依賴性途徑中介導(dǎo)蛋白質(zhì)間相互作用[18-20]，控制PHT1家族的磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白泛素化降解過程[21]。 因此，NLA被認(rèn)為是植物磷素穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。此外，最近的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，NLA還介導(dǎo)了質(zhì)膜定位硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白NRT1.7的轉(zhuǎn)換[22]，表明NLA在調(diào)節(jié)植物中氮和磷酸鹽含量方面具有更加廣泛的作用。

本研究以假儉草為研究材料，通過RACE方法克隆獲得了一個(gè)假儉草NLA泛素連接酶的基因，命名為EoNLA。通過生物信息學(xué)分析確定該基因的全長序列及編碼氨基酸序列，利用原生質(zhì)體瞬時(shí)表達(dá)體系確定其膜定位，采用qRT-PCR方法分析該基因在低磷誘導(dǎo)下的表達(dá)模式，并轉(zhuǎn)化擬南芥進(jìn)行基因功能鑒定。通過研究假儉草EoNLA的磷高效轉(zhuǎn)運(yùn)分子機(jī)制，為草坪草適應(yīng)酸性土壤生境的磷高效轉(zhuǎn)運(yùn)分子育種和栽培調(diào)控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

基因克隆和表達(dá)分析所用材料為假儉草(E.ophiuroides)的酸土抗性品系E041，采集自江蘇省中國科學(xué)院植物研究所草坪草種質(zhì)資源苗圃。轉(zhuǎn)基因和原生質(zhì)體分離轉(zhuǎn)化所用材料為擬南芥(Arabidopsisthaliana)Col-0盆栽苗，生長條件為：溫度23 ℃，16 h光照、8 h黑暗環(huán)境。

大腸桿菌(Escheriachiacoli)菌株Top10、農(nóng)桿菌(Agrobacterium)菌株EHA105購自天根(北京)公司 (Tiangen Biotech, Beijing, China)；pMD19-T載體購自寶生物工程(大連)有限公司(TaKaRa, Dalian, China)；植物過量表達(dá)載體pBI121-3HA以及原生質(zhì)體瞬時(shí)表達(dá)載體p2GWF7.0由南京林業(yè)大學(xué)楊樹種質(zhì)創(chuàng)新與品種改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 假儉草EoNLA基因克隆

采用RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒(Tiangen)提取假儉草總RNA。根據(jù)假儉草轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)(未公開)篩選獲得EoNLA基因參照序列。選用大連寶生物公司的SMART RACE試劑盒進(jìn)行基因全長克隆，所涉及的3′RACE和5′RACE引物見表1。擴(kuò)增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳分析，將大小正確的條帶切下，利用天根公司的DNA凝膠回收試劑盒回收純化，連接pMD19-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10，挑取陽性克隆委托測序公司(安徽通用生物)進(jìn)行測序。

將所獲得的3′和5′片段進(jìn)行比對與拼接，獲得EoNLA基因的全長cDNA序列。通過NCBI ORF Finder 在線程序查找序列的開放閱讀框(ORF)，設(shè)計(jì)EoNLA基因ORF片段的特異性引物(表1)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增并測序驗(yàn)證。

表1 假儉草EoNLA基因克隆及qRT-PCR引物

1.2.2EoNLA基因序列分析

利用NCBI數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)的 Blast P 進(jìn)行比對檢索，下載其他植物中EoNLA同源基因的氨基酸序列，使用 Clustal X 多序列比對軟件，進(jìn)行氨基酸序列的多重比對，預(yù)測其保守結(jié)構(gòu)域。利用 MEGA軟件對EoNLA及其同源蛋白構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。利用 SMART 工具(http: //smart.embl-heidelberg.de/)預(yù)測假儉草EoNLA蛋白的功能結(jié)構(gòu)域。ProtParam 在線工具(https://web.expasy.org/protparam/)預(yù)測分子量、等電點(diǎn)、不穩(wěn)定系數(shù)。在線網(wǎng)站ProtScale(https://web.expasy.org/protsca/)預(yù)測蛋白質(zhì)親疏水性，蛋白的信號(hào)肽預(yù)測用SignalP 4.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.1/)分析，磷酸化位點(diǎn)預(yù)測采用NetPhos (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)分析，蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測用TMHMM 2.0分析。SOPMA (https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)進(jìn)行蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測。在線工具SWISS MODEL(https://www.swissmodel.expasy.org/)預(yù)測EoPHR2蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.2.3 EoNLA蛋白的亞細(xì)胞定位

采用Gateway技術(shù)(Invitrogen)將EoNLA基因的ORF序列構(gòu)建至植物瞬時(shí)表達(dá)載體p2GWF 7.0上，重組為EoNLA::GFP融合基因。采用植物原生質(zhì)體制備及轉(zhuǎn)化試劑盒(中科瑞泰)，進(jìn)行擬南芥原生質(zhì)體的分離和瞬時(shí)轉(zhuǎn)化。以Pro35S::GFP為正對照，在450～490 nm藍(lán)光波長熒光顯微鏡下觀測各樣品中GFP綠色熒光表達(dá)部位。

1.2.4EoNLA基因的表達(dá)分析

基于假儉草水培體系[23]培養(yǎng)假儉草水培材料3周至最佳生長狀態(tài)后，對假儉草材料的根、莖、葉組織分別采樣(3個(gè)生物學(xué)重復(fù))，鮮樣采集清洗后立即用液氮速凍并提取RNA，用于基因的表達(dá)分析。使用FastStart Universal SYBR Green Master Mix (Roche) 熒光定量試劑及ABI ViiA7熒光定量PCR儀(ABI)進(jìn)行qRT-PCR實(shí)驗(yàn)，采用相對定量法[24]進(jìn)行分析，管家基因Actin作為內(nèi)參基因，該實(shí)驗(yàn)技術(shù)重復(fù)3次。相關(guān)引物見表1。

1.2.5EoNLA轉(zhuǎn)基因擬南芥表型鑒定

采用Gateway技術(shù)(Invitrogens)將EoNLA基因的ORF序列構(gòu)建至植物過量表達(dá)載體pBI121-3HA，質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的擬南芥花序浸潤法轉(zhuǎn)化擬南芥，篩選獲得轉(zhuǎn)基因T3代純合體，并對轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行功能檢測。

栽培基質(zhì)為泥炭、蛭石與珍珠巖體積比為1∶1∶1的混合基質(zhì)，預(yù)拌入1/10的大比例稀釋MS營養(yǎng)液作為基肥。種子萌發(fā)后生長至4片葉狀態(tài)的擬南芥野生型/ 轉(zhuǎn)基因幼苗移栽入內(nèi)，采用無營養(yǎng)的清水灌溉，繼續(xù)培養(yǎng)3周后，觀察盆栽苗的生長表型。

無菌種子苗培養(yǎng)及處理方式：采用MS固體培養(yǎng)基(pH 5.8，添加蔗糖20 g/L、瓊脂9 g/L)作為基礎(chǔ)，通過調(diào)整KH2PO4(P)母液的添加量控制磷元素濃度(同時(shí)，相應(yīng)添加KCl母液補(bǔ)足鉀元素至標(biāo)準(zhǔn)水平)模擬脅迫處理?xiàng)l件，分別為0 mmol/L P(無磷)、0.062 5 mmol/L P(低磷)、0.625 0 mmol/L P(半磷)和1.250 0 mmol/L P(全磷)。野生型及轉(zhuǎn)基因純合體，兩個(gè)株系的擬南芥種子，消毒播種于培養(yǎng)基平板培養(yǎng)3周后，對表型進(jìn)行觀測。采用儀器掃描植株生長表型(WinRHIZO Pro 2017系統(tǒng))。各處理?xiàng)l件下的野生型及轉(zhuǎn)基因株系，分別取25株苗稱量全株鮮質(zhì)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 假儉草EoNLA基因克隆及序列分析

根據(jù)假儉草轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)(未公開)篩選獲得的EoNLA基因參照序列設(shè)計(jì)引物，并采用RACE技術(shù)(rapid amplification of cDNA ends)克隆獲得假儉草EoNLA基因的全長cDNA序列。測序分析結(jié)果表明EoNLA基因全長為1 353 bp，含有217 bp的5′UTR和143 bp的3′UTR以及993 bp的開放閱讀框(ORF)，共編碼331個(gè)氨基酸(圖1)。

圖1 EoNLA基因cDNA全長及相應(yīng)氨基酸序列

利用ProtParam軟件對EoNLA基因編碼蛋白的理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果顯示：EoNLA編碼蛋白的分子質(zhì)量為37 416.54 u，理論等電點(diǎn)為8.88，該蛋白的氨基酸組分為Leu (34 個(gè)，占比10.3%)、Ser (32個(gè)，9.7%)、Lys (30個(gè)，9.1%)，以及組分占比低于9% 的其他氨基酸，不含 Pyl、Sec；該蛋白中帶負(fù)電荷的堿基數(shù)為36 (Asp + Glu)，帶正電荷的堿基數(shù)為48 (Arg + Lys)；不穩(wěn)定系數(shù)58.89，推測該片段屬于不穩(wěn)定型蛋白；脂溶系數(shù)76.61，總平均親水性為-0.265。利用ExPASY ProtScale進(jìn)一步預(yù)測EoNLA蛋白氨基酸序列的親疏水性，結(jié)果顯示親水性氨基酸數(shù)量大于疏水性氨基酸數(shù)量，這表明EoNLA蛋白可能為親水性蛋白。

SMART預(yù)測蛋白結(jié)構(gòu)域顯示，EoNLA 蛋白具有典型的RING結(jié)構(gòu)域和SPX結(jié)構(gòu)域(圖2A)。SOPMA預(yù)測蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)結(jié)果顯示，EoNLA編碼的蛋白含有α-螺旋(alpha helix)、延伸鏈(extended strand)、隨機(jī)卷曲(random coil)和β-轉(zhuǎn)角(beta turn)等結(jié)構(gòu)，其中α-螺旋所占比例最高為54.55%，隨機(jī)卷曲所占比例為33.03%，延伸鏈所占比例是9.09%，β轉(zhuǎn)角占比為3.33%(圖2B)。利用SWISS MODEL進(jìn)一步構(gòu)建EoNLA蛋白的三維模型，預(yù)測的三維結(jié)構(gòu)與其二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果相符為探尋EoNLA在不同植物種間的同源性及系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，將假儉草EoNLA基因編碼氨基酸序列提交到NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源比對，結(jié)果(圖3)顯示，其與高粱(Sorghumbicolor)、哈氏黍(Panicumhallii)、狗尾草(Setariaitalica)、日本水稻(OryzasativaJaponica group)、野生水稻(Oryzabrachyantha)、疣粒野稻(Oryzameyerianavar.)、二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon)、大麥(Hordeumvulgare)、山羊草(Aegilopstauschiisubsp.)、硬粒小麥(Triticumturgidumsubsp.)等植物種具有較高的同源性，多重序列比對結(jié)果顯示EoNLA基因編碼蛋白序列的保守性較強(qiáng)，各植物種的NLA同源蛋白在氨基酸序列C端的226～274區(qū)域均具有保守的RING結(jié)構(gòu)域(圖3)。根據(jù)EoNLA基因的氨基酸序列，利用MEGA 6.0軟件構(gòu)建其與其他植物種同源基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹(N-J鄰接法)，結(jié)果顯示其在不同植物種間具有一定的保守性，其中，假儉草與高粱、哈氏黍、狗尾草構(gòu)成一個(gè)高支持分支(99%)；假儉草與高粱擁有最近的遺傳距離，其親緣關(guān)系最近；同為稻屬的日本水稻、野生水稻、疣粒野稻在同一進(jìn)化分支，而禾本科的二穗短柄草、大麥、山羊草和硬粒小麥則在另一分支(圖4)。

圖2 EoNLA氨基酸序列分析

紅框標(biāo)識(shí)為RING結(jié)構(gòu)域。The red box represents the RING domain.

圖4 EoNLA的系統(tǒng)進(jìn)化樹

(圖2C)。此外，NetPhos的預(yù)測結(jié)果表明，EoNLA編碼蛋白含有27個(gè)磷酸化位點(diǎn)[結(jié)果分值(score)>0.5]，包含4 個(gè)酪氨酸位點(diǎn)、18 個(gè)絲氨酸位點(diǎn)、5 個(gè)蘇氨酸位點(diǎn)(圖2D)。

2.2 EoNLA的亞細(xì)胞定位及組織表達(dá)特異性分析

研究基因表達(dá)蛋白的亞細(xì)胞定位，可以幫助了解該基因在細(xì)胞中發(fā)揮作用的位置，從而為鑒定其生物學(xué)功能提供參考。通過SignalP 4.1預(yù)測分析EoNLA蛋白的氨基酸序列，結(jié)果顯示EoNLA蛋白的分值(S-score)平均值為0.001 4，S-score平均值低于0.5表明該蛋白為非分泌型蛋白，因而應(yīng)當(dāng)進(jìn)一步通過實(shí)驗(yàn)檢測分析EoNLA蛋白的亞細(xì)胞定位。分離擬南芥原生質(zhì)體，通過PEG介導(dǎo)將構(gòu)建的EoPHR2-GFP融合載體導(dǎo)入原生質(zhì)體中，使該基因下游的綠色熒光蛋白GFP得到表達(dá)，觀察熒光表達(dá)部位即可確定該基因在細(xì)胞中發(fā)揮生物學(xué)功能的位置。顯微鏡下觀測顯示：原生質(zhì)體細(xì)胞具有完整、規(guī)則的細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞內(nèi)葉綠體自發(fā)熒光清晰，表明細(xì)胞狀態(tài)正常；在488 nm激發(fā)光下，EoNLA-GFP融合蛋白的綠色熒光主要聚集在細(xì)胞膜；同時(shí)，在僅含GFP的對照中綠色熒光信號(hào)則沒有明確的細(xì)胞定位，綠色熒光在全細(xì)胞范圍彌散(圖5)。由此判斷EoNLA蛋白定位于細(xì)胞膜，這與其結(jié)合細(xì)胞膜上的磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白進(jìn)行泛素化的功能定位相符合。

圖5 EoNLA蛋白在原生質(zhì)體中的定位

通過分析基因表達(dá)的組織特異性，可以了解該基因在植物體中發(fā)揮作用的器官組織定位，是預(yù)測鑒定基因生物學(xué)功能的重要參考。利用實(shí)時(shí)熒光定量技術(shù)(qRT-PCR)對EoNLA基因在假儉草不同器官組織間的表達(dá)模式進(jìn)行比較分析，結(jié)果顯示EoNLA基因在根組織的表達(dá)量顯著高于莖和葉，該基因具有根組織表達(dá)特異性(圖6)。

**.P<0.01.

由此可以推斷，EoNLA主要在根系組織發(fā)揮功能，該結(jié)果與以往在模式物種的相關(guān)研究報(bào)道相符。

2.3 EoNLA基因的轉(zhuǎn)基因功能鑒定

為進(jìn)一步分析基因功能，構(gòu)建EoNLA基因的植物過量表達(dá)載體、轉(zhuǎn)化擬南芥、迭代篩選并鑒定，獲得T3代純合體轉(zhuǎn)基因株系，命名為EoNLA-OV(圖7A)。在無營養(yǎng)的清水灌溉基質(zhì)盆栽條件下，轉(zhuǎn)基因擬南芥生長表型均劣于野生型(圖7B)，推測是EoNLA基因的過量表達(dá)負(fù)調(diào)控磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，從而抑制了植株對磷營養(yǎng)的吸收利用。

A.轉(zhuǎn)基因植株鑒定identification of transgenic plants；B.園土基質(zhì)盆栽植株表型phenotype of potted plants in garden soil matrix；C.不同磷濃度梯度處理下的植株表型plant phenotype under different phosphorus concentration gradient；D.低磷條件下的植株根表型plant roots phenotype under low phosphorus condition；E.不同磷濃度梯度處理下的植株鮮質(zhì)量(25株)fresh weight of plants under different phosphorus concentration gradients (25 plants). *.P<0.05;***. P<0.001;****.P<0.000 1.

將野生型(WT)和轉(zhuǎn)基因(EoNLA-OV)擬南芥分別播種于0 mmol/L P(無磷)、0.062 5 mmol/L P(低磷)、0.625 0 mmol/L P(半磷)和1.250 0 mmol/L P(全磷)4個(gè)磷濃度梯度條件下萌發(fā)培養(yǎng)3周后，觀察其生長表型，并稱量植株鮮質(zhì)量，結(jié)果顯示：在0 mmol/L P的無磷條件下，野生型及轉(zhuǎn)基因擬南芥均表現(xiàn)出明顯的生長抑制表型(圖7C)；在0.062 5 mmol/L P的磷匱乏條件下，轉(zhuǎn)基因株系相對于野生型呈現(xiàn)出更加明顯的生長抑制表型，其根系發(fā)育表型明顯弱于野生型對照(圖7C、7D)；在0.625 0 mmol/L P的半磷濃度條件下，野生型擬南芥相較于轉(zhuǎn)基因植株呈現(xiàn)出較明顯的總體生長優(yōu)勢，野生型植株鮮質(zhì)量明顯高于轉(zhuǎn)基因植株(圖7C、7E)；在1.250 0 mmol/L P的全磷濃度條件下，轉(zhuǎn)基因擬南芥相較于野生型植株，生長表型及植株鮮質(zhì)量則表現(xiàn)出明顯的差異(圖7C、7E)。此外，對野生型及轉(zhuǎn)基因植株在不同磷濃度梯度下的植株鮮質(zhì)量增量分別進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)：野生型擬南芥的鮮質(zhì)量數(shù)據(jù)在半磷濃度條件(0.625 0 mmol/L P)已經(jīng)達(dá)到峰值，與全磷濃度(1.250 0 mmol/L P)條件的鮮質(zhì)量數(shù)據(jù)基本一致；而過量表達(dá)EoNLA的轉(zhuǎn)基因擬南芥鮮質(zhì)量數(shù)據(jù)則隨著半磷及全磷濃度條件的變化而呈現(xiàn)出遞增趨勢，直至全磷濃度條件下的鮮質(zhì)量數(shù)據(jù)接近于野生型(圖7E)。

3 討 論

磷是植物生長發(fā)育必不可少的營養(yǎng)元素，但土壤酸化使其有效性低，成為最難被植物吸收利用的營養(yǎng)元素之一。早在2000年前后，我國的酸性土壤地區(qū)面積已經(jīng)占全國陸地總面積的22.7%，遍及南方14個(gè)省份[25]，而隨著土壤酸化進(jìn)程逐漸加速，酸性土壤區(qū)面積也呈現(xiàn)逐年遞增趨勢。土壤酸化后衍生的有效磷匱乏問題，則是酸土地區(qū)限制植物生長發(fā)育的主要營養(yǎng)因素[5,26]。假儉草作為我國南方地區(qū)的鄉(xiāng)土植物，廣泛分布于我國南方酸土區(qū)等低磷土壤條件地區(qū)，在極度缺磷貧瘠的強(qiáng)酸性土壤上更是重要的建群種。探索假儉草這類天然適應(yīng)低磷土壤條件植物的低磷脅迫響應(yīng)分子機(jī)制，進(jìn)而指導(dǎo)培育適應(yīng)低磷土壤條件的磷高轉(zhuǎn)運(yùn)植物品種，對緩解磷肥需求壓力、提高貧瘠土地利用率以及改善貧瘠地區(qū)生態(tài)都具有重要意義。本研究首次從假儉草中克隆獲得了一個(gè)磷調(diào)控相關(guān)基因，鑒定為AtNLA/OsNLA基因的直系同源基因，命名為EoNLA。

氮限制適應(yīng)蛋白(NLA)是一種E3泛素連接酶，在氮及磷穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)中起重要作用。NLA會(huì)以不同的方式調(diào)節(jié)植物體的磷素動(dòng)態(tài)平衡，其中包括轉(zhuǎn)錄后和翻譯后水平的調(diào)控，以及通過蛋白質(zhì)中相關(guān)的功能結(jié)構(gòu)域[27-28]?；谀Ｊ街参飻M南芥的研究發(fā)現(xiàn)，在磷營養(yǎng)供應(yīng)充足的情況下，NLA通過其N端SPX結(jié)構(gòu)域和C端RING結(jié)構(gòu)域促進(jìn)質(zhì)膜上磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的降解[27]；當(dāng)磷營養(yǎng)受到限制時(shí)，NLA則受到microRNAs的調(diào)控抑制，從而減輕對質(zhì)膜上的磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的負(fù)調(diào)節(jié)[22, 27-28]。然而，對單子葉植物模式植物水稻的研究則發(fā)現(xiàn)，OsNLA1基因并非 miR827(磷饑餓誘導(dǎo)microRNA)的靶基因，而是通過其他通路誘導(dǎo)水稻OsPHT1 磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族若干成員(OsPT1/2/4/7/8/12)的降解來調(diào)控水稻對磷的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)[29]?；谝酝煌Ｊ街参镏袑LA基因的研究報(bào)道顯示，該基因在植物的磷響應(yīng)調(diào)控通路上發(fā)揮重要作用。假儉草作為缺磷貧瘠的酸性土壤上的優(yōu)勢植物，研究其磷營養(yǎng)相關(guān)的調(diào)控通路及機(jī)制，對于了解這類酸土植物的逆境適應(yīng)機(jī)制具有重要意義。目前，有關(guān)假儉草NLA基因的研究還未見報(bào)道。本研究通過RACE方法從假儉草中克隆獲得了EoNLA基因的完整全長序列，并對其功能進(jìn)行了初步的鑒定。分析EoNLA的亞細(xì)胞定位及組織表達(dá)特異性，可以了解該基因在細(xì)胞以及器官組織中的功能位置，是鑒定基因生物學(xué)功能的重要參考?；谠|(zhì)體瞬時(shí)表達(dá)體系的亞細(xì)胞定位觀測顯示，EoNLA蛋白定位于細(xì)胞膜，這與相關(guān)研究報(bào)道中NLA結(jié)合細(xì)胞膜上的磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白進(jìn)行泛素化的功能定位相符合；進(jìn)一步利用實(shí)時(shí)熒光定量技術(shù)(qRT-PCR)的基因表達(dá)組織特異性分析顯示EoNLA基因具有根組織表達(dá)特異性，EoNLA的功能主要定位于根系組織，該結(jié)果與以往在模式植物的相關(guān)研究報(bào)道相符[27]。

本研究利用EoNLA基因過量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因擬南芥株系鑒定基因功能。根據(jù)前人的研究結(jié)果[27]，NLA在磷營養(yǎng)充分的條件下介導(dǎo)磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的泛素化降解、限制磷素的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)，在低磷條件下NLA則受到microRNAs的負(fù)調(diào)控抑制、釋放磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的功能，進(jìn)而調(diào)節(jié)植物體的磷素平衡。由此可以推測，過量表達(dá)NLA會(huì)提高植株對低磷脅迫的敏感性，進(jìn)而抑制轉(zhuǎn)基因植株在低磷條件下的生長表型。本研究的結(jié)果與該理論推測相符合，即在0.062 5 mmol/L P的磷匱乏條件以及0.625 0 mmol/L P的半磷濃度條件下，野生型擬南芥相較于EoNLA過表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株呈現(xiàn)出生長優(yōu)勢；而在1.250 0 mmol/L P的全磷濃度條件下，不存在低磷脅迫壓力，轉(zhuǎn)基因擬南芥與野生型植株的生長表型沒有表現(xiàn)出明顯的差異。但值得注意的是，轉(zhuǎn)基因植株對不同程度的低磷脅迫所呈現(xiàn)的表型不完全相同，在脅迫程度較嚴(yán)重的磷匱乏(0.062 5 mmol/L P)條件下，轉(zhuǎn)基因株系在種子苗生長初期的根系生長發(fā)育表型明顯弱于野生型對照；而在脅迫程度較輕的半磷(0.625 0 mmol/L P)條件下，野生型擬南芥相較于轉(zhuǎn)基因植株則主要是在鮮質(zhì)量方面體現(xiàn)了總體生長優(yōu)勢，而根系形態(tài)則未表現(xiàn)出較明顯的差異。此外，對野生型及轉(zhuǎn)基因植株在不同磷濃度梯度下的植株鮮質(zhì)量增量分別進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，野生型擬南芥的鮮質(zhì)量數(shù)據(jù)在半磷濃度條件(0.625 0 mmol/L P)已經(jīng)達(dá)到峰值，與全磷濃度條件(1.250 0 mmol/L P)的鮮質(zhì)量數(shù)據(jù)基本一致；而過量表達(dá)EoNLA的轉(zhuǎn)基因擬南芥鮮質(zhì)量數(shù)據(jù)則隨著半磷及全磷濃度條件的變化而呈現(xiàn)出遞增趨勢，直至全磷濃度條件下的鮮質(zhì)量數(shù)據(jù)接近于野生型，由此也可表明，過量表達(dá)EoNLA提高了轉(zhuǎn)基因植株對低磷脅迫的敏感度。鑒于自然的土壤條件中有效磷水平往往較低[6]，因而在本研究中觀察到，相對于野生型，盆栽條件下，轉(zhuǎn)基因植株的生長受到了明顯的抑制。以上研究結(jié)果表明，EoNLA基因應(yīng)當(dāng)在植物體的磷素平衡調(diào)控中發(fā)揮著重要作用，但其相關(guān)的分子調(diào)控機(jī)制仍有待進(jìn)一步的研究。